Summary
نحن تصف طريقة أجار حبات لإقامة عدوى مجرى الهواء المستمر على المدى الطويل المزمن الزائفة الزنجارية في نموذج الفأر.
Abstract
نموذج الفأر من عدوى المسالك الهوائية المزمن هو أحد الأصول الرئيسية في التليف الكيسي (CF) البحوث، وعلى الرغم من أن هناك عدد من المخاوف بشأن النموذج نفسه. المراحل المبكرة من الالتهاب والعدوى وقد تم دراسة على نطاق واسع باستخدام الزائفة الزنجارية نموذج أجار الخرز الماوس، في حين ركزت تقارير قليلة فقط على العدوى المزمنة على المدى الطويل في الجسم الحي. يبقى التحدي الرئيسي لعدوى مزمنة على المدى الطويل عبء البكتيرية منخفضة من قبل P. الزنجارية ونسبة منخفضة من الفئران المصابة أسابيع بعد التحدي، مشيرا إلى أن الخلايا البكتيرية يتم مسح تدريجيا من قبل المضيف.
تعرض هذه الورقة طريقة للحصول على كفاءة عدوى مزمنة طويلة الأجل في الفئران. ويستند هذا الأسلوب على التضمين من P. الزنجارية سلالات السريرية في حبات أجار في المختبر، تليها التقطير داخل القصبة الهوائية في الفئران C57Bl/6NCrl. ويرتبط التهاب في الرئتين الثنائية مع بغازياألطراف قابلة للقياس للقراءة عموميات بما في ذلك فقدان الوزن، وفيات، والعدوى المزمنة، والاستجابة للالتهابات. وP. كان يفضل الزنجارية RP73 سلالة السريرية على مدى سلالة المختبر المرجعي PAO1 لأنه أدى إلى وفيات أقل نسبيا، أشد الآفات، والعدوى المزمنة أعلى. P. قد تستمر الزنجارية الاستعمار في الرئة لأكثر من ثلاثة أشهر. الفئران أمراض الرئة يشبه ذلك من مرضى التليف الكيسي يعانون من أمراض رئوية مزمنة متقدمة.
هذا نموذج الفئران يحاكي معظم كثب مسار المرض الإنسان، ويمكن استخدامها على حد سواء لدراسات عن المرضية وتقييم علاجات جديدة.
Introduction
التليف الكيسي (CF) هو مرض وراثي التي تسببها طفرات في التليف الكيسي عبر الغشاء تصرف منظم (CFTR) الجينات. هذا الجين يشفر لقناة كلوريد أعرب على الغشاء معظم الخلايا الظهارية. تسبب توسع القصبات، يسد المخاط ومتني الدمار أساسا من التهابات الزائفة الزنجارية يؤدي تدريجيا إلى أمراض الرئة الحادة والوفيات في معظم المرضى CF 1. فهم المرضية CF ومزيد من علاجات جديدة تعتمد على تطوير نموذج حيواني مع السمات المميزة لCF. العديد من الفئران، المعدلة وراثيا لهذا الجين CFTR، تم إنشاؤه لكن القيود في قدرة تلك الأنواع ألخص بأمراض الرئة CF-مثل وعدة تشوهات الجهاز التي شوهدت في مرضى التليف الكيسي قد تم توثيقها على نطاق واسع 2.
تطوير عدوى هي واحدة من التحديات الرئيسية في نموذج حيواني CF. على البنود الأدبيقترح في وقت مبكر أن عدوى مزمنة دائم أكثر من شهر واحد يمكن أن يتحقق إلا إذا تم تلقيح الفئران مع البكتيريا جزءا لا يتجزأ من وكيل شل حركة مثل أجار، الاغاروز، أو الأعشاب البحرية الجينات 3-5. توفر هذه العوامل شل حركة الشروط microaerobic / اللاهوائية التي تسمح للبكتيريا أن تنمو في شكل microcolonies، على غرار النمو في المخاط من المرضى CF 6. هذا النموذج من عدوى مزمنة تؤدي إلى استمرار البكتيريا في الرئتين تسبب التهاب الشعب الهوائية والأضرار 7. ومع ذلك، اعتمادا على الطريقة المستخدمة، السلالة البكتيرية وجرعة تلقيح في الرئتين، فإن النسبة المئوية من الفئران المصابة المزمن والحمل البكتيري تعافى في الرئتين عند نقاط زمنية مختلفة يمكن أن تختلف إلى حد كبير. على وجه الخصوص، لا يزال التحدي الرئيسي للعدوى مزمنة طويلة الأجل عبء البكتيرية منخفضة من قبل P. الزنجارية ونسبة منخفضة من الفئران المصابة أسابيع بعد التحدي، مشيرا ثايتم مسح الخلايا البكتيرية ر تدريجي من قبل المضيف. عن طريق تحديد P. الزنجارية RP73 سلالة السريرية من مجموعة من CF يعزل 8 حصلنا عليها بنجاح وفيات منخفض، والآفات أكثر حدة، ونسبة عالية من العدوى المزمنة مع الحمولة الجرثومية مستقرة تصل إلى شهر واحد في الفئران C57Bl/6NCrl.
تفاصيل هذه الورقة منهجية لتضمين P. الزنجارية في حبات أجار، ولدينا إصابة الفئران عن طريق التقطير داخل القصبة الهوائية، ويقاس الحمل والسيتوكينات البكتيرية في الرئتين، وجمع السائل BAL وأجرى الفحص النسيجي. عموما، فإن هذا البروتوكول مساعدة الباحثين في معالجة المسائل الهامة أساسا على 8،9 المرضية واختبار علاجات جديدة ضد P. الزنجارية عدوى مزمنة 10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد البكتيريا لعدوى المزمنة (ثلاث وقبل يومين من تحدي ماوس)
- حدد P. المناسبة سلالة الزنجارية لفحصها.
- تطعيم لملء غانة من P. الزنجارية من -80 ° C ثقافة الأسهم إلى Trypticase الصويا آجار (TSA) لوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- اختيار مستعمرة واحدة وتطعيم في 5 مل مرق الصويا Trypticase (TSB) في 15 مل توج الإضافية أنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
2. التضمين البكتيريا في آجار الخرز للعدوى المزمنة (يوم واحد قبل الإصابة)
- اتخاذ قسامة صغيرة من الثقافة بين عشية وضحاها البكتيرية، وتمييع 01:50 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وقياس الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر.
- تمييع ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها عن طريق إضافة 2 OD في أنبوب المغطاة المفاجئة جديدة تحتوي على 20 مل من TSB الطازجة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 3 -4 ساعة إلى مرحلة تسجيل في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة، حتى يتم التوصل إلى ما مجموعه 10-15 OD.
- في هذه الأثناء، وإعداد TSA، مصنوعة من TSB مع 1.5٪ أجار، الأوتوكلاف وتتوازن في 50 درجة مئوية في حمام مائي. تتوازن 150 مل من الزيوت المعدنية الثقيلة preautoclaved في دورق مخروطي عند 50 درجة مئوية في حمام مائي.
- مرة واحدة P. الزنجارية تصل إلى مرحلة السجل، وجمع الخلايا البكتيرية بواسطة الطرد المركزي في 2،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
- resuspend الكرية الجرثومي في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة ودوامة بدقة لresuspend الكرية تماما.
- مزيج 1 مل تعليق البكتيرية مع 9 مل من السائل TSA قبل معايرتها عند 50 درجة مئوية.
- إضافة 10 مل TSA-P. الزنجارية الخليط إلى الزيوت المعدنية الثقيلة (prewarmed عند 50 درجة مئوية) وعلى الفور تحرك المكونات لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. التحريض يجب أن تنتج دوامة مرئية في النفط.
- يبرد الخليط إلى 4 درجات مئوية، واثارة في الحد الأدنى ليرة سوريةعيد لمدة 35 دقيقة (الشكل 1).
- ضع الخليط حبات أجار للنفط في الجليد لمدة 20 دقيقة إضافية.
- نقل الخرز أجار في 50 مل أنابيب فالكون وأجهزة الطرد المركزي في 2،700 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- بدقة إزالة الزيوت المعدنية ويغسل مع برنامج تلفزيوني العقيمة ست مرات، كما هو موضح في الخطوة 2.11. بعد ثلاث غسلات، وحبات يمكن مكعبات عن طريق الجاذبية بدلا من استخدام أجهزة الطرد المركزي. بعد غسل الماضي، resuspend والخرز أجار في 20-30 مل PBS.
- اتخاذ قسامة من الخرز (حوالي 0.5 مل) والتجانس جو معقم و مطهر.
- تأخذ 100 ميكرولتر من الخرز المتجانس وتمييع في 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. متسلسل تمييع 01:10 صولا الى 10 -6.
- لوحة التخفيف المسلسل على لوحات TSA، بما في ذلك عينة غير مخفف وصولا الى 10 -6 واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية.
- قياس قطر حبة باستخدام مجهر الضوء المعكوس في العديد من المجالات. يجب أن يكون قطرها بين 100-200 ميكرون حبة (
- تخزين حبات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
الشكل 1. نظرة عامة على إعداد الخرز والفأر العدوى أجار. P. ومعلق الخلايا الزنجارية في 1 مل من برنامج تلفزيوني، وأضاف إلى 9 مل من السائل TSA (50 درجة مئوية). يضاف هذا الخليط إلى 150 مل الزيوت المعدنية الثقيلة عند 50 درجة مئوية في قارورة وأثار بسرعة عالية لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما يتم تبريد القارورة إلى 4 درجة مئوية مع التحريك البطيء لمدة 35 دقيقة، وأجار يتصلب خلق الخرز، وجزءا لا يتجزأ من البكتيريا الموجودة في الخليط في حبات أجار. يتم عرض التفاصيل من حبة أجار التي تحتوي على الخلايا البكتيرية (A). بعد إزالة الزيوت المعدنية مع العديد من يغسل باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة، وحبات أجار التعليق جاهز وأو التلقيح في الرئتين من الفئران عن طريق الحقن داخل الرغامى (B). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
3. الفئران التحدي مع آجار الخرز
بيان الأخلاق: هذا البروتوكول والتجريب اتباع المبادئ التوجيهية من لجنة رعاية الحيوان وأخلاقيات معهد سان رافاييل العلمي.
- حساب عدد وحدات تشكيل مستعمرة (كفو) على لوحات TSA لتحديد عدد من كفو / مل في حبات أجار التعليق. تمييع الخرز أجار مع برنامج تلفزيوني العقيمة إلى 2-4 × 10 7 كفو / مل للتوصل إلى اللقاح الأمثل لل1-2 × 10 6 في 50 ميكرولتر.
- تخدير C57Bl/6NCr (20-22 غرام، 6-8 أسابيع من العمر) ذكور الفئران مع الكيتامين (50 ملغ / مل) وزيلازين (5 ملغ / مل) في 0.9٪ كلوريد الصوديوم تدار في وبلغ حجم التداول 0.002 مل / غرام من وزن الجسم عن طريق حقن داخل الصفاق.
يعتبر التخدير adeq ملاحظة:uate عندما يبقى تزال بهدوء الحيوان، لا يستجيب للمؤثرات الخارجية، ولديه قلب المستمر ومعدلات التنفس. - ضع الماوس في موقف ضعيف. تطهير معطف من الفأر مع الايثانول 70٪.
- فضح القصبة الهوائية عن طريق قطع رأسي من الجلد والتنبيب الرغامي مع العقيمة ومرنة 22 G 0.9 مم × 25 مم الرابع القسطرة، وحفظ الانتباه إلى إزالة stylette في الوقت الذي يتجه إلى أسفل داخل القصبة الهوائية. إدراج القسطرة ليست عميقة جدا في القصبة الهوائية. وقف قبل الوصول إلى كارينا (التشعب).
- تتخذ على الفور وبلغ حجم التداول 50 ميكرولتر من أجار حبة التعليق من حقنة 1 مل وإرفاقه القسطرة. دفع برفق على المكبس من المحاقن، والسماح حبات ليتم زرعها في الرئة. إغلاق شق باستخدام مقاطع خياطة.
- وضع الحيوان على وسادة التدفئة حتى مستيقظا تماما.
4. تقييم الفئران
- مراقبة الفئران يوميا بحثا عن علامات السريرية بما في ذلك جودة معطف، والموقف،التمشي، ووضع الماء. مراقبة وزن الجسم يوميا. يجب أن يتم التخلص الفئران التي تفقد ≥ 20٪ من وزن الجسم.
- اتبع النقطة 5 لجمع السائل غسل القصبات (BAL) والنقاط 6 أو 7 لجمع الرئتين والتحليل من الكل كفو، التحليل النسيجي، استجابة التهابية من حيث عدد خلايا الكلية والفرق في بال، وتحليل خلوى، و الميلوبيروكسيداز (MPO) النشاط.
5. BAL السوائل جمع وتحليل
- الموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون 2.
- ضع الماوس في موقف ضعيف. تطهير معطف من الفأر مع الايثانول 70٪.
- فضح القصبة الهوائية والقفص الصدري من قبل قطع رأسي من الجلد. فضح الرئتين عن طريق خفض الحجاب الحاجز.
- إدراج خيوط الجروح تحت القصبة الهوائية باستخدام الملقط والتنبيب الرغامي مع العقيمة ومرنة 22 غ 0.9 مم × 25 مم رابعا القسطرة. سحب طرفي الخيط خياطة لربط كاليفورنياtheter إلى القصبة الهوائية وعقدة الخيط حول القصبة الهوائية.
- تأخذ حجم 1 مل من 1640 RPMI باستخدام حقنة 1 مل وإرفاقه القسطرة. دفع المكبس من المحاقن لغسل الرئتين وعلى الفور استرداد السائل، تخزينه في أنبوب 15 مل.
ملاحظة: إذا السيتوكينات هي ليتم تحليلها، إضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني RPMI 1640. - كرر هذه الخطوة ثلاث مرات مع ما مجموعه 3 مل من RPMI. من الآن فصاعدا، تخزين السوائل BAL على الجليد. انتقل إلى الخطوة 6 لجمع وتحليل الرئتين.
ملاحظة: يرجى ملاحظة أنه ليس كل من السائل سيتم استرجاع (2.8 مل كحد أقصى). - لتقدير حجم البكتيريا الموجودة في السائل BAL، عينة صغيرة قسامة (300 ميكرولتر)، وتمييع متسلسل 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة، لوحة على لوحات TSA واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- الاعتماد الكلي الخلايا باستخدام المجهر الضوئي مقلوب ضوء تمييع قسامة من السوائل BAL 01:02 بمحلول تويرك في غرفة Burker عدد خلايا.
- أجهزة الطرد المركزي صemaining السوائل BAL في 330 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. اتخاذ طاف للتحليل ELISA خلوى، تخزينها في -80 درجة مئوية. اتبع الخطوات 5،10-5،13 لعدد خلايا التفاضلية بواسطة cytospin.
- إذا كان بيليه هو أحمر، ليز الكريات الحمراء إعادة التعليق على بيليه في 250-300 ميكرولتر من العازلة تحلل RBC المخفف 01:10 في الماء المقطر نقي للغاية لمدة 3 دقائق. تحييد مع 2 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 330 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه في RPMI 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). استخدام وحدة تخزين التي سوف نوفر 1 × 10 6 خلية / مل، على أساس عدد خلايا الكلي.
- وضع الشرائح المجهر والمرشحات في فتحات مناسبة في cytospin مع مرشحات من الورق المقوى التي تواجه وسط cytospin. ماصة 150 ميكرولتر من كل عينة في آبار مناسبة للcytospin وأجهزة الطرد المركزي في cytocentrifuge في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار الشرائح بواسطة Romanowsky تلطيخ استخدام عدة التجارية، وفقا لأماهتعليمات nufacturer وكما هو موضح سابقا 12. اتبع الخطوات 5،14-5،17 لMPO تحليل النشاط.
- أجهزة الطرد المركزي لحجم ما تبقى من BAL في 380 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 250 ميكرولتر من Hexadecyltrimethylammonium كلوريد 0.5٪ في ماء مقطر نقي للغاية لليز الخلايا. تعليق يمكن تجميد في -20 درجة مئوية لعدة أيام قبل إجراء الفحص.
- أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، واستخدام طاف لتنفيذ الخطة الرئيسية للعمليات فحص في لوحات 96 بشكل جيد، مضيفا العينة في مكررة إلى كل بئر وإذا لزم الأمر، كما التخفيفات المناسبة من العينة.
- إضافة إلى كل عينة في آبار حجم مساو من 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) باعتبارها الركيزة لالبيروكسيديز. السماح للتفاعل عقده في الظلام لمدة 5 دقائق على الأقل وحتى لا يوجد مزيد من التطوير في اللون.
- وقف رد الفعل بإضافة 2 MH 2 SO 4 والثانية قياس OD في 450 نانومتر. وسوف تكون قيمة OD يتناسب طرديا مع النشاط البيروكسيديز.
6. قياس الحمولة الجرثومية في الرئة وتحليل خلوى
- مباشرة بعد جمع السائل BAL والمكوس الرئتين من الماوس، شطف لهم في برنامج تلفزيوني العقيمة، فصوص منفصلة، ووضعها في أنبوب جولة القاع مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وتخزينها على الجليد.
ملاحظة: إذا السيتوكينات هي ليتم تحليلها، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني لبرنامج تلفزيوني للأنابيب. - جو معقم و مطهر التجانس الرئتين، واتخاذ قسامة صغيرة (300 ميكرولتر) من جناسة، وتمييع متسلسل 01:10 في برنامج تلفزيوني، لوحة على لوحات TSA واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. يرجى ملاحظة أن إجمالي حمولة الهوائية البكتيرية سيكون مجموع CFUs جدت في السائل BAL والرئة.
- أجهزة الطرد المركزي لجناسة المتبقية في 16،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. اتخاذ طاف للتحليل ELISA خلوى، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
7. الفحص النسيجي
<رأ>Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما يتم البروتوكول بشكل صحيح، P. سوف الزنجارية أجار حبات قياس بين 100-200 ميكرون ويمكن ملاحظتها مع ضوء المجهر المقلوب من قبل pipetting كمية صغيرة من حبات أجار التعليق على شريحة. الخلايا البكتيرية واحدة واضحة في حبات أجار، كما هو مبين بالتفصيل في الشكل 1.
اختيار P. سلالة الزنجارية المستخدمة في إعداد أجار الخرز أمر بالغ الأهمية. الشكل 2 والجدول 1 تشير البيانات التي تم الحصول عليها في أعقاب إصابة الفئران مع P. الزنجارية PAO1 مرجعية سلالة المختبر بالمقارنة مع RP73 عزل السريرية. وفيات، لاحظ في أول 3 أيام من العدوى، منخفضة لكل من السلالات، ولكن أعلى لPAO1 (أرقام 2A و 2B). ويمكن ملاحظة اختلافات كبيرة من حيث نسبة الإصابة المزمنة في الفئران على قيد الحياة بين PAO1 وRP73 الفئران تحدى. حين إلىه في 3 أيام بعد الإصابة، وجميع الفئران المصابة تزال من قبل كل من P. سلالات الزنجارية، وبعد هذا الوقت نقطة مسح بعض الفئران البكتيريا ووضع غيرها عدوى مزمنة مستقرة. من 7 أيام فصاعدا نسبة الفئران المصابة بشكل مزمن، ظلت مستقرة تصل إلى 28 يوما لكلا من السلالات. PAO1 يؤدي إلى عدوى مزمنة في مئوية من الفئران التي تراوحت بين 20 حتي 27،8٪ (الشكل 2A)، في حين كانت نسبة RP73 75-87،1٪ (الشكل 2B)، مشيرا إلى أن P. كان الزنجارية سلالة السريرية أكثر كفاءة في إنشاء عدوى مزمنة مقارنة سلالة المختبر PAO1. وكانت أعداد البكتيريا في 3 أيام بعد الإصابة أعلى لPAO1 (5 × 10 7 كفو / الرئة) (الشكل 2C والجدول 1) مقارنة RP73 (1.3 × 10 6 كفو / الرئة) (الشكل 2D)، ثم من 7 أيام فصاعدا، عندما أنشئت عدوى مزمنة، وتستقر الحمولة الجرثومية في ما بين 10 <sup> في 4 و 10 5 كفو / الرئة لكلا السلالات. بمجرد ثبوت العدوى المزمنة، لا يغير من عدد من كفو / رئة بشكل ملحوظ خلال شهر واحد. علاوة على ذلك، فإن الحمل البكتيري في الشعب الهوائية مشابه بين الفئران تحدى مع السلالات البكتيرية المختلفة 9،13.
قراءة أخرى الرافضة، بما في ذلك المضيف الاستجابة الالتهابية وأمراض الأنسجة، ويمكن قياس مختلفة في الوقت نقطة من التحدي. الشكل 3 يبين استجابة التهابية من حيث التوظيف الكريات البيض في السائل BAL الماوس 7 أيام من التحدي مع P. الزنجارية RP73 سلالة السريرية جزءا لا يتجزأ من أجار الخرز. تمت مقارنة الفئران المصابة RP73 على الفئران غير المصابة. شملت عدد خلايا العدلات التفاضلي، الضامة، والخلايا الليمفاوية. من إجمالي عدد الخلايا هو أعلى بكثير لدى الفئران المصابة RP73 مقارنة مع الفئران غير المصابة. العدلات، على وجه الخصوص، تقريبا غائبة تماما في السائل BAL من الفئران المصابة لا، كانت معظم represented نوع الخلوية في الفئران المصابة RP73، مما يدل على استجابة كبيرة من قبل النظام المناعي الفطري للإصابة مزمنة.
تحليل الأنسجة من الرئتين من الفئران، بالعدوى بشكل مزمن مع P. الزنجارية RP73، يدل على أن العدوى هو التعدد البؤرية. أرقام 4C و4F تظهر الفص واحد هو أن أكثر انخراطا من الفصوص الأخرى التي تتأثر أو تشارك بشكل هامشي (أرقام 4B و 4E). ويمكن ملاحظة الخرز في التجويف الشعب الهوائية وmicrocolonies من الخلايا البكتيرية واضحة في حبات (أرقام 4C و4F). وأظهر التشريح المرضي الرئة في المناطق المعنية عن طريق العدوى الآفات الالتهابية في شعب هوائية وفي لحمة الرئة. امتلأت شعب هوائية من قبل التهاب العدلة الضخمة المحيطة الخرز، في حين كانت مخترقة من قبل لحمة الضامة، الخلايا الليمفاوية وبعض العدلات. الأنسجة منتم استخدام الماوس المعافين كعنصر تحكم، وكانت كل من وحمة شعب هوائية واضحة من الخلايا الالتهابية (أرقام 4A و 4D).
الشكل 2. بالطبع وقت P. العدوى الزنجارية المزمنة مع PAO1 سلالة المرجعية وRP73 سلالة السريرية. C57BL/6NCrl (20-22 ز) كانت مصابة ذكور الفئران عن طريق الحقن داخل القصبة الهوائية مع 1-5 × 10 6 كفو من P. الزنجارية سلالة PAO1 (A و C) أو RP73 (B و D) جزءا لا يتجزأ من أجار الخرز. لكل نقطة في الوقت، رسوم بيانية تمثل نسبة الوفيات الناجمة عن تجرثم الدم (الحمراء)، والبقاء على قيد الحياة (الرمادي) أو النسبة المئوية من الحيوانات التي مسح العدوى (أبيض) والقادرين على إنشاء عدوى مزمنة (الأخضر) (A و B). الموت الرحيم كانت الفئران على قيد الحياة في الوقت المشار إليه نقاط، وكانت تحصد الرئتين، المتجانس، ومثقف على لوحات TSA لتحديد الحمولة الجرثومية. وتظهر منحنيات نمو سلالات PAO1 وRP73 في الرئتين الفئران (C و D). تمثل النقاط القياسات الفردية وخطوط أفقية تمثل القيم الوسيطة. يشار دلالة إحصائية بواسطة اختبار فيشر: * ع <0.05، ** ع <0.01 ***، ع <0.001. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الجدول 1. بالطبع وقت P. الزنجاريةعدوى مزمنة مع PAO1 سلالة المرجعية وRP73 سلالة السريرية. وتظهر النسب المئوية للوفيات والإصابة المزمنة من PAO1 وRP73 الفئران المصابة وعدد من CFUs في الرئة (الوسيط). ويتم اختيار القيم 2-4 تجارب مختلفة. ن، لا. من الفئران المجمعة تحليل لكل حالة. يشار دلالة إحصائية بواسطة اختبار فيشر: * ع <0.05، ** ع <0.01 ***، ع <0.001. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. تقييم التهاب في السائل BAL بعد 7 أيام من العدوى المزمنة مع RP73 سلالة السريرية. (A) ويبين الرسم البياني المحتوى من الكلالكريات البيض، العدلات وحيدات / الضامة تعافى في السائل BAL من الفئران المصابة RP73 مزمنة بعد 7 أيام من التحدي بالمقارنة مع الفئران غير المصابة (مراقبة). يتم تمثيل القيم المتوسطة ووزارة شؤون المرأة. (ب) في المربع أدناه تبين الأسهم العدلات والبلاعم كما رأينا في بقعة على الشريحة بعد cytospin. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ على المقاطع النسيجية من الرئتين بعد 7 أيام من العدوى المزمنة مع RP73 سلالة السريرية. تظهر لوحة الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ أقسام الرئة لدى الفئران غير المصابة (A و D) والفئران حتدياإد مع أجار حبات تحتوي على RP73 (B، C، E، F). العدوى هو التعدد البؤرية وينطوي عموما واحدا أو أكثر من فصوص الرئة (C و F)، في حين أن البعض الآخر لم يتأثر أو تشارك بشكل هامشي (B و E). السهام تشير الخرز أجار المودعة في الشعب الهوائية التجويف (ب). خطوط (A، B، C) 250 ميكرومتر؛ خطوط (D، E، F) 100 ميكرون اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في P. وذكرت الزنجارية حبات إعداد والتحدي الماوس أدناه.
سلالة الزنجارية P. المستخدمة للفئران التحدي أمر بالغ الأهمية. الوفيات، عدوى مزمنة أو التخليص ربما تختلف اختلافا كبيرا تبعا لإجهاد البكتيريا تستخدم للتحدي. وP. كان يفضل الزنجارية RP73 سلالة السريرية على مدى سلالة المختبر المرجعي PAO1 لأنه أدى إلى وفيات أقل نسبيا، أشد الآفات، والعدوى المزمنة أعلى. يجب أن يتم تنفيذ اختبار المخدرات في الدراسات قبل السريرية مع P. سلالات الزنجارية التي اختيرت لكفاءتها العالية في إنشاء العدوى المزمنة على المدى الطويل. هذا يقلل من عدد من الفئران التي تنسجم مع متطلبات التحقق العلمي والتحليل الإحصائي 10،11.
الفرد P. الزنجارية الاستعدادات أجار حبة تختلف في الحجم وكفو / مل. وعلىوتعتبر قطر من 150 ميكرون verage مع 2 × 10 7 كفو / مل الأمثل. يتأثر حجم حبة بمعدل التحريك أثناء مرحلة التبريد (الخطوة 2.9). حبات أثار في سرعة قصوى صغيرة وكروية (<50 ميكرون)، في حين أثارت تلك هي ببطء شديد كبيرة وغير متبلور (> 1 مم). علاوة على ذلك، عندما التخفيف النهائية لالتحدي مستعدة، والخرز مع الحمولة الجرثومية المنخفضة يمكن أن تكون لزجة في حين أن أولئك مع ارتفاع الحمولة الجرثومية يمكن أن تضعف بشكل مفرط. ويرتبط تلقيح الفئران مع حبات لزجة مع ارتفاع معدل الوفيات بسبب الاختناق الفئران قريبا بعد التحدي، في حين حبات المخفف بشكل مفرط قد يؤدي إلى عدم وجود عدوى مزمنة. حجم الأمثل للحقن داخل الرغامى هو 50 ميكرولتر لكن أحجام التداول أعلى تصل إلى 100 ميكرولتر يمكن تلقيح. ونادرا ما يتم ملاحظة وجود اختلافات في وفيات أو عدوى مزمنة من الفئران عندما تتراوح الجرعة ما بين 5 تلقيح × 10 5 و 5 × 10 6 كفو / الماوس.
Appropriatه يجب أن تستخدم البكتيرية المتوسطة النمو لتشكيل حبات أجار. في هذا المثال، P. كان جزءا لا يتجزأ الزنجارية في TSA؛ ذكرت صحف أخرى أن بيركولديريا cenocepacia أدرج في المغذيات أجار مرق 14،15. يجب الخرز أجار توفير بيئة microanaerobic مع المواد الغذائية الأساسية متوفرة لتكاثر الجراثيم من الخلايا واحد لmicrocolonies 9.
جهد الجهاز التنفسي تختلف تبعا لجرعة مخدر واستخدامها، ويؤثر على الوفيات بعد الجراحة. الكيتامين بجرعة 0.1 ملغ / غ وزن الجسم andxylazine بجرعة 0.01 ملغ / غرام من وزن الجسم هي الخيارات المثلى. التنفس الطبيعي عند مدخل أنبوب الفئران مع القسطرة وضحالة واضح عندما يتم تلقيح الفئران عن طريق P. الزنجارية أجار الخرز. من الناحية المثالية، حقن P. يجب أن يتم تنفيذ الزنجارية أجار الخرز ببطء مع حجم الأمثل لل50 ميكرولتر. كميات أكبر تصل إلى 100 ميكرولتر يمكن أن يؤدي إلى وفيات أعلىوصعوبات أكبر في الانتعاش الفئران. يصاب كل الفئران على نحو كاف عندما تحدى عن طريق الجراحة داخل القصبة الهوائية.
وP. الزنجارية RP73 أجار الناجم عن الالتهاب الرئوي المزمن حبة يشير إلى أن في هذا النموذج العدوى هو التعدد البؤرية وينطوي على واحد أو أكثر فصوص الرئة دون المساس الرئة بأكملها عموما. وبالتالي، يجب أن يتم تقييم الحمولة الجرثومية والاستجابة الالتهابية للخروج على مجموع الرئة. تحليل فصوص انتقائية لا تعطي نتائج صحيحة. يجب إضافة مجموعة من الفئران غير المصابة كوسيلة لمراقبة ومقارنة مع الفئران المصابة للكشف عن أي خلل محتمل في تجنيد الخلايا في السائل BAL أو في الأنسجة في الرئة بسبب التلوث أو خطأ في الإجراء. أنشئ هذا النموذج في مختبر BSL-2 مع ينبغي تدريب جميع العاملين في المختبرات في المهارات المناسبة للمراقبة الماوس. تم رصد الفئران مرتين يوميا لمدة المعلمات التالية: انتصاب الشعر، وموقف، تنقل، والتنفس، والفضول، إفراز الأنف، والاستمالة والجفاف. الموت الرحيم كانت الفئران التي فقدت ≥ 20٪ من وزن الجسم، وأظهرت الأدلة السريرية للمرض شديدة، مثل معطف ضيع، الخمول، فقدان الشهية، وضعف تحرك، أو الموقف المؤلم، وذلك قبل انتهاء التجربة. الفئران المصابة P. أظهرت الزنجارية RP73 أجار الخرز علامات أقل من الانزعاج خلال ثلاثة أيام من العدوى بالمقارنة مع الفئران المصابة PAO1. بعد هذه النقطة مرة مسح بعض الفئران البكتيريا ووضع غيرها عدوى مزمنة مستقرة، لمدة تصل إلى 28 يوما.
أثبتنا أن نموذج عدوى مزمنة نقترح في هذه الورقة هي قادرة على إحداث P. مستقرة عدوى مزمنة الزنجارية في الفئران. وقد تم تحسين هذا الأسلوب لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الفوعة الممرض والدفاع المضيف 8،9،16 أو لاختبار المخدرات من الجزيئات المضادة للبكتيريا ومضادة للالتهابات 10،11. Tانه المصادقة قبل السريرية لهذه المركبات في النماذج الحيوانية المناسبة أمر ضروري لمستقبل التدخلات العلاجية لأمراض الرئة في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم تمويل البحوث في مختبر Bragonzi من قبل مؤسسة الإيطالية التليف الكيسي (CFaCore) والاتحاد الأوروبي وF7-2009-223670. تم تنفيذ جزء من هذا العمل في الإنبيق، مختبر المجهر المتقدمة، وأجري التشريح المرضي الماوس في وحدة من تشريح المرضي (معهد سان رافاييل العلمي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
