Summary
Nous décrivons la méthode agar-perles d'établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.
Abstract
Un modèle de souris de l'infection chronique des voies respiratoires est un atout majeur dans la fibrose kystique (FK) la recherche, mais il ya un certain nombre de préoccupations concernant le modèle lui-même. Les premières phases de l'inflammation et de l'infection ont été largement étudiés en utilisant le modèle d'agar-perles souris Pseudomonas aeruginosa, tandis que peu de rapports ont mis l'accent sur l'infection chronique à long terme in vivo. Le principal défi pour l'infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l'épreuve, ce qui indique que les cellules bactériennes sont progressivement effacés par l'hôte.
Cet article présente une méthode pour obtenir une infection chronique efficace à long terme chez la souris. Cette méthode est basée sur l'incorporation de la P. souches cliniques aeruginosa dans l'agar-perles in vitro, suivie par instillation intratrachéale chez les souris C57Bl/6NCrl. Infection pulmonaire bilatérale est associée à plusieurs mesurables lecture-out, y compris la perte de poids, la mortalité, l'infection chronique, et la réponse inflammatoire. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car elle a entraîné une mortalité relativement bas, des lésions plus sévères, et l'infection chronique plus élevé. P. aeruginosa colonisation peut persister dans le poumon pendant plus de trois mois. Pathologie pulmonaire murin ressemble à celle de patients atteints de mucoviscidose avec une maladie pulmonaire chronique avancée.
Ce modèle murin imite plus étroitement le cours de la maladie chez l'homme et peut être utilisé à la fois pour des études sur la pathogenèse et pour l'évaluation de nouvelles thérapies.
Introduction
La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par des mutations dans le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) de gène. Ce gène code pour un canal chlorure exprimé sur la membrane de la plupart des cellules épithéliales. Dilatation des bronches, quantité de mucus et parenchymateuse destruction causée principalement par des infections à Pseudomonas aeruginosa conduit progressivement à une maladie pulmonaire grave et de mortalité dans la plupart des patients atteints de mucoviscidose 1. Comprendre la pathogenèse de la CF et le développement de nouvelles thérapies reposent sur un modèle animal avec caractéristiques de FC. Plusieurs souris, génétiquement modifiées pour le gène CFTR ont été générés, mais limites dans la capacité de ces espèces de récapituler les maladies pulmonaires CF-comme et plusieurs autres anomalies des organes observés chez les patients CF ont été largement documentés 2.
Développement de l'infection est l'un des défis majeurs dans le modèle animal FC. Les cl de la littératuresuggère que tôt une infection chronique durant plus d'un mois peut être atteint que si les souris sont inoculés avec des bactéries incorporées dans un agent d'immobilisation tels que l'agar, agarose, ou algues alginate 3-5. Ces agents immobilisants fournissent les conditions microaérobie / anaérobies qui permettent aux bactéries de se développer sous la forme de microcolonies, de façon similaire à la croissance dans le mucus de patients atteints de mucoviscidose 6. Ce modèle de l'infection chronique conduit à la persistance de la bactérie dans les poumons, causant une inflammation des voies respiratoires et des dommages 7. Toutefois, en fonction de la méthode utilisée, la souche bactérienne et la dose inoculée dans les poumons, le pourcentage de souris infectées chroniques et la charge bactérienne dans les poumons récupéré à différents points dans le temps peuvent varier considérablement. En particulier, le principal défi pour l'infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l'épreuve, indiquant thacellules bactériennes sont progressivement effacés t par l'hôte. En sélectionnant le P. aeruginosa RP73 souche clinique d'une collection de FC isole 8 nous avons obtenu avec succès une faible mortalité, des lésions plus sévères, et le pourcentage élevé d'infection chronique avec une charge bactérienne stable jusqu'à un mois chez la souris C57Bl/6NCrl.
Ce document détaille la méthodologie pour intégrer P. aeruginosa dans les billes d'agar-agar, nous avons des souris infectées par instillation intratrachéale, mesuré la charge bactérienne et des cytokines dans les poumons, recueillies LBA et effectué un examen histologique. Dans l'ensemble, ce protocole aidera les chercheurs à répondre à des questions d'une importance fondamentale sur la pathogenèse 8,9 et de tester de nouvelles thérapies contre P. aeruginosa infection chronique 10,11.
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Protocol
Une. Préparer les bactéries Infection chronique (trois et deux jours avant souris Challenge)
- Sélectionnez le P. approprié aeruginosa souche à tester.
- Inoculer une anse de P. aeruginosa d'un -80 ° C culture mère à une plaque Trypticase Soy Agar (TSA) et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Choisissez une seule colonie et inoculer dans 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) dans un tube de 15 ml enfichable plafonné et incuber à 37 ° C pendant une nuit dans un incubateur à agitation à 200 rpm.
2. Intégrer les bactéries dans les perles Agar pour l'infection chronique (un jour avant l'infection)
- Prendre une petite aliquote de culture d'une nuit de bactéries, dilué à 1:50 dans du tampon phosphate salin (PBS) et mesurer la densité optique (DO) à 600 nm.
- Diluer la culture bactérienne nuit en ajoutant 2 OD dans un nouveau tube de pression coiffé contenant 20 ml de TSB frais.
- Incuber à 37 ° C pendant environ 3 -4 h à identifier la phase dans un incubateur à agitation à 200 rpm, jusqu'à un total de 10-15 OD est atteint.
- Entre-temps, préparer la TSA, TSB faite avec de 1,5% d'agar, dans un autoclave et équilibrer à 50 ° C dans un bain d'eau. Equilibrer 150 ml de preautoclaved huile minérale lourde dans un erlenmeyer à 50 ° C dans un bain d'eau.
- Une fois P. aeruginosa atteint la phase de journal, de recueillir les cellules bactériennes par centrifugation à 2700 g pendant 15 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot bactérien dans 1 ml de PBS stérile et à fond vortex pour remettre en suspension le culot totalement.
- Mélanger 1 ml de suspension bactérienne avec 9 ml de TSA liquide pré-équilibré à 50 ° C.
- Ajouter les 10 ml TSA-P. aeruginosa mélange à l'huile minérale lourde (préchauffé à 50 ° C) et immédiatement en remuant pendant 6 min à température ambiante. L'agitation doit produire un vortex visible dans l'huile.
- Refroidir le mélange à 4 ° C, sous agitation au minimum spEED pendant 35 min (Figure 1).
- Placez le mélange agar-perles d'huile dans la glace pendant 20 minutes supplémentaires.
- Transférer l'agar-perles en tubes de 50 ml Falcon et centrifuger à 2700 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Enlever précision huile minérale et laver avec du PBS stérile six fois, comme décrit à l'étape 2.11. Après trois lavages, les billes peuvent être rassemblées en un culot par gravité au lieu d'utiliser la centrifugeuse. Après le dernier lavage, remettre en suspension les perles d'agar-20 à 30 ml dans du PBS.
- Prélever une partie aliquote des billes (environ 0,5 ml) et d'homogénéiser de façon aseptique.
- Prenez 100 pi de perles homogénéisés et diluer dans 900 pi de PBS stérile. Diluer en série 01:10 jusqu'à 10 -6.
- Plate dilution en série sur des plaques de TSA, y compris un échantillon non dilué jusqu'à 10 -6 et incuber les plaques à 37 ° C.
- Mesurer le diamètre de bourrelet à l'aide d'un microscope optique inversé dans plusieurs domaines. Le diamètre du cordon doit être comprise entre 100-200 um (
- Stocker les perles nuit à 4 ° C.
Figure 1. Vue d'ensemble de la préparation de billes et de la souris infection agar. P. aeruginosa cellules sont remises en suspension dans 1 ml de PBS et on a ajouté à 9 ml de TSA liquide (50 ° C). Ce mélange est ajouté à 150 ml d'huile minérale lourde, à 50 ° C dans un ballon et on agite à grande vitesse pendant 6 min à température ambiante. Lorsque le ballon est refroidi à 4 ° C avec une agitation lente pendant 35 min, la gélose se solidifie créer des perles, et les bactéries présentes dans le mélange sont incorporés dans les perles d'agar-agar. Détail d'un bourrelet de gélose contenant des cellules bactériennes est signalée (A). Après avoir retiré l'huile minérale avec plusieurs lavages à l'aide de PBS stérile, la suspension d'agar-perles est prêt fou l'inoculation dans les poumons de souris par une injection intra-trachéale (B). Cliquez ici pour agrandir l'image .
3. Souris Défi avec l'agar-perles
Déclaration éthique: ce protocole et d'expérimentation suivent les directives du comité de protection des animaux et de l'éthique de l'Institut scientifique San Raffaele.
- Comptez le nombre d'unités formant colonie (UFC) sur les plaques de TSA pour déterminer le nombre de CFU / ml dans la suspension d'agar-billes. Diluer l'agar-perles avec du PBS stérile à 2-4 x 10 7 UFC / ml pour atteindre un inoculum optimale de 1-2 x 10 6 à 50 pi.
- Anesthésier C57Bl/6NCr (20 à 22 g, âgées de 6-8 semaines) chez la souris mâle avec de la kétamine (50 mg / ml) et de xylazine (5 mg / ml) dans du NaCl à 0,9% sont administrés à un volume de 0,002 ml / g de poids corporel par injection intra-péritonéale.
NOTE: L'anesthésie est considérée ADEQluer lorsque l'animal reste toujours tranquillement, est insensible aux stimuli externes, et a coeur et taux respiratoires. - Placez la souris en position couchée. Désinfecter le manteau de la souris avec 70% d'éthanol.
- Exposer la trachée par une coupe verticale de la peau et intuber la trachée avec un stérile, souple 22 G 0,9 mm x 25 mm cathéter IV, maintenir l'attention de retirer le stylet tout en se déplaçant vers le bas dans la trachée. Insérer le cathéter n'est pas trop profondément dans la trachée. S'arrêter avant de la carène (bifurcation).
- Prendre immédiatement un volume de 50 ul de la suspension de billes d'agar par une seringue de 1 ml et l'attacher au cathéter. Poussez doucement le piston de la seringue, permettant aux perles à implanter dans le poumon. Fermer l'incision en utilisant des agrafes.
- Placez l'animal sur un coussin chauffant jusqu'à ce que complètement réveillé.
4. Évaluation de souris
- Respecter les souris quotidiennement les signes cliniques, y compris la qualité de la robe, de la posture,marche, et l'état d'hydratation. Surveiller le poids corporel par jour. Les souris qui perdent ≥ 20% du poids corporel doivent être euthanasiés.
- Suivez le point 5 de la collecte de fluide lavage broncho-alvéolaire (LBA) et les points 6 ou 7 pour la collecte des poumons et de l'analyse sur un total de CFU, l'analyse histologique, la réponse inflammatoire en termes de nombre total et différencié cellule de la BAL, l'analyse des cytokines, et la myéloperoxydase (MPO).
5. BAL Collecte et analyse des fluides
- Euthanasier les souris par inhalation de CO 2.
- Placez la souris en position couchée. Désinfecter le manteau de la souris avec 70% d'éthanol.
- Exposer la trachée et de la cage thoracique par une coupe verticale de la peau. Exposer les poumons en coupant le diaphragme.
- Insérez un fil de suture dans la trachée en utilisant des pinces et intuber la trachée avec un stérile, souple 22 g 0,9 mm x 25 mm cathéter IV. Tirez les deux extrémités du fil de suture pour lier le catheter de la trachée et de nouer le fil autour de la trachée.
- Prélever un volume de 1 ml de RPMI 1640 en utilisant une seringue de 1 ml et l'attacher au cathéter. Poussez le piston de la seringue pour laver les poumons et récupérer immédiatement le liquide, le stocker dans un tube de 15 ml.
NOTE: Si les cytokines doivent être analysés, ajouter des inhibiteurs de protéase à RPMI 1640. - Répéter cette étape trois fois avec un total de 3 ml de milieu RPMI. A partir de maintenant, stocker le liquide de LBA sur la glace. Passez à l'étape 6 pour la collecte et l'analyse des poumons.
NOTE: S'il vous plaît noter que pas tout le liquide seront récupérés (2,8 ml maximum). - Pour la quantification des bactéries présentes dans le fluide de BAL, prélever une petite aliquote (300 pi), en série, diluer 1:10 dans du PBS stérile, plaque sur des plaques de TSA et incuber à 37 ° C pendant une nuit.
- Compter les cellules totales en utilisant un microscope optique inversé lumière diluant une partie aliquote du fluide BAL 1:02 avec une solution Tuerk dans une chambre de comptage de cellules Burker.
- Centrifuger le remaining LBA à 330 g pendant 8 min à 4 ° C. Prendre le surnageant pour l'analyse ELISA de cytokines, stocker à -80 ° C. Suivez les étapes 5.10 à 5.13 pour le nombre de cellules écart par cytospin.
- Si la pastille est rouge, lyser les erythrocytes de remettre en suspension le culot dans 250 à 300 pi de tampon de lyse RBC dilués à 1:10 dans de l'eau distillée ultra pure pendant 3 min. Neutraliser avec 2 ml de PBS et centrifuger à 330 g pendant 8 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans du milieu RPMI 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Utiliser un volume qui fournira 1 x 10 6 cellules / ml, sur la base du nombre total de cellules.
- Placer des lames de microscope et des filtres dans des fentes appropriées dans la cytospin avec les filtres en carton faisant face au centre de la cytospin. Introduire à la pipette 150 ul de chaque échantillon dans les puits appropriés de la cytospin et centrifuger dans un cytocentrifugeuse à 300 g pendant 5 min.
- Colorer les lames par Romanowsky coloration utilisant un kit commercial, selon le males instructions tion du fabricant et comme décrit précédemment 12. Suivez les étapes 5.14 à 5.17 pour MPO analyse de l'activité.
- Centrifuger le volume restant de BAL à 380 xg pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 250 pl de chlorure Hexadecyltrimethylammonium à 0,5% dans de l'eau distillée ultra pure pour lyser les cellules. La suspension peut être congelé à -20 ° C pendant plusieurs jours avant de réaliser le dosage.
- Centrifuger à 16 000 g pendant 30 min à 4 ° C et en utilisant le surnageant pour effectuer dosage MPO dans des plaques à 96 puits, ajouter l'échantillon en double exemplaire dans chaque puits et, si nécessaire, également des dilutions appropriées de l'échantillon.
- Ajouter à chaque échantillon dans les puits un volume égal de 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) comme substrat pour la peroxydase. Laisser la réaction doit se faire dans l'obscurité pendant au moins 5 minutes et jusqu'à ce que il n'y a plus développement de la couleur.
- Arrêter la réaction en ajoutant 2 MH 2 SO 4 and mesurer la DO à 450 nm. La valeur de DO sera directement proportionnelle à l'activité de la peroxydase.
6. Mesure de la charge bactérienne dans les poumons et de cytokines analyse
- Immédiatement après le prélèvement de fluide BAL, poumons d'accise de la souris, les rincer dans du PBS stérile, lobes distincts, les mettre dans un tube à fond rond avec 2 ml de PBS stérile et stocker sur la glace.
NOTE: Si cytokines sont à analyser, ajouter des inhibiteurs de protease à du PBS pour les tubes. - Homogénéiser aseptique poumons, prendre une petite aliquote (300 pi) de l'homogénat, série diluer 1:10 dans PBS, plaque sur des plaques de TSA et incuber à 37 ° C pendant la nuit. S'il vous plaît noter que la charge bactérienne des voies aériennes totale sera la somme des CFU trouvés dans le fluide BAL et les poumons.
- Centrifuger l'homogénat à 16 000 xg restant pendant 30 min à 4 ° C. Prenez le surnageant pour ELISA analyse des cytokines, et conserver à -80 ° C.
7. L'examen histologique
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Representative Results
Lorsque le protocole est fait correctement, le P. aeruginosa agar-perles mesurent entre 100-200 um et peuvent être observés avec un microscope optique inversé par aspiration un petit volume de la suspension d'agar-perles sur une diapositive. Des cellules bactériennes individuelles peuvent être consultées dans les perles d'agar-agar, comme représenté en détail sur la figure 1.
Le choix de P. aeruginosa souche utilisée dans la préparation d'agar-billes est critique. figure 2 et le tableau 1 montrent les données obtenues à la suite de l'infection de souris avec P. souche de laboratoire de référence aeruginosa PAO1 rapport à RP73 isolat clinique. La mortalité, observé au cours des 3 premiers jours de l'infection, est faible pour les deux souches, mais plus élevée pour PAO1 (figures 2A et 2B). Des différences considérables en termes de pourcentage de l'infection chronique chez les souris survivantes peuvent être observées entre les souris exposées pao1 et RP73. While à 3 jours après l'infection, les souris étaient encore infectés à la fois par P. souches aeruginosa, après ce point dans le temps certaines souris effacées les bactéries et d'autres ont développé une infection chronique stable. De 7 jours au-delà Le pourcentage de souris chroniquement infectées est resté stable jusqu'à 28 jours pour les deux souches. PAO1 conduit à l'infection chronique chez un pourcentage de souris qui varie entre 20 à 27,8% (figure 2A), tandis que pour le RP73 pourcentage était de 75 à 87,1% (figure 2B), ce qui indique que le P. aeruginosa souche clinique était plus efficace dans l'établissement d'une infection chronique par rapport à la souche de laboratoire de PAO1. Les nombres de bactéries à 3 jours post-infection étaient plus élevés pour PAO1 (5 x 10 7 CFU / poumon) (figure 2C et le tableau 1) par rapport à RP73 (1,3 x 10 6 UFC / poumon) (figure 2D), puis de 7 jours partir, lorsque l'infection chronique a été établie, la charge bactérienne se stabilise entre 10 <sup> 4 et 10 5 UFC / poumon pour les deux souches. Une fois l'infection chronique est établi, le nombre de CFU / poumon ne change pas de manière significative plus d'un mois. En outre, la charge bactérienne dans les voies respiratoires est similaire chez les souris infectées avec différentes souches bactériennes 9,13.
Autres lu-out, y compris la réponse inflammatoire de l'hôte et de l'histopathologie, peuvent être mesurés à différents points dans le temps du défi. Figure 3 montre la réponse inflammatoire en termes de recrutement des leucocytes dans le liquide de BAL de la souris 7 jours de défi avec P. souche clinique aeruginosa RP73 noyé dans agar-billes. RP73-souris infectées ont été comparées à des souris non infectées. Numération cellulaire différentielle compris les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes. Le nombre de cellules totales est nettement plus élevée chez les souris infectées par RP73 rapport à des souris non infectées. Les neutrophiles, en particulier presque totalement absent dans le fluide BAL de souris non infectées, ont été les plus represented type cellulaire chez des souris infectées par RP73, ce qui indique une réponse considérable par le système immunitaire innée à l'infection chronique.
L'analyse histopathologique des poumons de souris, une infection chronique à P. aeruginosa RP73, montre que l'infection est pluri-focal. Figures 4C et 4F montrent un lobe qui est plus complexe que les autres lobes qui sont affectés ou marginalement impliqués (figures 4B et 4E). Les perles peuvent être observés en lumière bronchique et des microcolonies de cellules bactériennes peuvent être consultées dans les bourrelets (figures 4C et 4F). Histopathologie pulmonaire dans les zones concernées par l'infection a montré des lésions inflammatoires dans les bronches et dans le parenchyme pulmonaire. Les bronches étaient remplies par une inflammation des neutrophiles massif entourant les perles, alors que le parenchyme a été infiltrée par les macrophages, les lymphocytes et des neutrophiles. Histologie deune souris non infectées a été utilisé comme témoin, à la fois parenchyme et les bronches étaient claires à partir de cellules inflammatoires (figures 4A et 4D).
Figure 2. Évolution dans le temps de P. aeruginosa infection chronique avec la souche de référence du PAO1 et RP73 souche clinique. C57BL/6NCrl (20-22 g) des souris mâles ont été infectées par injection intra-trachéale avec de 1 à 5 x 10 6 UFC de P. aeruginosa souche PAO1 (A et C) ou RP73 (B et D) noyés dans de la gélose-billes. Pour chaque point, les histogrammes représentent le pourcentage de mortalité induite par la bactériémie (rouge) et la survie (gris) ou le pourcentage d'animaux qui a autorisé l'infection (blanc) et ceux qui sont capables d'établir une infection chronique (vert) (A et B). Les souris survivantes ont été euthanasiées au niveau des points de temps indiqués, et les poumons ont été récoltés, homogénéisés, et mis en culture sur des plaques de TSA pour déterminer la charge bactérienne. Les courbes de la PAO1 RP73 et les tensions sur les poumons murins progression sont exprimés (C et D). Les points représentent les mesures individuelles et les lignes horizontales représentent les valeurs médianes. La signification statistique par le test de Fisher est indiqué: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Tableau 1. Évolution dans le temps de P. aeruginosainfection chronique avec la souche de référence de PAO1 et RP73 souche clinique. Les pourcentages de mortalité et d'infection chronique de la souris et le nombre d'UFC par poumon (médiane) infectés pao1 et RP73 sont présentés. Les valeurs sélectionnées sont de 2-4 expériences différentes. N, non. mise en commun des souris analysées pour chaque condition. La signification statistique par le test de Fisher est indiqué: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Evaluation de l'inflammation dans le fluide BAL après 7 jours de l'infection chronique par RP73 souche clinique. (A) Le graphique montre le contenu du total desdes leucocytes, des neutrophiles et des monocytes / macrophages récupérés dans le fluide BAL de souris RP73 chroniquement infectée après 7 jours de défi par rapport à des souris non infectées (témoin). Les valeurs moyennes et les SEM sont représentés. (B) Dans la zone ci-dessous flèches indiquent les neutrophiles et un macrophage comme on le voit dans un endroit sur une lame après cytospin. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Hématoxyline et éosine sur des coupes histologiques de poumon après 7 jours de l'infection chronique avec RP73 souche clinique. Le panneau montre l'hématoxyline et éosine de sections de poumon de souris non infectées (A et D) et des souris CHALLENGed avec agar-billes contenant RP73 (B, C, E, F). L'infection est pluri-focal et implique généralement un ou plusieurs lobes pulmonaires (C et F), tandis que les autres ne sont pas affectées ou faiblement impliqué (B et E). Les flèches indiquent les perles d'agar-agar déposés dans la lumière bronchique (b). Lignes (A, B, C) 250 um; lignes. (D, E, F) 100 um Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Les étapes essentielles de la P. aeruginosa-perles préparation et le défi de la souris sont présentés ci-dessous.
La souche de P. aeruginosa utilisé pour les souris défi est critique. La mortalité, une infection chronique ou clairance peuvent différer sensiblement en fonction de la souche bactérienne utilisée pour le défi. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car elle a entraîné une mortalité relativement bas, des lésions plus sévères, et l'infection chronique plus élevé. Le dépistage des drogues dans les études précliniques doit être effectuée avec P. souches aeruginosa sélectionnées pour leur grande efficacité dans l'établissement de l'infection chronique à long terme. Cela réduit le nombre de souris qui sont compatibles avec les exigences de validation scientifique et l'analyse statistique 10,11.
L'individu P. aeruginosa préparations agar-perles varient en taille et en CFU / ml. Un unediamètre mo yen de 150 pm avec 2 x 10 7 CFU / ml est considéré comme optimal. la taille de la perle est affectée par la vitesse d'agitation au cours de la phase de refroidissement (étape 2.9). Perles agitation à la vitesse supérieure sont petites et sphérique (<50 pm) tandis que ceux agité sont très lentement grand et amorphe (> 1 mm). En outre, lorsque la dilution finale du challenge est prêt, perles avec une charge bactérienne faible peuvent être collante tandis que ceux avec une charge bactérienne élevée peut être dilué trop. Inoculation des souris avec des perles collantes est associée à une forte mortalité due à des souris étouffement peu après défi, tout en perles dilué trop peuvent entraîner une absence d'infection chronique. Le volume optimal de l'injection intra-trachéale est de 50 pi, mais la hausse des volumes allant jusqu'à 100 pi peut être inoculé. Différences de mortalité ou d'infection chronique de souris sont rarement observés lorsque la dose inoculée est comprise entre 5 x 10 5 et 5 x 10 6 UFC / souris.
CRÉDITSe milieu de croissance bactérienne doit être utilisé pour la formation des perles de gélose. Dans ce cas, P. aeruginosa a été intégré dans le CST, d'autres documents ont indiqué que, Burkholderia cenocepacia a été inclus dans le bouillon gélose nutritive 14,15. Perles agar devraient fournir un environnement microanaerobic avec des nutriments essentiels disponibles pour la prolifération bactérienne de cellules individuelles à microcolonies 9.
Effort respiratoire diffère en fonction de la dose utilisée et l'anesthésie, et affecte la mortalité après chirurgie. La kétamine à une dose de 0,1 mg / g de poids corporel andxylazine à une dose de 0,01 mg / g de poids corporel sont les meilleurs choix. La respiration est normale lorsque les souris sont intubés avec le cathéter et visiblement réduite lorsque les souris sont inoculées par P. aeruginosa agar-billes. Idéalement, l'injection de P. aeruginosa agar-perles doivent être effectuées lentement avec un volume optimal de 50 pi. La hausse des volumes allant jusqu'à 100 pi pourraient entraîner une mortalité plus élevéeet de plus grandes difficultés dans la récupération souris. Toutes les souris sont infectées de manière adéquate en cas de contestation par la chirurgie intra-trachéale.
Le P. RP73 aeruginosa agar pneumonie chronique induite bourrelet indique que, dans ce modèle, l'infection est pluri-focal et fait intervenir un ou plusieurs lobes pulmonaires sans compromettre l'ensemble du poumon en général. Par conséquent, l'évaluation de la charge bactérienne et la réponse inflammatoire doit être effectuée sur pulmonaire totale. L'analyse des lobes sélectifs ne produit pas de résultats valables. Un groupe non infecté des souris devrait être ajoutée comme un contrôle et par rapport à des souris infectées afin de détecter toute anomalie potentielle dans le recrutement des cellules dans le liquide de LBA ou dans l'histologie du poumon en raison de contaminations ou erreur dans la procédure. Ce modèle a été créé dans un laboratoire BSL-2 avec l'ensemble du personnel de laboratoire devraient être formés dans les compétences appropriées pour l'observation de la souris. Les souris ont été contrôlées deux fois par jour pour les paramètres suivants: horripilation, attitude, La locomotion, la respiration, la curiosité, la sécrétion nasale, le toilettage et la déshydratation. Les souris qui ont perdu ≥ 20% du poids corporel et présentant des signes de maladie clinique grave, comme le manteau miteux, l'inactivité, perte d'appétit, mauvaise locomotion, ou posture douloureuse, ont été euthanasiés avant la fin de l'expérience. Souris infectées par P. aeruginosa RP73 agar-perles ont montré des signes d'inconfort inférieurs dans les trois jours de l'infection par rapport à des souris infectées pao1. Après ce point du temps des souris effacées les bactéries et d'autres ont développé une infection chronique stable, pouvant durer jusqu'à 28 jours.
Nous avons démontré que le modèle de l'infection chronique, nous proposons dans cet article est capable d'induire une écurie P. aeruginosa infection chronique chez la souris. Cette méthode a été optimisé pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la virulence de l'agent pathogène et défense de l'hôte 8,9,16 ou pour le dépistage des drogues de molécules antibactériennes et anti-inflammatoires 10,11. Til validation préclinique de ces composés dans des modèles animaux appropriés est essentiel pour les futures interventions thérapeutiques pour les infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Recherche dans le laboratoire de Bragonzi a été financé par la Fondation italienne de la fibrose kystique (CFaCore) et de l'UE-F7-2009-223670. Une partie de ce travail a été réalisé dans ALEMBIC, un laboratoire de microscopie de pointe, et l'histopathologie de la souris a été réalisée dans l'Unité d'anatomie pathologique (San Raffaele Scientific Institute).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
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- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
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