Summary
Vi beskriver agar-kuler fremgangsmåte for å etablere vedvarende langvarig kronisk luftveisPseudoMonas aeruginosa-infeksjon i mus-modellen.
Abstract
En musemodell av kronisk luft infeksjon er et nøkkelfelt i cystisk fibrose (CF) forskning, men det er en rekke problemer vedrørende selve modellen. Tidlige fasene av inflammasjon og infeksjon har vært mye studert ved å bruke Pseudomonas aeruginosa agar-perler mus modell, mens bare noen få rapporter har fokusert på langvarig kronisk infeksjon in vivo. Hovedutfordringen for langsiktig kronisk infeksjon forblir lavt bakterie byrden ved P. aeruginosa, og den lave prosentandelen av infiserte mus uker etter utfordring, som indikerer at bakteriecellene blir progressivt fjernet av verten.
Dette papir presenterer en metode for å erholde effektiv langvarig kronisk infeksjon i mus. Denne metoden er basert på innstøping av P. aeruginosa kliniske stammer i agar-kuler in vitro, etterfulgt av intratrakeal instillasjon i C57Bl/6NCrl mus. Bilateral lungeinfeksjon er assosiert med sevtater målbare read-outs inkludert vekttap, dødelighet, kronisk infeksjon, og inflammatorisk respons. The P. aeruginosa RP73 klinisk belastningen ble foretrukket framfor den PAO1 referanselaboratorium belastning siden det resulterte i en relativt lavere dødelighet, mer alvorlige skader, og høyere kronisk infeksjon. P. aeruginosa kolonisering kan vedvare i lungen i over tre måneder. Murine lunge patologi minner om CF pasienter med avansert kronisk lungesykdom.
Denne murine modellen etterligner nærmest løpet av sykdom hos mennesker, og kan brukes både for undersøkelser av patogenesen, og for evaluering av nye behandlingsformer.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sykdom forårsaket av mutasjoner i cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) genet. Dette genet koder for et klorid-kanal uttrykt på membranen av de epiteliale celler. Bronchiectasis, slim plugging og parenchymal ødeleggelse forårsaket hovedsakelig av Pseudomonas aeruginosa infeksjoner gradvis føre til alvorlig lungesykdom og dødelighet i de fleste av CF pasienter en. Forståelse CF patogenesen og videreutvikling av nye behandlingsformer er avhengige av dyremodell med karakteristiske trekk ved CF. Flere mus, genetisk modifiserte for CFTR-genet, har blitt generert, men begrensninger i evnen til disse artene å rekapitulere CF-lignende lungesykdom og flere andre organ abnormaliteter sett i CF pasienter har blitt mye dokumentert 2.
Utvikling av infeksjon er en av de store utfordringene i CF dyremodell. De litteratur cltidlig antyder at en kronisk infeksjon som varer mer enn en måned kan oppnås bare dersom musene inokulert med bakterier innebygd i et immobiliseringsmiddel slik som agar, agarose, alginat eller tang 3-5. Disse immobilisering av agenter gi microaerobic / anaerobe forhold som gjør at bakterier å vokse i form av-mikro, på samme måte som veksten i slimet av CF-pasienter seks. Denne modellen for kronisk infeksjon fører til persistens av bakterier i lungene forårsaker luftveisinflammasjon og skade 7.. Imidlertid, avhengig av hvilken metode som brukes, bakteriestammen og dosen inokulert i lungene, kan prosentandelen av kronisk infiserte mus og bakteriemengde gjenvunnet i lungene ved ulike tidspunkt variere betraktelig. Spesielt den viktigste utfordringen for langvarig kronisk infeksjon forblir lavt bakterie byrden ved P. aeruginosa, og den lave prosentandelen av infiserte mus uker etter utfordring, som indikerer that bakterieceller blir progressivt fjernet av verten. Ved å velge P. aeruginosa RP73 klinisk belastningen fra en samling av CF isolerer åtte vi hell ervervet lav dødelighet, mer alvorlige skader, og høy andel av kronisk infeksjon med en stabil bakteriemengde opp til en måned i C57Bl/6NCrl mus.
Dette notatet beskriver metode for å bygge P. aeruginosa i agarkulene, vi har smittet mus ved intratrakeal drypping, målt bakteriemengde og cytokiner i lungene, samlet BAL væske og utført histologisk undersøkelse. Samlet sett vil dette protokollen hjelpe forskerne i å ta fundamentalt viktige spørsmål om patogenesen 8,9 og teste nye behandlingsformer mot P. aeruginosa kronisk infeksjon 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder Bakterier for kronisk infeksjon (tre og to dager før Mouse Challenge)
- Velg riktig P. aeruginosa stamme som skal testes.
- Vaksinere en loopful av P. aeruginosa fra en -80 ° C lagerkultur av en Trypticase Soy Agar (TSA) plate og inkuberes ved 37 ° C over natten.
- Plukk en enkelt koloni og inokuler i 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) i en 15 ml snap-lukket rør og inkuberes ved 37 ° C over natten i en risteinkubator ved 200 rpm.
2. Embedding Bakterier i agarkulene for kronisk infeksjon (en dag før infeksjon)
- Ta en liten alikvot av bakterie-kultur natten over, fortynnes 1:50 i fosfatbufret saltvann (PBS), og måle den optiske tetthet (OD) ved 600 nm.
- Fortynne natten bakteriekultur ved å legge to OD i en ny snap-avkortet rør som inneholder 20 ml frisk TSB.
- Inkuber ved 37 ° C i omtrent 3 -4 timer til log fase i en risteinkubator ved 200 rpm, inntil en total på 10 til 15 OD er nådd.
- I mellomtiden tilberede TSA, TSB fremstilt av 1,5% agar, autoklaven og ekvilibrere ved 50 ° C i et vannbad. Stabil 150 ml preautoclaved tung mineralolje i en Erlenmeyer-kolbe ved 50 ° C i et vannbad.
- Når P. aeruginosa når log-fasen, samle bakteriecellene ved sentrifugering ved 2700 xg i 15 min ved 4 ° C, og supernatanten kastes.
- Resuspender den bakterielle pellet i 1 ml steril PBS og vortex grundig for å resuspendere pelleten fullstendig.
- Bland 1 ml bakteriell suspensjon med 9 ml flytende TSA pre-ekvilibrert ved 50 ° C.
- Tilsett 10 ml TSA-P. aeruginosa blandingen til tung mineralolje (forvarmet ved 50 ° C) og umiddelbart omrør i 6 min ved romtemperatur. Omrøringen må produsere en synlig hvirvel i oljen.
- Avkjøl blandingen til 4 ° C, under omrøring ved den minste speed for 35 min (Figur 1).
- Hvil agar-kuler-olje-blandingen i is i ytterligere 20 min.
- Overfør agar-kuler i 50 ml Falcon-rør og sentrifuger ved 2700 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Nøyaktig fjerne mineralolje og vask med sterilt PBS seks ganger, som beskrevet i trinn 2.11. Etter tre vaskinger, kan kulene bli pelletert ved hjelp av gravitasjon i stedet for ved bruk av sentrifugen. Etter den siste vaskingen, resuspender agar-kuler i 20 til 30 ml PBS.
- Ta en porsjon av perlene (ca. 0,5 ml) og aseptisk homogenisere.
- Ta 100 ul av den homogeniserte perler og fortynnes i 900 mikroliter sterilt PBS. Serielt fortynne 01:10 ned til 10 -6.
- Plate seriell fortynning på TSA platene, inklusive ufortynnet prøve ned til 10 -6 og inkuberes platene ved 37 ° C.
- Mål diameteren perle ved hjelp av en invertert lysmikroskop i flere felt. Vulsten diameter må være mellom 100 til 200 mikrometer (
- Oppbevar perlene over natten ved 4 ° C.
Figur 1. Oversikt over agar-perler fremstilling og museinfeksjon. P. aeruginosa-celler ble resuspendert i 1 ml PBS og tilsatt til 9 ml flytende TSA (50 ° C). Denne blanding tilsettes til 150 ml tung mineralolje ved 50 ° C i en kolbe og omrørt ved høy hastighet i 6 minutter ved romtemperatur. Når kolben ble avkjølt til 4 ° C med en langsom omrøring i 35 min, størkner agar lage kuler, og bakterier som er tilstede i blandingen er innebygd i agarkulene. Detalj av en agar inneholdende perle bakterieceller er vist (A). Etter fjerning av mineraloljen med flere vaskinger ved hjelp av sterilt PBS, er agar-perler suspensjonen klar feller inokulasjon i lungene til mus etter en intratrakeal injeksjon (B). Klikk her for å se større bilde .
Tre. Mus Challenge med agar-perler
Etikk Uttalelse: Denne protokollen og eksperimentering følge retningslinjene fra dyr omsorg og etikk komité av San Raffaele Scientific Institute.
- Tell antall kolonidannende enheter (CFU) på TSA platene for å bestemme antall CFU / ml i agar-kuler suspensjon. Fortynn agar-perler med sterilt PBS til 2-4 x 10 7 cfu / ml for å oppnå en optimal inokulum av 1-2 x 10 6 i 50 pl.
- Anesthetize C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 uker gamle) hannmus med ketamin (50 mg / ml) og xylazin (5 mg / ml) i 0,9% NaCl administrert i et volum på 0,002 ml / g kroppsvekt ved intraperitoneal injeksjon.
MERK: Anestesi anses adequate når dyret holder seg fortsatt rolig, ikke svarer på ytre stimuli, og har konstant hjerte-og luftveis priser. - Plasser musen i liggende stilling. Desinfiser strøk av mus med 70% etanol.
- Eksponere trakea ved hjelp av en loddrett snitt i huden og intubere luftrøret med en steril, fleksibel 22 G 0.9 mm x 25 mm IV kateter, holde hensyn til å fjerne stylette mens de beveger seg nedover inn i luftrøret. Sett kateteret ikke er for dypt inn i luftrøret. Stopp før du når carina (bifurkasjon).
- Umiddelbart tar et volum på 50 pl agar perlesuspensjon av en 1 ml sprøyte, og feste den til kateteret. Trykk forsiktig på stempelet på sprøyten, slik at perlene bli implantert inn i lungene. Lukk snittet hjelp sutur klipp.
- Plasser dyret på en varmepute til den er helt våken.
4. Mus Evaluering
- Observer mus daglig for kliniske tegn inkludert pelskvalitet, holdning,ambulation, og væskebalansen. Monitor daglig kroppsvekt. Mus som mister ≥ 20% av kroppsvekten må avlives.
- Følg Point 5 for innsamling av bronchoalveolar lavage væske (BAL) og poeng 6 eller 7 for innsamling av lungene og analyse av total CFU, histologisk analyse, inflammatorisk respons i form av total-og differensialcelletall i BAL, cytokin analyse, og myeloperoksidase (MPO)-aktivitet.
5. BAL væskeansamling og analyse
- Avlive mus ved CO 2 innånding.
- Plasser musen i liggende stilling. Desinfiser strøk av mus med 70% etanol.
- Expose luftrøret og brystkassen etter et vertikalt kutt i huden. Expose lungene ved å kutte mellomgulvet.
- Sett inn en sutur tråden under luftrøret ved hjelp av pinsett og intubere luftrøret med en steril, fleksibel 22 g 0,9 mm x 25 mm IV kateter. Trekk de to endene av sutur tråden for å binde catheter til luftrøret og knute på tråden rundt luftrøret.
- Ta et volum på 1 ml i RPMI 1640 ved hjelp av en 1 ml sprøyte, og feste den til kateteret. Skyv stempelet på sprøyten å vaske lungene og umiddelbart gjenopprette væske, lagre den i en 15 ml tube.
MERK: Hvis cytokiner er å bli analysert, legge proteasehemmere til RPMI 1640. - Gjenta dette trinnet tre ganger med totalt 3 ml RPMI. Fra nå av lagre BAL lakk på isen. Gå til trinn 6 for innsamling og analyse av lungene.
MERK: Vær oppmerksom på at ikke all væsken vil bli hentet (2,8 ml maksimum). - For kvantifisering av bakterier tilstede i BAL fluid, prøve en liten alikvot (300 pl), serielt fortynnet 1:10 i sterilt PBS, platen på TSA plater og inkuberes ved 37 ° C over natten.
- Telle totale celler ved hjelp av et invertert lys optisk mikroskop fortynne en prøve av det BAL fluid 1:2 med Tuerk løsning i et Burker celletall kammeret.
- Sentrifuger remaining BAL fluid på 330 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Ta supernatanten for ELISA-analyse cytokin, lagring av det ved -80 ° C. Følg trinn 05.10 til 05.13 for differensialcelletall ved cytospin.
- Dersom pelleten er rød, lysere erytrocytter nytt oppslemme pelleten i 250-300 pl av RBC lysis buffer fortynnet 1:10 i ultra-rent destillert vann i 3 min. Nøytraliser med 2 ml PBS og sentrifugert ved 330 x g i 8 minutter ved 4 ° C.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i RPMI 10% føtalt bovint serum (FBS). Bruk et volum som vil gi en 6 x 10 celler / ml, basert på det totale celletall.
- Legg objektglass og filtre i hensiktsmessige spor i cytospin med papp filtrene som vender mot midten av cytospin. Pipetter 150 ul av hver prøve til de passende brønner av cytospin og sentrifuger i en cytocentrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Flekk slides ved Romanowsky farging ved hjelp av et kommersielt kit, i henhold til manufacturer instruksjoner og som beskrevet tidligere 12. Følg trinn 05.14 til 05.17 for MPO aktivitet analyse.
- Sentrifuger de resterende volum av BAL ved 380 xg i 5 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 250 pl av Hexadecyltrimethylammonium klorid 0,5% i ultra-rent destillert vann for å lysere cellene. Suspensjonen kan bli frosset ved -20 ° C i flere dager før analysen utføres.
- Sentrifuger ved 16000 x g i 30 min ved 4 ° C og bruk av supernatanten for å utføre MPO assay i 96-brønners plater, og legger til prøven i duplikat til hver brønn, og hvis det er nødvendig, også passende fortynninger av prøven.
- Legg til hver prøve i brønnene et likt volum av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) som et substrat for peroksydase. Tillat reaksjonen å finne sted i mørket i minst 5 minutter og inntil det ikke er noen ytterligere utvikling i fargen.
- Stopp reaksjonen ved tilsetning av 2 MH 2 SO 4 and måle OD ved 450 nm. OD verdien vil være direkte proporsjonal med peroksidase-aktivitet.
6. Måling av bakteriemengde i lunge og cytokin Analysis
- Umiddelbart etter BAL væskeansamling, avgifts lungene fra mus, skyll dem i sterile PBS, separate lapper, legg dem i en rundbunnet rør med 2 ml sterilt PBS og lagre på is.
MERK: Ved cytokiner som skal analyseres, tilsett proteaseinhibitorer i PBS til rørene. - Aseptisk homogen lungene, kan en liten alikvot (300 pl) fra homogenatet, serielt fortynnet 1:10 i PBS, platen på TSA plater og inkuberes ved 37 ° C over natten. Legg merke til at den totale luftbakteriemengden vil være summen av de CFUs funnet i BAL fluid og lunge.
- Sentrifuger de rester homogenatet ved 16.000 x g i 30 min ved 4 ° C. Ta supernatanten for ELISA cytokin analyse, og oppbevar ved -80 ° C.
7. Histologisk undersøkelse
<ol>Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når protokollen er gjort riktig, P. aeruginosa agar-kuler vil måle mellom 100 til 200 mikrometer, og kan observeres med en invertert lysmikroskop ved å pipettere et lite volum av agar-perler suspensjonen på et lysbilde. Enkelt bakterielle celler er synlige i agarkulene, som vist i detalj i figur 1.
Valget av P. aeruginosa stamme brukes i agar-kuler preparat er kritisk. Figur 2 og Tabell 1 viser data oppnådd ved å følge infeksjon i mus med P. aeruginosa PAO1 referanselaboratorium belastning i forhold til RP73 klinisk isolat. Dødelighet, observert i løpet av de første tre dagene av infeksjonen, er lav for begge stammer, men høyere for PAO1 (Tall 2A og 2B). Betydelige forskjeller når det gjelder andelen av kronisk infeksjon i de overlevende mus kan observeres mellom PAO1 og RP73 utfordret mus. While i 3 dager etter infeksjon, ble alle mus fortsatt infisert av både P. aeruginosa-stammer, etter dette punkt noen mus erte bakterier og andre utviklet en stabil kronisk infeksjon. Fra syv dager fremover andelen av kronisk infiserte mus holdt seg stabil fram til 28 dager for begge stammer. PAO1 fører til kronisk infeksjon hos en prosentandel av mus som varierte fra 20 til 27,8% (fig. 2A), mens det for RP73 andelen var 75 til 87,1% (fig. 2B), som indikerer at P. aeruginosa klinisk stammen var mer effektive i å etablere en kronisk infeksjon i forhold til PAO1 laboratoriestammen. Antall bakterier i 3 dager etter infeksjon var høyere for PAO1 (5 x 10 7 CFU / lunge) (figur 2C og tabell 1) sammenlignet med RP73 (1,3 x 10 6 CFU / lunge) (figur 2D), og fra 7 dager og utover, når kronisk infeksjon ble etablert, stabiliserer bakteriemengde på mellom 10 <sup> 4 og 10 5 CFU / lunge for begge stammer. Når kronisk infeksjon er etablert, blir antallet CFU / lunge ikke endrer seg vesentlig i løpet av en måned. Dessuten er den bakterielle belastningen i luftveiene hos mus utfordret lignende med forskjellige bakteriestammer 9,13.
Andre leser-outs, inkludert verts inflammatorisk respons og histopatologi, kan måles på ulike tidspunkter fra utfordringen. Figur 3 viser den inflammatoriske respons i form av leukocytt rekruttering i muse BAL væske 7 dager fra utfordringen med P. aeruginosa RP73 klinisk belastning innebygd i agar-perler. RP73-infiserte mus ble sammenlignet med ikke-infiserte mus. Differensialcelletall inkludert neutrofiler, makrofager og lymfocytter. Antallet av de totale celler, er betydelig høyere i RP73-infiserte mus sammenlignet med ikke-infiserte mus. Neutrofiler, spesielt, nesten fullstendig fraværende i BAL fluid fra ikke-infiserte mus, var den mest represented cellular type i RP73-infiserte mus, noe som indikerer en betydelig respons fra det medfødte immunsystemet til kronisk infeksjon.
Histopatologisk analyse av lungene fra mus, kronisk infisert med P. aeruginosa RP73, viser at infeksjonen er pluri-brennvidde. Figurene 4C og 4F viser en lapp som er mer involvert enn andre lapper som er upåvirket eller marginalt involvert (Tall 4B og 4E). Perler kan observeres i bronkial lumen og-mikro av bakteriecellene er synlige i kulene (figurene 4C og 4F). Lung histopatologien i de involverte av infeksjon områder viste inflammatoriske lesjoner i bronkiene og i lunge parenchyma. De bronkier ble fylt av en massiv nøytrofil betennelse omkring kulene, mens parenchyma ble infiltrert av makrofager, lymfocytter og noen neutrofiler. Histologi aven ikke-infiserte mus ble anvendt som en kontroll, både parenchyma og bronkier var klart fra inflammatoriske celler (figurene 4A og 4D).
Figur 2. Tidsforløpet for P. aeruginosa kronisk infeksjon med PAO1 referanse belastning og RP73 klinisk belastning. C57BL/6NCrl (20-22 g) hannmus ble smittet av intratrakeal injeksjon med 1 til 5 x 10 6 CFU av P. aeruginosa stamme PAO1 (A og C) eller RP73 (B og D) er innebygd i agar-kuler. For hver gang-punkt, histogrammer representerer den prosentvise dødelighet indusert av bakteriemi (rød) og overlevelse (grå), eller prosentandelen av dyr som erte infeksjonen (hvitt), og de i stand til å etablere en kronisk infeksjon (grønn) (A og B). Overlevende mus ble avlivet ved de angitte tidspunkter, og lungene ble høstet, homogenisert, og kultiveres TSA på platene for å bestemme det bakterielle belastning. Vekstkurvene av PAO1 og RP73 stammer i murine lungene blir vist (C og D). Dots representerer enkeltmålinger og vannrette linjer representerer medianverdier. Statistisk signifikans av Fisher test indikeres: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001. Klikk her for å se større bilde .
Tabell 1. Tidsforløpet for P. aeruginosakronisk infeksjon med PAO1 referanse belastning og RP73 klinisk belastning. Prosenter av dødelighet og av kronisk infeksjon i PAO1 og RP73-infiserte mus og antall CFUs per lunge (median) er vist. Verdiene er valgt 2-4 forskjellige eksperimenter. N, no. av samlet mus analyseres for hver betingelse. Statistisk signifikans av Fisher test indikeres: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Evaluering av betennelse i BAL væske etter syv dager med kronisk infeksjon med RP73 klinisk belastning. (A) Grafen viser innhold av totalleukocytter, nøytrofile granulocytter og monocytter / makrofager gjenfunnet i BAL væske av RP73 kronisk infiserte mus etter 7 dager fra utfordring i forhold til friske mus (kontroll). Gjennomsnittsverdier og SEM er representert. (B) I boksen under pilene viser nøytrofile og en makrofag som sett i en flekk på et lysbilde etter cytospin. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Hematoxylin og eosin farging av histologiske snitt av lungene etter 7 dagers kronisk infeksjon med RP73 klinisk belastning. Panelet viser hematoxylin og eosin farging av lunge seksjoner av ikke-infiserte mus (A og D), og hos mus utfored med agar-kuler innehold RP73 (B, C, E, F). Infeksjonen er pluri-fokal og generelt omfatter en eller flere lungelapper (C og F), mens de andre er upåvirket eller marginalt involvert (B og E). Pilene angir agarkulene deponert i bronkial lumen (b). Lines (A, B, C) 250 mikrometer;. Linjer (D, E, F) 100 mikrometer Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinn i P. aeruginosa-perler forberedelse og mus utfordring rapporteres nedenfor.
The P. aeruginosa stamme brukt for mus utfordring er kritisk. Dødelighet, kronisk infeksjon eller klaring kan variere betydelig avhengig av bakteriestammen som brukes for utfordringen. The P. aeruginosa RP73 kliniske belastningen ble foretrukket framfor den PAO1 referanselaboratorium belastning siden det resulterte i en relativt lavere dødelighet, mer alvorlige skader, og høyere kronisk infeksjon. Drug testing i prekliniske studier bør utføres med P. aeruginosa stammer valgt for sin høye effektivitet i å etablere langvarig kronisk infeksjon. Dette minimerer antall mus som er i tråd med kravene til vitenskapelig validering og statistisk analyse 10,11.
Den enkelte P. aeruginosa-agar-bead preparater varierer i størrelse og i CFU / ml. En average diameter på 150 mikrometer med 2 x 10 7 cfu / ml er ansett som optimal. Perlestørrelse er påvirket av omrøringshastigheten under avkjølingsfasen (trinn 2.9). Perler rørt ved toppfart er små og sfærisk (<50 mikrometer), mens de som rørte veldig sakte er store og amorf (> 1 mm). I tillegg, når den endelige fortynning for utfordringen er forberedt, kan perler med et lavt bakterietall være klebrige, mens de med høy bakteriemengde kan være overdrevet fortynnet. Inokulering av mus med klebrige perler er forbundet med høy dødelighet på grunn av mus som choking snart etter utfordring, mens overdrevet fortynnede perler kan resultere i et fravær av kronisk infeksjon. Den optimale volum av intratrakeal injeksjon er 50 ul, men større mengder opp til 100 pl kan inokuleres. Forskjeller i dødelighet eller kronisk infeksjon av mus er sjelden observert når inokulert dose varierer mellom 5 x 10 6 x 10 5 og 5 CFU / mus.
Appropriate bakterievekstmedium må brukes for agarkulene formasjonen. I dette tilfellet, P. aeruginosa ble innebygd i TSA, andre papirer rapportert at, Burkholderia cenocepacia ble inkludert i næringsmedium agar 14,15. Agarkulene bør gi en microanaerobic miljø med essensielle næringsstoffer tilgjengelig for bakteriell spredning fra enkeltceller til-mikro ni.
Åndedretts innsats varierer avhengig av bedøvelse og dosen som brukes, og påvirker dødelighet etter operasjonen. Ketamin ved en dose på 0,1 mg / g kroppsvekt andxylazine i en dose på 0,01 mg / g kroppsvekt er det optimale valg. Respirasjon er normalt når mus intubert med kateteret og synlig grunnere når mus inokulert med P. aeruginosa agar-perler. Ideelt sett injeksjon av P. aeruginosa agar-kuler bør foretas langsomt med en optimal volum på 50 pl. Høyere volumer på opptil 100 mL kan resultere i høyere dødelighetog større vanskeligheter med mus restitusjon. Alle musene er tilstrekkelig smittet når utfordret av intratrakeal kirurgi.
The P. aeruginosa RP73 agar perle-indusert kronisk lungebetennelse indikerer at i denne modellen infeksjonen er pluri-brennvidde og generelt innebærer en eller flere lungelapper uten at det går hele lungen. Følgelig må evaluering av bakteriemengde og betennelsesreaksjon utføres på total lunge. Analysen av selektive fliker produserer ikke gyldige resultater. En gruppe mus uinfisert bør tilsettes som en kontroll, og sammenlignet med infiserte mus for å påvise en eventuell unormalitet i cellerekruttering i BAL fluid, eller ved histologi i lungene på grunn av forurensninger, eller feil i fremgangsmåten. Denne modellen ble etablert i en BSL-2 laboratorium med bør trenes alle laboratoriepersonell i de nødvendige ferdigheter for mus observasjon. Musene ble overvåket to ganger per dag for følgende parametere: bustepels, holdning, Bevegelse, pust, nysgjerrighet, nasal sekresjon, stell og dehydrering. Mus som tapte ≥ 20% av kroppsvekten, og viste tegn på alvorlig klinisk sykdom, som for eksempel rufsete pels, inaktivitet, tap av matlyst, dårlig bevegelse, eller smertefull holdning, ble avlivet før avslutning av forsøket. Mus infisert med P. aeruginosa RP73 agar-perler viste lavere tegn til ubehag innen tre dager fra smitte i forhold til PAO1-infiserte mus. Etter dette tidspunkt noen mus ryddet bakterier og andre utviklet en stabil kronisk infeksjon, som varer opp til 28 dager.
Vi viste at modellen av kronisk infeksjon vi foreslår i denne utredningen er i stand til å indusere en stabil P. aeruginosa kronisk infeksjon i mus. Denne metoden har blitt optimalisert for å studere de molekylære mekanismene bak patogenet virulens og vert forsvar 8,9,16 eller for narkotikatesting av antibakterielle og anti-inflammatoriske molekyler 10,11. Than preklinisk validering av disse forbindelsene i egnede dyremodeller er avgjørende for fremtidige terapeutiske intervensjoner for lungeinfeksjoner hos pasienter med CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forskning i Bragonzi laboratorium har vært finansiert av det italienske Cystisk fibrose Foundation (CFaCore) og EU-F7-2009-223670. En del av dette arbeidet ble utført i Alembic, en avansert mikroskopi laboratorium og mus histopatologi ble utført i Enhet for patologisk anatomi (San Raffaele Scientific Institute).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
