Summary
Vi beskriver agar-perler metode til at etablere vedvarende langvarig kronisk Pseudomonas aeruginosa luftveje infektion i musemodel.
Abstract
En musemodel af kronisk luftvejs infektion er et vigtigt aktiv i cystisk fibrose (CF) forskning, selv om der er en række problemstillinger i forbindelse selve modellen. Tidlige faser af inflammation og infektion er ofte blevet undersøgt ved hjælp af Pseudomonas aeruginosa agar-beads musemodel, mens kun få rapporter har fokuseret på den langsigtede kronisk infektion in vivo. Den største udfordring for langsigtet kronisk infektion er fortsat den lave bakterielle byrde ved P. aeruginosa og den lave procentdel af inficerede mus uger efter udfordring, hvilket indikerer, at bakterieceller gradvis er ryddet af værten.
Denne artikel præsenterer en metode til at opnå en effektiv langsigtet kronisk infektion i mus. Denne metode er baseret på indlejring af P. aeruginosa kliniske stammer i agar-beads in vitro, efterfulgt af intratracheal instillation i C57Bl/6NCrl mus. Bilateral lunge infektion er forbundet med sevrelle målbare udlæsning, herunder vægttab, dødelighed, kronisk infektion, og inflammatorisk reaktion. P. aeruginosa RP73 klinisk stamme blev foretrukket frem for den PAO1 referencelaboratorium stamme, da det resulterede i en forholdsvis lavere dødelighed, mere alvorlige læsioner, og højere kronisk infektion. P. aeruginosa kolonisering kan vare i lungerne i over tre måneder. Murine lunge patologi ligner CF-patienter med fremskreden kronisk lungesygdom.
Denne musemodel mest nøje efterligner løbet af sygdomme hos mennesker og kan bruges både til undersøgelser af patogenesen og for evaluering af nye terapier.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sygdom er forårsaget af mutationer i cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR)-gen. Dette gen koder for et chlorid kanal udtrykkes på membranen af de fleste epitelceller. Bronchiectasia, slim plukker og parenchymal ødelæggelser forårsaget hovedsageligt af Pseudomonas aeruginosa-infektioner gradvist føre til alvorlig lungesygdom og dødelighed i de fleste af CF-patienter 1. Forståelse CF patogenese og videreudvikling af nye behandlingsformer afhængige dyremodel med karakteristiske træk ved CF. Adskillige mus, genetisk modificerede for CFTR-genet, er blevet genereret, men begrænsninger i evnen af disse arter rekapitulere CF-lignende lungesygdom og flere andre organer abnormiteter set i CF-patienter er blevet dokumenteret i vid udstrækning 2.
Udvikling af infektion er en af de store udfordringer i CF dyremodel. Litteraturen cltidligt tyder på, at der kan opnås en kronisk infektion, der varer mere end en måned kun hvis mus podes med bakterier er indlejret i en immobiliserende middel, såsom agar, agarose, eller tang alginat 3-5. Disse immobiliseringsmidler give mikroaerobe / anaerobe betingelser, som tillader bakterier til at vokse i form af mikrokolonier i lighed med vækst i slim i CF-patienter 6. Denne model af kronisk infektion fører til vedvarende bakterier i lungerne forårsager betændelse i luftvejene og skader 7. Men afhængigt af den anvendte metode bakteriestammen og dosis inokuleret i lungerne, kan procentdelen af kroniske inficerede mus og bakteriebelastning genfundet i lungerne ved forskellige tidspunkter forskellige. Især den største udfordring for en langsigtet kronisk infektion er fortsat den lave bakterielle byrde ved P. aeruginosa og den lave procentdel af inficerede mus uger efter udfordring, hvilket indikerer that bakterieceller progressivt ryddet af værten. Ved at vælge P. aeruginosa RP73 klinisk stamme fra en samling af CF isolerer 8 vi succes opnået lav dødelighed, mere alvorlige læsioner, og høj procentdel af kronisk infektion med en stabil bakteriel belastning op til en måned i C57Bl/6NCrl mus.
Dette papir beskriver den metode til at indlejre P. aeruginosa i agaren perler, vi har inficeret mus ved intratrakeal instillation, målt den bakterielle belastning og cytokiner i lungerne, indsamlet BAL væske og udført histologisk undersøgelse. Samlet set vil dette protokol hjælpe forskere i håndteringen fundamentalt vigtige spørgsmål om patogenese 8,9 og teste nye behandlingsformer mod P. aeruginosa kronisk infektion 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse Bakterier til kronisk infektion (Tre og to dage før Mouse Challenge)
- Vælg den relevante P. aeruginosa-stamme, der skal testes.
- Podes en løkkefuld af P. aeruginosa fra en -80 ° C stamkultur til et Trypticase Soy Agar (TSA) plade og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Vælg en enkelt koloni og podning i 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) i en 15 ml snap-rør med skruelåg og inkuberes ved 37 ° C natten over i en rysteinkubator ved 200 rpm.
2. Embedding Bakterier i Agar Perler til kronisk infektion (en dag før infektion)
- Tage en lille portion af bakterie natten over kultur fortyndes 1:50 i phosphatpufret saltvand (PBS) og måle den optiske densitet (OD) ved 600 nm.
- Fortynd overnight bakteriekultur ved tilsætning af 2 OD i en ny snap-udjævnede rør indeholdende 20 ml frisk TSB.
- Der inkuberes ved 37 ° C i cirka 3 -4 timer for at logge fase i en rysteinkubator ved 200 rpm, indtil et samlet på 10-15 OD er nået.
- I mellemtiden forbereder TSA, lavet af TSB med 1,5% agar, autoklave og ligevægt ved 50 ° C i et vandbad. Ækvilibrer 150 ml preautoclaved svær mineralolie i en Erlenmeyerkolbe ved 50 ° C i et vandbad.
- Når P. aeruginosa når log-fase, indsamle bakteriecellerne ved centrifugering ved 2.700 x g i 15 minutter ved 4 ° C og supernatanten.
- Resuspender den bakterielle pellet i 1 ml sterilt PBS og vortex grundigt for at pellet resuspenderes fuldstændigt.
- Bland 1 ml bakteriesuspension med 9 ml flydende TSA præ-ækvilibreret ved 50 ° C.
- Tilsæt 10 ml TSA-P. aeruginosa blandingen til svær mineralolie (forvarmet ved 50 ° C), og straks omrøres i 6 min ved stuetemperatur. Den agitation skal udarbejde en synlig hvirvel i olien.
- Afkøl blandingen til 4 ° C, omrøring ved minimum speed i 35 minutter (figur 1).
- Hvile agar-perler-olieblanding i is i yderligere 20 minutter.
- Overfør agar-perler i 50 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 2.700 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Præcist fjerne mineralolie og vask med sterilt PBS seks gange, som beskrevet i trin 2.11. Efter tre gange vask, kan perlerne pelleteret ved tyngdekraften i stedet for ved hjælp af centrifugen. Efter den sidste vask resuspenderes agar-perler i 20-30 ml PBS.
- Tag en portion af perlerne (ca. 0,5 ml) og aseptisk homogeniseres.
- Tag 100 ul de homogeniserede perler og fortyndes i 900 ul sterilt PBS. Serielt fortyndet 1:10 ned til 10 -6.
- Plate seriefortynding på TSA-plader, herunder ufortyndede prøve ned til 10 -6 og inkuberes pladerne ved 37 ° C.
- Mål perlediameteren anvendelse af et omvendt lysmikroskop på flere områder. Perlediameteren skal være mellem 100-200 um (
- Opbevar perlerne natten over ved 4 ° C.
Figur 1. Oversigt over agar perler forberedelse og mus infektion. P. aeruginosa celler resuspenderes i 1 ml PBS og tilsat til 9 ml flydende TSA (50 ° C). Denne blanding sættes til 150 ml tung mineralolie ved 50 ° C i en kolbe og omrørt ved høj hastighed i 6 minutter ved stuetemperatur. Når kolben afkøles til 4 ° C med en langsom omrøring i 35 min, størkner agaren skabe perler og bakterier til stede i blandingen er indlejret i agar perlerne. Detalje af en agar perle indeholdende bakterieceller er vist (A). Efter fjernelse af mineralsk olie med adskillige vaske hjælp steril PBS, agar-perler suspension er klar feller podning i lungerne hos mus ved en intratrakeal indsprøjtning (B). Klik her for at se større billede .
3. Mus Challenge med Agar-perler
Etik Erklæring: Denne protokol og eksperimenter følger retningslinjerne fra dyrets pleje og etiske udvalg af San Raffaele Scientific Institute.
- Tæl antallet af kolonidannende enheder (CFU) på TSA-plader for at bestemme antallet af CFU / ml i agar-beads suspension. Fortynd agar-perler med sterilt PBS til 2-4 x 10 7 CFU / ml for at opnå en optimal inokulum på 1-2 x 10 6 i 50 pi.
- Bedøver C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 uger gamle) han-mus med ketamin (50 mg / ml) og xylazin (5 mg / ml) i 0,9% NaCI indgives i et volumen på 0,002 ml / g legemsvægt af intraperitoneal injektion.
BEMÆRK: Anæstesi anses adeqUate når dyret bliver stadig stille og roligt, ikke reagerer på eksterne stimuli, og har konstant hjerte og respiratoriske satser. - Placer musen i liggende stilling. Desinficer pelsen af musen med 70% ethanol.
- Blotlægge trachea af en lodret snit af huden og intubere luftrøret med en steril, fleksibel 22 G 0,9 mm x 25 mm IV kateter holde opmærksomheden fjerne stylette samtidig bevæger sig ned i luftrøret. Indsætning af kateteret ikke er for dybt ind i luftrøret. Stop før de når carina (forgreningen).
- Straks tage et volumen på 50 pi agar perlesuspension med en 1 ml sprøjte og fastgør den til kateteret. Skub forsigtigt stemplet af sprøjten, så perlerne, der skal implanteres i lungen. Lukke snittet hjælp sutur klip.
- Placer dyret på et varmepude indtil helt vågen.
4.. Mus Evaluering
- Overhold musene dagligt for kliniske tegn, herunder pelskvalitet, kropsholdning,ambulation, og hydrering status. Overvåge daglige kropsvægt. Mus, der mister ≥ 20% af kropsvægten skal aflives.
- Følg punkt 5 til opsamling af bronkoalveolærvaskevæsken (BAL), og punkt 6 eller 7 til indsamling af lunger og analysen af den samlede CFU, histologisk analyse, inflammatorisk respons i form af total og differential celletal i BAL, cytokin analyse og myeloperoxidase (MPO) aktivitet.
5.. BAL væskeansamling og analyse
- Aflive mus ved CO 2 indånding.
- Anbring musen i liggende stilling. Desinficer pelsen af musen med 70% ethanol.
- Bring luftrøret og brystkassen af en lodret snit af huden. Udsætte lungerne ved at skære membranen.
- Sæt en sutur tråd under luftrøret med en pincet og intubere luftrøret med en steril, fleksibel 22 g 0,9 mm x 25 mm IV kateter. Træk i de to ender af suturtråd at binde catheter til luftrøret og knude tråden omkring luftrøret.
- Tag et volumen på 1 ml RPMI 1640 ved hjælp af en 1 ml sprøjte og fastgør den til kateteret. Skub stemplet i sprøjten til at vaske lungerne og straks genvinde væske, opbevares i et 15 ml rør.
BEMÆRK: Hvis cytokiner skal analyseres, tilsættes proteasehæmmere til RPMI 1640. - Gentag dette trin tre gange med i alt 3 ml RPMI. Fra nu af, skal du gemme BAL væske på is. Gå til trin 6 for indsamling og analyse af lungerne.
BEMÆRK: Bemærk, at ikke al væsken hentes (2,8 ml maksimum). - Til kvantificering af bakterier til stede i BAL-væsken, prøve en lille portion (300 ul), serielt fortyndet 1:10 i sterilt PBS, plade på TSA-plader og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Tæl totale celler ved anvendelse af en inverteret lys optisk mikroskop fortynde en portion af BAL-væsken 1:02 med Tuerk opløsning i et Burker celletal kammeret.
- Centrifugeres remaining BAL-væsken ved 330 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Tag supernatanten til ELISA cytokin analyse opbevares ved -80 ° C. Følg trin 5,10-5,13 for differential celletal ved cytospin.
- Hvis pelleten er rød, lysere erytrocytterne resuspenderes pelleten i 250-300 pi RBC lysisbuffer fortyndes 1:10 i ultrarent destilleret vand i 3 minutter. Neutraliseres med 2 ml PBS og centrifugeres ved 330 xg i 8 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i RPMI 10% føtalt bovint serum (FBS). Brug en mængde, der vil give 1 x 10 6 celler / ml, baseret på den totale celletal.
- Placer objektglas og filtre i passende slots i cytospin med pap filtre står midt på cytospin. Tilsæt 150 ul af hver prøve i de relevante brønde af cytospin og centrifuger i et cytocentrifuge ved 300 xg i 5 min.
- Farv objektglassene ved Romanowsky farvning under anvendelse af et kommercielt kit ifølge manufacturer anvisninger, og som tidligere beskrevet 12. Følg trin 5,14-5,17 for MPO aktivitet analyse.
- Centrifuger resterende mængde BAL ved 380 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 250 pi af hexadecyltrimethylammoniumchlorid 0,5% i ultrarent destilleret vand for at lysere cellerne. Suspensionen kan fryses ved -20 ° C i flere dage før udførelse af analysen.
- Der centrifugeres ved 16.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C og anvendes supernatanten at udføre MPO-assay i 96-brønds plader, tilføjer prøven i to eksemplarer til hver brønd, og om nødvendigt også passende fortyndinger af prøven.
- Tilføj til hver prøve i brøndene et lige volumen af 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) som et substrat for peroxidase. Tillad reaktionen at finde sted i mørke i mindst 5 minutter, og indtil der ikke er yderligere udvikling i farven.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 2 MH 2 SO 4 and måle OD ved 450 nm. OD-værdien vil være direkte proportional med peroxidase aktivitet.
6.. Måling af bakterier i Lung og cytokinanalyse
- Umiddelbart efter indsamlingen BAL væske, punktafgifter lunger fra mus, skyl dem i sterilt PBS, særskilte lapper, læg dem i en rundbundet reagensglas, med 2 ml sterilt PBS og gemme på is.
BEMÆRK: Hvis cytokiner skal analyseres, tilsættes proteaseinhibitorer til PBS til rørene. - Aseptisk homogenisere lungerne, tage en lille prøve (300 ul) fra homogenatet serielt fortyndet 1:10 i PBS, plade på TSA-plader og inkuberes ved 37 ° C natten over. Bemærk venligst, at den samlede luftveje bakteriemængde vil være summen af CFUs findes i BAL væske og lunge.
- Centrifuger resterende homogenatet ved 16.000 x g i 30 min ved 4 ° C. Tag supernatanten til ELISA cytokin analyse, og opbevares ved -80 ° C.
7.. Histologisk undersøgelse
<ol>Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når protokollen er udført korrekt, P. aeruginosa agar-perler vil måle mellem 100-200 um og kan iagttages med en inverteret lysmikroskop ved pipettering et lille volumen af agar-perler suspension på et dias. Single bakterieceller er synlige i agar perler, som vist i detaljer i figur 1..
Valget af P. aeruginosa stamme anvendes i fremstillingen agar-perlerne er kritisk. Figur 2 og tabel 1 viser de data, der er opnået som følge af infektion af mus med P. aeruginosa PAO1 referencelaboratorium stammen i forhold til RP73 klinisk isolat. Dødelighed, observeret inden for de første 3 dage af infektion, er lav for begge stammer, men højere for PAO1 (figur 2A og 2B). Kan observeres betydelige forskelle med hensyn til andelen af kronisk infektion i de overlevende mus mellem PAO1 og RP73 udfordret mus. While på 3 dage efter infektion blev alle musene stadig inficeret med både P. aeruginosa stammer, efter dette tids-punkt nogle mus ryddet bakterier og andre har udviklet en stabil kronisk infektion. Fra 7 dage og fremefter andelen af kronisk inficerede mus forblev stabil op til 28 dage for begge stammer. PAO1 fører til kronisk infektion i en procentdel af mus, der lå mellem 20 til 27,8% (figur 2A), mens der for RP73 andelen var 75 til 87,1% (figur 2B), hvilket indikerer, at P. aeruginosa klinisk stamme var mere effektivt at etablere en kronisk infektion i forhold til PAO1 laboratoriestamme. Antallet af bakterier på 3 dage efter infektion var højere for PAO1 (5 x 10 7 CFU / lunge) (figur 2C og tabel 1) sammenlignet med RP73 (1,3 x 10 6 CFU / lunge) (figur 2D), derefter fra 7 dage fremefter, hvor kronisk infektion blev etableret, den bakterielle belastning stabiliseres på mellem 10 <sup> 4 og 10 5 CFU / lunge for begge stammer. Når kronisk infektion er etableret, er antallet af CFU / lunge ikke ændre sig væsentligt i løbet af en måned. Desuden er den bakterielle belastning i luftvejene er ens blandt mus udfordret med forskellige bakteriestammer 9,13.
Andre udlæsninger, herunder værtens inflammatoriske respons og histopatologi, kan måles på forskellige tidspunkter fra udfordring. Figur 3 viser den inflammatoriske reaktion i form af leukocytrekruttering i mus BAL væske for 7 dage fra udfordring med P. aeruginosa RP73 klinisk stamme indlejret i agar-perler. RP73-inficerede mus blev sammenlignet med ikke-inficerede mus. Differential celletal inkluderet neutrofiler, makrofager og lymfocytter. Det samlede antal celler er væsentligt højere i RP73-inficerede mus i forhold til ikke-inficerede mus. Neutrofiler især næsten fuldstændigt fraværende i BAL-væsken af ikke-inficerede mus, var de mest represented cellulære type RP73-inficerede mus, hvilket indikerer en betydelig reaktion fra det medfødte immunsystem til kronisk infektion.
Histopatologisk analyse af lunger fra mus, kronisk inficeret med P. aeruginosa RP73, viser, at infektionen er ethvert andet miljømærke brændvidder. Figurerne 4C og 4F viser en lap, der er mere involveret end andre lapper, der er upåvirket eller marginalt involveret (figur 4B og 4E). Perler kan observeres i bronchiale lumen mikrokolonier af bakterieceller er synlige i perlerne (figur 4C og 4F). Lung histopatologi i de involverede ved infektion områder viste inflammatoriske læsioner i bronkierne og i den pulmonale parenkym. Bronkierne blev fyldt af en massiv neutrofil betændelse omkring perlerne, hvorimod parenkym blev infiltreret af makrofager, lymfocytter og nogle neutrofile. Histologi afen inficeret mus blev anvendt som en kontrol; både parenkym og bronkierne var klare af inflammatoriske celler (fig. 4A og 4D).
Figur 2. Tidsforløb af P. aeruginosa kronisk infektion med PAO1 henvisning stamme og RP73 klinisk stamme. C57BL/6NCrl (20-22 g) hanmus var smittet af intratracheal injektion med 1 til 5 x 10 6 CFU af P. aeruginosa stamme PAO1 (A og C) eller RP73 (B og D) indlejret i agar-beads. For hver gang-point repræsenterer histogrammer den procentvise dødelighed induceret af bakteriæmi (rød) og overlevelse (grå) eller procentdelen af dyr, der ryddet infektion (hvid) og dem i stand til at etablere en kronisk infektion (grøn) (A og B). Overlevende mus blev aflivet på de angivne tidspunkter, og lungerne blev høstet, homogeniseret og dyrket på TSA-plader for at bestemme den bakterielle belastning. De kurver PAO1 og RP73 stammer i murine lunger vækst er vist (C og D). Dots repræsenterer individuelle målinger og vandrette linjer repræsenterer medianværdier. Statistisk signifikans af Fishers test er indiceret: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klik her for at se større billede .
Tabel 1. Tidsforløb af P. aeruginosakronisk infektion med PAO1 referencestamme og RP73 klinisk stamme. Procenter til dødelighed og kronisk infektion i PAO1 og RP73 inficerede mus og antallet af CFU'er pr lunge (median) bliver vist. Værdier er valgt 2-4 forskellige eksperimenter. N ingen. poolet mus analyseret for hver betingelse. Statistisk signifikans af Fishers test er indiceret: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Evaluering af betændelse i BAL væske efter 7 dages kronisk infektion med RP73 klinisk stamme. (A) Grafen viser indhold af totalleukocytter, neutrofiler og monocytter / makrofager genfundet i BAL-væsken af RP73 kronisk inficerede mus efter 7 dage fra udfordring sammenlignet med ikke-inficerede mus (kontrol). Middelværdier og SEM er repræsenteret. (B) I boksen nedenfor pile viser neutrofile og en makrofag set i en plet på et dias efter cytospin. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Hematoxylin og eosin farvning på histologiske sektioner af lungerne efter 7 dages kronisk infektion med RP73 klinisk stamme. Panelet viser hematoxylin og eosin-farvning af lungesnit af inficerede mus (A og D), og mus udfordrendeed med agar-kugler indeholdende RP73 (B, C, E, F). Infektionen er ethvert andet miljømærke brændvidder og generelt indebærer en eller flere lungelapper (C og F), mens de andre er upåvirket eller marginalt involveret (B og E). Pile angiver agar perler deponeret i de bronchiale lumen (B). Lines (A, B, C) 250 um. Linjer (D, E, F) 100 um Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin i P. aeruginosa-perler forberedelse og mus udfordring er angivet nedenfor.
P. aeruginosa-stamme for mus udfordring er kritisk. Dødelighed, kronisk infektion eller clearance kan variere betydeligt afhængigt af den anvendte bakteriestamme til udfordringen. P. aeruginosa RP73 klinisk stamme blev foretrukket frem for den PAO1 referencelaboratorium stamme, da det resulterede i en forholdsvis lavere dødelighed, mere alvorlige læsioner, og højere kronisk infektion. Drug test i prækliniske undersøgelser bør udføres med P. aeruginosa stammer valgt for deres høje effektivitet i at etablere langsigtede kronisk infektion. Dette minimerer antallet af mus, der er i overensstemmelse med kravene i videnskabelig validering og statistisk analyse 10,11.
Den enkelte P. aeruginosa agar-perle præparater variere i størrelse og i CFU / ml. En average diameter på 150 um med 2 x 10 7 CFU / ml betragtes som optimal. Perlestørrelse påvirkes af omrøringshastigheden under afkølingsfasen (trin 2.9). Perler omrørt ved tophastighed er små og sfæriske (<50 um), mens de omrøres meget langsomt er store og amorf (> 1 mm). Hertil kommer, når den endelige fortynding for udfordring er forberedt, kan perler med et lavt bakterieindhold være klistret, mens dem med høj bakteriel belastning kan overdrevent udvandet. Podning af mus med klæbrige perler er forbundet med høj dødelighed som følge af mus kvælning hurtigt efter udfordring, mens overdrevent fortyndet perler kan medføre et fravær af kronisk infektion. Den optimale mængde af intratracheal injektion er 50 gl, men større mængder af op til 100 pi kan podes. Forskelle i dødelighed eller kronisk infektion af mus er sjældent observeret, når den podede dosis svinger mellem 5 x 10 5 og 5 x 10 6 CFU / mus.
BEVILLINGEe bakterievækst medium skal anvendes til agar perler formation. I dette tilfælde, P. aeruginosa var indlejret i TSA, andre papirer rapporterede, at Burkholderia cenocepacia blev medtaget i næringsbouillon agar 14,15. Agar perler bør give en microanaerobic miljø med essentielle næringsstoffer til rådighed for bakteriel spredning fra enkelte celler til mikrokolonier 9.
Respiratory indsats varierer afhængigt af bedøvelsesmiddel og anvendte dosis, og påvirker dødeligheden efter operationen. Ketamin ved en dosis på 0,1 mg / g kropsvægt andxylazine i en dosis på 0,01 mg / g legemsvægt er de optimale valg. Respiration er normalt, når mus intuberet med kateteret og synligt fladere når mus inokuleres ved P. aeruginosa agar-perler. Ideelt injektion af P. aeruginosa agar-perlerne skal udføres langsomt med en optimal volumen på 50 ul. Højere mængder af op til 100 pi kunne resultere i højere dødelighedog større vanskeligheder i mus opsving. Alle mus er tilstrækkeligt inficeret når udfordret ved intratrakeal kirurgi.
P. aeruginosa RP73 agar perle-induceret kronisk lungebetændelse indikerer, at infektionen i denne model er omfatter flere fokale og indebærer generelt en eller flere lungelapper uden at kompromittere hele lungen. Følgelig skal evaluering af bakteriel belastning og inflammatorisk respons udføres på alt lunge. Analysen af selektive lapper ikke producerer gyldige resultater. En ikke-inficerede gruppe af mus bør tilføjes som en kontrol og sammenlignet med inficerede mus for at erkende en potentiel abnormitet i celle rekruttering i BAL væske eller i histologi af lungen på grund af forureninger eller fejl i proceduren. Denne model blev etableret i en BSL-2 laboratorium med alle laboratorie personale bør uddannes i de relevante færdigheder til mus observation. Musene blev overvåget to gange om dagen for de følgende parametre: piloerektion, attitude, Bevægelse, vejrtrækning, nysgerrighed, nasal sekretion, grooming og dehydrering. Mus, der tabte ≥ 20% af kropsvægten og viste tegn på svær klinisk sygdom, såsom scruffy pels, inaktivitet, tab af appetit, dårlig bevægelse, eller smertefuld kropsholdning, blev aflivet før afslutning af forsøget. Mus inficeret med P. aeruginosa RP73 agar-perler viste lavere tegn på ubehag inden for tre dage fra infektion i forhold til PAO1-inficerede mus. Efter dette tidspunkt nogle mus ryddet bakterier og andre har udviklet en stabil kronisk infektion, der varer op til 28 dage.
Vi viste, at den model af kronisk infektion vi foreslår i dette papir er i stand til at fremkalde en stabil P. aeruginosa kronisk infektion i mus. Denne metode er blevet optimeret til at studere de molekylære mekanismer, der ligger patogenet virulens og vært forsvar 8,9,16 eller narkotika testning af antibakterielle og anti-inflammatoriske molekyler 10,11. Than præklinisk validering af disse forbindelser i egnede dyremodeller er afgørende for fremtidige terapeutiske interventioner for lungeinfektioner hos patienter med CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forskning i Bragonzi laboratorium er finansieret af den italienske cystisk fibrose Foundation (CFaCore) og EU-F7-2009 til 223.670. En del af dette arbejde blev udført i Alembic, en avanceret mikroskopi laboratorium og mus histopatologi blev udført i Enheden for Patologisk Anatomi (San Raffaele Scientific Institute).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
