Summary
We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.
Abstract
Een muismodel van chronische luchtweg infectie is een belangrijke troef bij cystic fibrosis (CF) onderzoek, maar er zijn een aantal problemen met betrekking tot het model zelf. Vroege fasen van ontsteking en infectie zijn uitgebreid bestudeerd met de Pseudomonas aeruginosa agar-kralen muismodel, terwijl slechts weinig verslagen gericht op de lange termijn chronische infectie in vivo. De belangrijkste uitdaging voor de lange termijn chronische infectie blijft de lage bacteriële last van P. aeruginosa en het lage percentage geïnfecteerde muizen weken na prikkeling, hetgeen aangeeft dat bacteriële cellen progressief worden gewist door de gastheer.
Dit document presenteert een werkwijze voor het verkrijgen van efficiënte langdurige chronische infectie in muizen. Deze methode is gebaseerd op de inbedding van de P. klinische aeruginosa stammen in de agar-kralen in vitro, gevolgd door intratracheale indruppeling in C57Bl/6NCrl muizen. Bilaterale longinfectie wordt geassocieerd met SEVmene meetbare read-outs waaronder gewichtsverlies, sterfte, chronische infectie, en ontstekingsreactie. De P. aeruginosa RP73 klinische stam werd de voorkeur boven de PAO1 referentielaboratorium stam omdat het resulteerde in een relatief lagere sterfte, meer ernstige letsels, en hogere chronische infectie. P. aeruginosa kolonisatie kunnen blijven bestaan in de long voor meer dan drie maanden. Murine longpathologie lijkt op die van CF patiënten met geavanceerde chronische longziekte.
Dit muizenmodel dichtst bootst het verloop van de ziekte bij de mens kan worden gebruikt voor zowel onderzoek naar de pathogenese en de evaluatie van nieuwe therapieën.
Introduction
Cystische fibrose (CF) is een genetische ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) gen. Dit gen codeert voor een chloride kanaal tot expressie gebracht op het membraan van de meeste epitheelcellen. Bronchiëctasieën, slijm plugging en parenchymcellen vernietiging voornamelijk veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa infecties geleidelijk leiden tot ernstige longziekte en sterfte in de meeste van de CF-patiënten 1. Inzicht CF pathogenese en verdere ontwikkeling van nieuwe therapieën afhankelijk diermodel met karakteristieke kenmerken van CF. Verscheidene muizen, genetisch gemodificeerd voor het CFTR gen, zijn gegenereerd, maar beperkingen in het vermogen van deze soorten CF-achtige longziekte en diverse andere organen afwijkingen waargenomen bij CF-patiënten herhalen zijn gedocumenteerd 2.
Ontwikkeling van de infectie is een van de grote uitdagingen in de CF diermodel. De literatuur clvroeg suggereert dat een chronische infectie die langer dan een maand kan alleen worden bereikt als muizen worden geënt met bacteriën ingebed in een immobiliseringsmiddel zoals agar, agarose, of zeewier alginaat 3-5. Deze immobiliseren agents de micro-aërobe / anaërobe omstandigheden waarmee bacteriën om te groeien in de vorm van microkolonies, vergelijkbaar met de groei in het slijm van CF-patiënten 6. Dit model van chronische infectie leidt tot de persistentie van de bacteriën in de longen veroorzaakt luchtwegontsteking en beschadiging 7. Afhankelijk van de gebruikte methode, de bacteriestam geïnoculeerd en de dosis in de longen, het percentage chronische geïnfecteerde muizen en de bacteriële verontreiniging teruggevonden in de longen op verschillende tijdstippen kunnen aanzienlijk verschillen. Met name de belangrijkste uitdaging voor de lange termijn chronische infectie blijft de lage bacteriële last van P. aeruginosa en het lage percentage geïnfecteerde muizen weken na uitdaging, hetgeen that bacteriecellen geleidelijk gewist door de gastheer. Door het selecteren van P. aeruginosa RP73 klinische stam uit een verzameling van CF isoleert 8 we met succes lage sterfte, meer ernstige letsels, en hoog percentage van chronische infectie verkregen met een stabiele bacteriële verontreiniging tot een maand in C57Bl/6NCrl muizen.
Dit document beschrijft de methodiek voor het inbedden van P. aeruginosa in de agar kralen, we hebben geïnfecteerde muizen intratracheale instillatie, gemeten de bacteriële verontreiniging en cytokines in de longen, verzameld BAL vloeistof en uitgevoerd histologisch onderzoek. Over het algemeen zal dit protocol onderzoekers te helpen bij het aanpakken van fundamenteel belangrijke vragen over pathogenese 8,9 en testen van nieuwe therapieën tegen P. aeruginosa chronische infectie 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden van Bacteriën voor chronische infectie (drie en twee dagen voorafgaand aan Mouse Challenge)
- Selecteer de juiste P. aeruginosa stam te testen.
- Inoculeren een lusvol P. aeruginosa uit een -80 ° C voorraad cultuur een trypticasesoja Agar (TSA) plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Kies een enkele kolonie en te enten in 5 ml trypticasesoja Bouillon (TSB) in een 15 ml snap-buisje en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht in een incubator schudden bij 200 rpm.
2. Inbedding Bacteriën in Agar Kralen voor chronische infectie (een dag voor infectie)
- Neem een kleine hoeveelheid bacteriële cultuur overnacht, 1:50 verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en meet de optische dichtheid (OD) bij 600 nm.
- Verdun de nachtelijke bacteriecultuur door toevoeging van 2 OD in een nieuw-snap buisje met 20 ml vers TSB.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer 3 -4 uur naar fase loggen in een incubator schudden bij 200 rpm, tot een totaal van 10-15 OD is bereikt.
- Ondertussen bereidt de TSA, van TSB met 1,5% agar, autoclaaf en equilibreren bij 50 ° C in een waterbad. Equilibreer 150 ml preautoclaved zware minerale olie in een Erlenmeyer kolf bij 50 ° C in een waterbad.
- Zodra P. aeruginosa bereikt de log-fase, verzamel de bacteriële cellen door centrifugeren bij 2700 g gedurende 15 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de bacteriële pellet in 1 ml steriele PBS en vortex grondig de pellet volledig resuspenderen.
- Meng 1 ml bacteriële suspensie met 9 ml vloeibaar TSA vooraf geëquilibreerd bij 50 ° C.
- Voeg de 10 ml TSA-P. aeruginosa mengsel zware minerale olie (voorverwarmd bij 50 ° C) en onmiddellijk roeren gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. De agitatie moet zichtbaar vortex produceren in de olie.
- Koel het mengsel tot 4 ° C, roeren bij minimale spoodzaak van 35 min (figuur 1).
- Laat de agar-kralen-oliemengsel in ijs voor een extra 20 minuten.
- Breng de agar-korrels in 50 ml Falcon buizen en centrifugeer bij 2700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Nauwkeurig verwijderen minerale olie en wassen met steriele PBS zesmaal, zoals beschreven in stap 2.11. Na drie wassingen, kunnen de kralen worden gepelleteerd door zwaartekracht plaats van de centrifuge. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de agar-kralen in 20-30 ml PBS.
- Neem een monster van de korrels (ongeveer 0,5 ml) en aseptisch gehomogeniseerd.
- Neem 100 ul van de gehomogeniseerde kralen en verdunnen in 900 pi steriel PBS. Serieel verdunnen 1:10 tot 10 -6.
- Plaat seriële verdunning op TSA-platen, zoals onverdund monster tot 10 -6 platen en incubeer bij 37 ° C.
- Meet de kraal diameter met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop op verschillende gebieden. De kraal diameter moet tussen 100-200 pm (
- Bewaar de korrels overnacht bij 4 ° C.
Figuur 1. Overzicht van de agar kralen voorbereiding en muis infectie. P. aeruginosa cellen worden geresuspendeerd in 1 ml PBS en toegevoegd aan 9 ml vloeibaar TSA (50 ° C). Dit mengsel wordt toegevoegd aan 150 ml van zware minerale olie bij 50 ° C in een kolf en geroerd bij hoge snelheid gedurende 6 min bij kamertemperatuur geroerd. Wanneer de kolf wordt afgekoeld tot 4 ° C met langzaam roeren voor 35 min, stolt de agar creëren kralen en bacteriën in het mengsel worden ingebed in de agar korrels. Detail van een agar parelbevattende bacteriële cellen wordt getoond (A). Na het verwijderen van de minerale olie met enkele wasbeurten met steriele PBS, de agar-kralen ophanging is klaar fof enting in de longen van muizen door een intratracheaal injectie (B). Klik hier voor grotere afbeelding .
3. Muizen Challenge met Agar-kralen
Ethiek Verklaring: Dit protocol en experimenten volg de richtlijnen van het dier zorg en ethische commissie van San Raffaele Wetenschappelijk Instituut.
- Tel het aantal kolonievormende eenheden (CFU) op TSA platen om het aantal KVE / ml te bepalen in de agar-korrels suspensie. Verdun de agar-kralen met steriele PBS tot 2-4 x 10 7 CFU / ml een optimale inoculum van 1-2 x 10 6 bereikt in 50 pl.
- Verdoven C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 weken oud) mannelijke muizen met ketamine (50 mg / ml) en xylazine (5 mg / ml) in 0,9% NaCl bij een volume van 0,002 ml / g lichaamsgewicht toegediend door intraperitoneale injectie.
OPMERKING: Anesthesie wordt beschouwd adeqUate wanneer het dier blijft nog steeds rustig, niet reageert op externe prikkels, en constant hart en ademfrequentie. - Plaats de muis in rugligging. Ontsmet de vacht van de muis met 70% ethanol.
- Expose de luchtpijp van een verticale snede van de huid en intuberen de trachea met een steriele, flexibele 22 G 0,9 mm x 25 mm IV-katheter, waarbij de aandacht op het stilet verwijderen terwijl naar beneden in de luchtpijp. Plaats de katheter niet te diep in de luchtpijp. Stoppen voor het bereiken van de Carina (vertakking).
- Onmiddellijk een volume van 50 ul van agar kraal schorsing door een 1 ml spuit en bevestig deze aan de katheter. Duw de zuiger van de spuit, waardoor de kralen te worden geïmplanteerd in de longen. Sluit de incisie met hechtmateriaal clips.
- Plaats het dier op een verwarmingselement tot helemaal wakker.
4. Muizen Evaluatie
- Let op de muizen dagelijks op klinische tekenen zoals vacht kwaliteit, houding,ambulation en vochthuishouding. Monitor dagelijks lichaamsgewicht. Muizen die ≥ 20% lichaamsgewicht verliezen moeten worden gedood.
- Volg Punt 5 voor het verzamelen van bronchoalveolaire lavage vloeistof (BAL) en de punten 6 of 7 voor de inzameling van de longen en de analyse van de totale CFU, histologische analyse, ontstekingsreactie in termen van totale en gedifferentieerde telling van de cellen in de BAL, cytokine-analyse, en myeloperoxidaseactiviteit (MPO).
5. BAL Fluid verzameling en analyse
- Euthanaseren de muizen door CO 2 inhalatie.
- Plaats de muis in rugligging. Ontsmet de vacht van de muis met 70% ethanol.
- Expose de luchtpijp en de borstkas door een verticale snede van de huid. Expose de longen door het snijden van het middenrif.
- Plaats een hechtdraad onder de luchtpijp met een pincet en intuberen de luchtpijp met een steriele, flexibele 22 g 0.9 mm x 25 mm IV katheter. Trek de twee uiteinden van de hechtdraad aan de ca bindentheter naar de luchtpijp en knoop de draad rond de luchtpijp.
- Neem een volume van 1 ml RPMI 1640 met een spuit 1 ml en hechten aan de katheter. Duw de zuiger van de spuit naar de longen te wassen en onmiddellijk de vloeistof te herstellen, op te slaan in een 15 ml buis.
OPMERKING: Als cytokines worden geanalyseerd, voeg proteaseremmers aan RPMI 1640. - Herhaal deze stap drie keer met in totaal 3 ml RPMI. Van nu af aan, slaan de BAL-vloeistof op het ijs. Ga naar stap 6 voor de verzameling en analyse van de longen.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat niet alle van de vloeistof zal worden opgehaald (2.8 maximaal ml). - Voor kwantificering van bacteriën in de BAL-vloeistof, een kleine hoeveelheid monster (300 pl), serieel verdund 1:10 in steriele PBS, plaat op TSA platen en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd.
- Telling totale cellen met een omgekeerde licht optische microscoop verdunning een hoeveelheid van de BAS vloeistof 01:02 met Tuerk oplossing in een Burker cellen kamer.
- Centrifugeer de remaining BAS vloeistof bij 330 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Neem de bovenstaande vloeistof voor ELISA cytokine analyse, bewaart bij -80 ° C. Volg de stappen 5,10-5,13 voor differentiële telling cel door cytospin.
- Als de pellet is rood, lyseren de erytrocyten resuspenderen de pellet in 250-300 ul van RBC lysebuffer 1:10 verdund in ultra-puur gedestilleerd water gedurende 3 minuten. Neutraliseren met 2 ml PBS en centrifugeer bij 330 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in RPMI 10% foetaal runderserum (FBS). Gebruik een volume met 1 x 10 6 cellen / ml, gebaseerd op het totale aantal cellen zal.
- Plaats objectglaasjes en filters in geschikte sleuven in de Cytospin de kartonnen filters naar het midden van de Cytospin. Pipetteer 150 ul van elk monster in de juiste putjes van de Cytospin centrifuge en in een cytocentrifuge bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- Stain dia's door Romanowsky kleuring met behulp van een commerciële kit, volgens de mainstructies brikant en zoals eerder 12 beschreven. Volg de stappen 5,14-5,17 voor MPO activiteit analyse.
- Centrifugeer de resterende hoeveelheid BAL 380 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 pl hexadecyltrimethylammoniumbromide chloride 0,5% in ultra-zuiver gedestilleerd water om de cellen te lyseren. De suspensie bij -20 ° C worden bevroren verscheidene dagen voordat de test.
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en gebruik de supernatant MPO bepaling uitgevoerd in 96-well platen, toevoegen van het monster in tweevoud in elk putje en indien nodig, ook goede verdunningen van het monster.
- In elk monster in de putjes een gelijk volume van 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) als substraat voor peroxidase. Laat de reactie plaatsvindt in het donker gedurende ten minste 5 minuten en totdat er geen verdere ontwikkeling van de kleur.
- Stop de reactie door toevoeging van 2 MH 2 SO 4 eennd het meten van de OD bij 450 nm. De OD-waarde recht evenredig aan peroxidase activiteit.
6. Meting van van bacteriën in Lung and Cytokine Analyse
- Onmiddellijk na het verzamelen BAS vloeistof, accijnzen longen van de muis, spoel ze in steriele PBS, afzonderlijke lobben, leg ze in een ronde bodem buis met 2 ml steriele PBS en op te slaan op ijs.
OPMERKING: Als cytokines worden geanalyseerd, voeg proteaseremmers aan PBS aan de buizen. - Aseptisch homogeniseren longen, neemt een kleine hoeveelheid (300 ul) van het homogenaat, serieel verdund 1:10 in PBS, plaat op TSA platen en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd. Houdt u er rekening mee dat het totale luchtweg bacteriële verontreiniging van de som van de CFU's gevonden in BAL vloeistof en longen zal zijn.
- Centrifugeer de resterende homogenaat bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Neem de bovenstaande vloeistof voor ELISA cytokine analyse, en bewaar bij -80 ° C.
7. Histologisch onderzoek
<ol>Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer het protocol correct wordt gedaan, de P. aeruginosa agar-beads 100-200 urn meten en kan met een omgekeerde lichtmicroscoop worden nageleefd door pipetteren een klein volume van het agar-korrels suspensie op een dia. Enkele bacteriële cellen zichtbaar in de agar korrels, zoals in detail getoond in figuur 1.
De keuze van P. aeruginosa stam gebruikt in de agar-korrels preparaat kritisch. Figuur 2 en Tabel 1 tonen de gegevens verkregen bij de infectie van muizen met P. aeruginosa PAO1 referentielaboratorium stam vergeleken met RP73 klinisch isolaat. Sterfte, vooral in de eerste 3 dagen van de infectie, is laag voor beide stammen, maar hoger voor PAO1 (Figuren 2A en 2B). Aanzienlijke verschillen in het percentage chronische infectie in de overlevende muizen worden waargenomen tussen PAO1 en RP73 uitgedaagd muizen. While 3 dagen na infectie werden alle muizen nog voorkomen door zowel P. aeruginosa stammen, na deze tijd-punt sommige muizen maakte de bacteriën en andere ontwikkelde een stabiele chronische infectie. Vanaf 7 dagen vanaf het percentage chronisch geïnfecteerde muizen bleven stabiel tot 28 dagen voor beide stammen. PAO1 leidt tot chronische infectie in een percentage van muizen die varieerde tussen 20-27,8% (Figuur 2A), terwijl voor RP73 het percentage 75-87,1% (figuur 2B), wat aangeeft dat de P. aeruginosa klinische stam was efficiënter in de oprichting van een chronische infectie in vergelijking met de PAO1 laboratoriumstam. Aantallen bacteriën in 3 dagen na infectie waren hoger voor PAO1 (5 x 10 7 CFU / long) (figuur 2C en tabel 1) tegenover RP73 (1,3 x 10 6 CFU / long) (Figuur 2D), vervolgens van 7 dagen verder, als chronische infectie werd opgericht, de bacteriële verontreiniging stabiliseert tussen de 10 <sup> 4 en 10 5 CFU / long voor beide stammen. Zodra chronische infectie is vastgesteld, is het aantal CFU / long niet significant veranderen in de loop van een maand. Bovendien, de bacteriële verontreiniging in de luchtwegen is vergelijkbaar onder muizen uitgedaagd met verschillende bacteriestammen 9,13.
Andere read-outs, met inbegrip van de gastheer ontstekingsreactie en histopathologie, kan worden gemeten op verschillende tijdstippen van de challenge. Figuur 3 toont de ontstekingsreactie in termen van rekrutering van leukocyten in muizen BAL vloeistof 7 dagen na challenge met P. aeruginosa RP73 klinische stam ingebed in agar-kralen. RP73-geïnfecteerde muizen werden vergeleken met niet-geïnfecteerde muizen. Differentiële telling cel inbegrepen neutrofielen, macrofagen en lymfocyten. Het aantal totale cellen aanzienlijk hoger RP73-geïnfecteerde muizen in vergelijking met niet-geïnfecteerde muizen. Neutrofielen, met name bijna volledig afwezig in de BAL-vloeistof van niet-geïnfecteerde muizen, waren de represented cellulaire type RP73-geïnfecteerde muizen, wat wijst op een aanzienlijke reactie van het aangeboren immuunsysteem bij chronische infectie.
De histopathologische analyse van de longen van muizen, chronisch geïnfecteerd met P. aeruginosa RP73, toont aan dat de infectie is pluri-concentratiegebieden. Figuren 4C en 4F tonen een kwab dat is meer betrokken dan andere kwabben die onaangetast of marginaal betrokken zijn (Figuren 4B en 4E) zijn. Kralen kunnen worden waargenomen in bronchiale lumen en microkolonies van bacteriële cellen zichtbaar in de korrels (figuren 4C en 4F). Lung histopathologie in de betrokken gebieden van infectie toonden inflammatoire laesies in de bronchiën en in het longparenchym. De bronchiën werden gevuld door een enorme neutrofielen ontsteking rondom de kralen, terwijl het parenchym werd geïnfiltreerd door macrofagen, lymfocyten en enkele neutrofielen. Histologie vaneen niet-geïnfecteerde muizen werd gebruikt als controle, zowel parenchym en bronchiën waren duidelijk van ontstekingscellen (figuren 4A en 4D).
Figuur 2. Tijdsverloop van P. aeruginosa chronische infectie met PAO1 referentiestam en RP73 klinische stam. C57BL/6NCrl (20-22 g) mannelijke muizen werden geïnfecteerd door intratracheale injectie met 1 tot 5 x 10 6 CFU P. aeruginosa stam PAO1 (A en C) of RP73 (B en D) ingebed in agar-kralen. Voor elk tijdpunt, histogrammen vertegenwoordigen het percentage sterfte veroorzaakt door bacteriëmie (rood) en overleving (grijs) of het percentage dieren dat de infectie gewist (wit) en die kunnen een chronische infectie (groen vast) (A en B). Overlevende muizen werden gedood op de aangegeven tijdstippen, en de longen werden geoogst, gehomogeniseerd en gekweekt op TSA platen om de bacteriële belasting te bepalen. De groeicurven van PAO1 en RP73 stammen in muriene longen worden getoond (C en D). Stippen vormen de afzonderlijke metingen en horizontale lijnen stellen mediane waarden. Statistische significantie van Fisher's test is aangegeven: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klik hier voor grotere afbeelding .
Tabel 1. Tijdsverloop van P. aeruginosachronische infectie met PAO1 referentiestam en RP73 klinische stam. Percentages van mortaliteit en van chronische infectie van PAO1 en RP73 geïnfecteerde muizen en het aantal CFU's per long (mediaan) getoond. Waarden worden gekozen 2-4 verschillende experimenten. N, nee. van gepoolde muizen geanalyseerd voor elke conditie. Statistische significantie van Fisher's test is aangegeven: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Evaluatie van de ontsteking in BAL vloeistof na 7 dagen van chronische infectie met RP73 klinische stam. (A) De grafiek toont de inhoud van de totaleleukocyten, neutrofielen en monocyten / macrofagen teruggevonden in de BAL-vloeistof van RP73 chronisch geïnfecteerde muizen na 7 dagen van uitdaging in vergelijking met niet-geïnfecteerde muizen (controle). Gemiddelde waarden en SEM worden weergegeven. (B) In het onderstaande pijlen geven neutrofielen en een macrofaag zoals te zien in een plek op een dia na cytospin. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Hematoxyline en eosine kleuring van histologische coupes van de longen na 7 dagen van chronische infectie met RP73 klinische stam. Het paneel geeft hematoxyline en eosine kleuring van longsecties onbesmette muizen (A en D) en muizen uitdagended met agar-bolletjes, bevattende RP73 (B, C, E, F). De infectie is pluri-concentratiegebieden en gaat over het algemeen een of meer longkwabben (C en F), terwijl de anderen zijn beïnvloed of marginaal betrokken (B en E). Pijlen geven agar korrels afgezet in het bronchiale lumen (b). Lijnen (A, B, C) 250 micrometer;. Lijnen (D, E, F) 100 pm Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische stappen in de P. aeruginosa-kralen voorbereiding en muis uitdaging worden hieronder vermeld.
De P. aeruginosa stam gebruikt voor muizen uitdaging is van cruciaal belang. Sterfte, chronische infectie of klaring kan aanzienlijk verschillen afhankelijk van de bacteriestam die voor de uitdaging. De P. aeruginosa RP73 klinische stam werd de voorkeur boven de PAO1 referentielaboratorium stam omdat het resulteerde in een relatief lagere sterfte, meer ernstige letsels, en hogere chronische infectie. Testen in preklinische studies geneesmiddel moet worden uitgevoerd met P. aeruginosa stammen geselecteerd op hun hoge efficiëntie in de oprichting van langdurige chronische infectie. Dit minimaliseert het aantal muizen dat in overeenstemming is met de eisen van wetenschappelijke validatie en statistische analyse 10,11 zijn.
De individuele P. aeruginosa agar-kraal voorbereidingen variëren in grootte en in CFU / ml. Een eenverage diameter van 150 urn met 2 x 10 7 CFU / ml wordt als optimaal beschouwd. Bead maat is beïnvloed door de roersnelheid tijdens de afkoelfase (stap 2.9). Kralen geroerd op topsnelheid zijn klein en bolvormig (<50 micrometer) terwijl die geroerd heel langzaam zijn groot en amorfe (> 1 mm). Bovendien, als de uiteindelijke verdunning voor uitdaging is voorbereid, kralen met een lage bacteriële belasting kan plakkerig zijn, terwijl die met hoge bacteriële belasting buitensporig kan worden verdund. Inoculatie van muizen met kleverige korrels wordt geassocieerd met een hoge sterfte aan muizen verstikking snel na blootstelling, terwijl overmatig verdund korrels kunnen leiden tot het ontbreken van chronische infectie. De optimale hoeveelheid intratracheale injectie 50 pl maar grotere hoeveelheden tot 100 gl kunnen worden geïnoculeerd. Verschillen in sterfte of chronische infectie van muizen worden zelden waargenomen wanneer de geënte dosis varieert tussen 5 x 10 5 en 5 x 10 6 CFU / muis.
Appropriate bacterieel groeimedium worden gebruikt agar kralen vorming. In dit geval, P. aeruginosa werd ingebed in TSA; andere kranten gemeld dat, Burkholderia cenocepacia werd opgenomen in voedingsbouillon agar 14,15. Agar kralen zou een microanaerobic omgeving te voorzien van essentiële voedingsstoffen beschikbaar voor bacteriële proliferatie van enkelvoudige cellen tot microkolonies 9.
Ademhalingsinspanning is afhankelijk van de verdoving en dosering, en beïnvloedt mortaliteit na operatie. Ketamine in een dosis van 0,1 mg / g lichaamsgewicht andxylazine in een dosis van 0,01 mg / g lichaamsgewicht zijn de optimale keuzes. Ademhaling is normaal wanneer muizen worden geïntubeerd met de katheter en zichtbaar minder diep wanneer de muizen worden geënt door P. aeruginosa agar-kralen. Idealiter de injectie van P. aeruginosa agar-korrels moet langzaam worden uitgevoerd met een optimaal volume van 50 pl. Grotere volumes van 100 ul kan tot verhoogde mortaliteiten grotere moeilijkheden bij muizen herstel. Alle muizen zijn voldoende geïnfecteerd wanneer uitgedaagd door intratracheaal chirurgie.
De P. aeruginosa RP73 agar-bead geïnduceerde chronische longontsteking geeft aan dat in dit model de infectie is pluri-concentratiegebieden en over het algemeen gaat om een of meer longkwabben zonder de hele long. Bijgevolg evaluatie van bacteriële belasting en ontstekingsreactie moet worden uitgevoerd op de totale long uitgevoerd. De analyse van selectieve lobben geen geldige resultaten. Een geïnfecteerde groep muizen worden toegevoegd als een controle en vergeleken met geïnfecteerde muizen om eventuele afwijking in celrecrutering detecteren BAS vloeistof of de histologie van de long door verontreinigingen of fout in de procedure. Dit model werd in een BSL-2 laboratorium met alle laboratorium-personeel moet getraind worden in de juiste vaardigheden voor muis observatie. De muizen werden tweemaal per dag gevolgd voor de volgende parameters: pilo-erectie, houding, Motoriek, ademhaling, nieuwsgierigheid, nasale secretie, verzorging en uitdroging. Muizen die ≥ 20% lichaamsgewicht verloren en bleek het bewijs van ernstige klinische ziekte, zoals sjofele jas, inactiviteit, verlies van eetlust, slechte motoriek, of pijnlijke houding, werden gedood vóór de beëindiging van het experiment. Muizen geïnfecteerd met P. aeruginosa RP73 agar-kralen toonde lagere tekenen van onbehagen binnen drie dagen na infectie in vergelijking met-PAO1 geïnfecteerde muizen. Na dit tijdstip sommige muizen maakte de bacteriën en andere ontwikkelde een stabiele chronische infectie, een looptijd van maximaal 28 dagen.
Wij toonden aan dat het model van chronische infectie wij voorstellen in dit document kan een stabiele P. induceren aeruginosa chronische infectie in muizen. Deze methode is geoptimaliseerd om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ziekteverwekker virulentie en afweer 8,9,16 of voor drugstests van antibacteriële en anti-inflammatoire moleculen 10,11 bestuderen. Thij preklinische validatie van deze verbindingen in geschikte diermodellen noodzakelijk voor toekomstige therapeutische interventies voor longinfecties bij patiënten met CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Onderzoek in BRAGONZI het laboratorium is gefinancierd door de Italiaanse Cystic Fibrosis Stichting (CFaCore) en EU-F7-2009-223670. Een deel van dit werk werd uitgevoerd in ALEMBIC, een geavanceerde microscopie laboratorium, en de muis histopathologie werd uitgevoerd in de eenheid van de pathologische anatomie (San Raffaele Wetenschappelijk Instituut).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
