Summary
Wir beschreiben die Agar-Perlen Methode, um anhaltende langfristige chronische Pseudomonas aeruginosa-Infektion der Atemwege im Mausmodell zu etablieren.
Abstract
Ein Maus-Modell der chronischen Atemwegsinfektion ist ein Schlüsselfaktor bei zystischer Fibrose (CF)-Forschung, obwohl es eine Reihe von Bedenken in Bezug auf das Modell selbst. Frühen Phasen der Entzündung und Infektion wurden weitgehend mit Hilfe der Pseudomonas aeruginosa-Agar-Perlen Maus-Modell untersucht, während nur wenige Berichte über die langfristige chronische Infektion in vivo konzentriert. Die größte Herausforderung für langfristige chronische Infektion bleibt die geringe Keimbelastung von P. aeruginosa und der geringe Anteil der infizierten Mäuse Wochen nach der Herausforderung, die anzeigt, dass Bakterienzellen werden nach und nach durch den Host gelöscht.
Dieser Beitrag stellt eine effiziente Methode zur Gewinnung von langfristigen chronischen Infektion bei Mäusen. Dieses Verfahren basiert auf der Einbettung des P. basierend aeruginosa klinischen Stämmen in den Agar-Perlen in vitro, gefolgt von Intratrachealbiopersistenztest in C57Bl/6NCrl Mäusen. Bilaterale Lungenentzündung ist mit meh verbundenBundes messbare Lese-outs einschließlich Gewichtsverlust, Sterblichkeit, chronische Infektion und entzündliche Reaktion. Die P. aeruginosa RP73 klinischen Stamm wurde über die PAO1 Referenzlaborstamm bevorzugt, da es zu einer vergleichsweise niedrigeren Sterblichkeit, mehr schwere Läsionen und höher chronischen Infektion. P. aeruginosa Besiedlung kann in der Lunge mehr als drei Monate andauern. Murine Lungenpathologie ähnelt dem von CF-Patienten mit fortgeschrittener chronischer Lungenerkrankung.
Dieses Mausmodell meisten imitiert den Verlauf der Krankheit beim Menschen und kann sowohl für Studien über die Pathogenese und für die Bewertung neuer Therapien verwendet werden.
Introduction
Cystische Fibrose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch Mutationen in der Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR)-Gen verursacht. Dieses Gen kodiert für ein Chlorid-Kanal auf der Membran der meisten Epithelzellen exprimiert. Bronchiektasen, Schleim-Plugging und Parenchymdestruktion hauptsächlich verursacht durch Pseudomonas aeruginosa-Infektionen zunehmend zu schweren Lungenerkrankungen und Sterblichkeit in den meisten CF-Patienten ein zu führen. Understanding CF Pathogenese und Weiterentwicklung neuer Therapien stützen sich auf Tiermodell mit charakteristischen Merkmalen des CF. Mehrere Mäuse, die genetisch für das CFTR-Gen modifiziert wird, erzeugt worden sind, aber Einschränkungen in der Fähigkeit dieser Spezies CF artige Lungenerkrankungen und mehrere andere Organ Anomalien bei CF-Patienten gesehen rekapitulieren wurden weitgehend dokumentiert 2.
Entwicklung der Infektion ist eine der großen Herausforderungen in der CF-Tiermodell. Die Literatur clfrühen legt nahe, dass eine chronische Infektion, die länger als einen Monat kann nur erreicht werden, wenn Mäuse mit Bakterien in einem Immobilisierungsmittel eingebettet, wie Agar, Agarose, Alginat oder Algen 3-5 geimpft werden. Diese Immobilisierungsmittel bieten die mikroaerobe / anaeroben Bedingungen, die Bakterien in der Form von Mikrokolonien ähnlich dem Wachstum in den Schleim von CF-Patienten 6 zu halten, zu erlauben. Dieses Modell der chronischen Infektion führt zur Persistenz der Bakterien in den Lungen verursacht Atemwegsentzündung und Schäden 7. Abhängig von der verwendeten Methode, der Bakterienstamm und die Dosis in die Lunge eingeimpft, der Prozentsatz der chronischen infizierten Mäusen und die Keimbelastung in der Lunge zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen erheblich abweichen. Insbesondere die größte Herausforderung für die langfristige chronische Infektion bleibt die geringe Keimbelastung von P. aeruginosa und der geringe Anteil der infizierten Mäuse Wochen nach dem Challenge, was that Bakterienzellen werden nach und nach durch den Host gelöscht. Durch die Auswahl der P. aeruginosa RP73 klinischen Belastung aus einer Sammlung von CF-Isolate 8 wir niedrige Sterblichkeit, mehr schwere Läsionen und hoher Prozentsatz der chronischen Infektion erfolgreich erhalten mit einer stabilen Bakterienbelastung bis zu einem Monat in C57Bl/6NCrl Mäusen.
Dieses Papier beschreibt die Methode für die Einbettung von P. aeruginosa in den Agar-Perlen, wir haben Mäusen durch Intratrachealbiopersistenztest infiziert, die bakterielle Belastung gemessen und Zytokine in Lunge, gesammelt BAL und histologische Untersuchung durchgeführt. Insgesamt wird dieses Protokoll Forscher bei der Behandlung grundlegend wichtige Fragen zur Pathogenese 8,9 und Prüfung neuer Therapien gegen P. unterstützen aeruginosa chronische Infektion 10,11.
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Protocol
1. Vorbereiten Bakterien für chronische Infektion (drei und zwei Tage vor der Challenge-Maus)
- Wählen Sie die entsprechende P. aeruginosa-Stamm getestet werden.
- Impfen eine Öse P. aeruginosa von einer -80 ° C lager Kultur zu einer Trypticase Soy Agar (TSA) Platte und bei 37 ° C über Nacht.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen zu 5 ml Trypticasesojabrühe (TSB) in einem 15 ml-Snap-Röhrchen und bei 37 ° C über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute.
2. Einbetten Bakterien in Agar-Perlen für chronische Infektion (einen Tag vor der Infektion)
- Einen kleinen Aliquot der bakteriellen Übernachtkultur, verdünnt 1:50 phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Messen der optischen Dichte (OD) bei 600 nm auf.
- Verdünnt das Nacht-Bakterienkultur durch Zugabe von 2 OD in einer neuen Rast Röhrchen mit 20 ml frischem TSB.
- Inkubieren bei 37 ° C für ca. 3 -4 h auf Phase in einem Schüttelinkubator bei 200 UpM einloggen, bis insgesamt 10-15 OD erreicht wird.
- In der Zwischenzeit bereiten die TSA, TSB mit 1,5% Agar, Autoklaven und ins Gleichgewicht bei 50 ° C in einem Wasserbad. Ins Gleichgewicht 150 ml preautoclaved schweres Mineralöl in einem Erlenmeyerkolben bei 50 ° C in einem Wasserbad.
- Nachdem P. aeruginosa erreicht die Log-Phase, sammeln die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2.700 g für 15 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 ml steriler PBS und gründlich vortexen, um das Pellet vollständig zu suspendieren.
- Mischen 1 ml Bakteriensuspension mit 9 ml flüssiger TSA bei 50 º C voräquilibriert
- Fügen Sie die 10 ml TSA-P. aeruginosa Mischung auf schweres Mineralöl (bei 50 ° C vorgewärmt) und sofort rühren für 6 min bei Raumtemperatur. Die Bewegung muss einen sichtbaren Wirbel in der Öl zu produzieren.
- Die Mischung wurde auf 4 ° C, Rühren bei minimalen spEED für 35 min (Abbildung 1).
- Legen Sie das Agar-Perlen-Öl-Gemisch in Eis für weitere 20 min.
- Übertragen Sie die Agar-Perlen in 50 ml Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 2700 g für 15 min bei 4 ° C
- Genau zu entfernen Mineralöl und Waschen mit sterilem PBS sechsmal, wie in Schritt 2.11 beschrieben. Nach drei Waschschritten, können die Kügelchen durch Schwerkraft statt der Verwendung der Zentrifuge pelletiert werden. Nach dem letzten Wasch, resuspendieren Agar-Perlen in 20-30 ml PBS.
- Einen aliquoten der Perlen (ca. 0,5 ml) und aseptisch homogenisieren.
- Nehmen Sie 100 ul der homogenisierten Perlen und in 900 ul sterilem PBS verdünnen. Serienmäßig 1:10 verdünnen auf 10 -6.
- Plattenverdünnungs auf TSA-Platten, einschließlich unverdünnten Probe auf 10 -6 und Inkubation Platten bei 37 ° C
- Messen Sie den Kugeldurchmesser mit einem inversen Lichtmikroskop in mehreren Bereichen. Der Kugeldurchmesser muss zwischen 100-200 um sein (
- Bewahren Sie die Perlen über Nacht bei 4 ° C
Fig. 1 ist. Übersicht der Agar Perlen Vorbereitung und Maus-Infektion. P. aeruginosa-Zellen werden in 1 ml PBS resuspendiert und zu 9 ml Flüssigkeit TSA (50 ° C). Diese Mischung wird auf 150 ml schweres Mineralöl bei 50 ° C in einen Kolben gegeben und bei hoher Geschwindigkeit für 6 min bei Raumtemperatur gerührt. Wenn der Kolben wird auf 4 ° C mit einer langsamen Rühren für 35 min abgekühlt, verfestigt sich das Agar Schaffung Perlen, und in der Mischung vorhandenen Bakterien werden in den Agar-Kügelchen eingebettet. Detail einer Agar Wulst enthält Bakterienzellen (A) gezeigt. Nach Entfernen des Mineralöls mit mehrmaligem Waschen mit sterilem PBS, bereit f die Agar-Kügelchen-Suspensionoder Impfung in den Lungen von Mäusen eine intratracheale Injektion (B). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Mäuse Herausforderung mit Agar-Perlen
Ethikerklärung: Dieses Protokoll und Experimentieren an die Richtlinien von der Tierpflege und-Ethik-Kommission von San Raffaele Scientific Institute.
- Die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (CFU) auf die TSA-Platten, die Anzahl der CFU / ml in dem Agar-Kügelchen-Suspension zu bestimmen. Verdünnen Sie die Agar-Perlen mit sterilem PBS auf 2-4 x 10 7 CFU / ml, um eine optimale Inokulum von 1-2 x 10 6 in 50 ul erreichen.
- Betäuben C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 Wochen alt) männliche Mäuse mit Ketamin (50 mg / ml) und Xylazin (5 mg / ml) in 0,9% NaCl zu einem Volumen von 0,002 ml / g Körpergewicht verabreicht intraperitoneale Injektion.
HINWEIS: Anästhesie wird als ADEQUate, wenn das Tier bleibt immer noch ruhig, reagiert nicht auf äußere Reize, und eine konstant Herz-und Atemfrequenz. - Platzieren Sie die Maus in Rückenlage. Desinfizieren Sie den Mantel der Maus mit 70% Ethanol.
- Setzen Sie die Luftröhre durch einen vertikalen Schnitt der Haut und Intubation der Luftröhre mit einer sterilen, flexible 22 G 0,9 mm x 25 mm IV-Katheter, halten die Aufmerksamkeit auf das Stilett entfernen während der Bewegung nach unten in die Luftröhre. Legen Sie den Katheter nicht zu tief in die Luftröhre. Stopp vor dem Erreichen der carina (Bifurkation).
- Nehmen Sie sofort ein Volumen von 50 ul Agar-Bead-Suspension mit einer 1-ml-Spritze und befestigen es an dem Katheter. Schieben Sie den Kolben der Spritze, so dass die Perlen in die Lunge implantiert werden. Schließen Sie den Schnitt mit Wundklammern.
- Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, bis ganz wach.
4. Mäuse Bewertung
- Beachten Sie die Mäuse täglich auf klinische Zeichen einschließlich der Fellqualität, Körperhaltung,Gehfähigkeit und Flüssigkeitsstatus. Überwachung der täglichen Körpergewicht. Mäuse, die ≥ 20% des Körpergewichts verlieren, müssen eingeschläfert werden.
- Folgen Sie Punkt 5 für die Sammlung der bronchoalveolären Lavage (BAL) und 6 oder 7 Punkte für die Sammlung der Lunge und der Analyse der Gesamt CFU, histologische Analyse, entzündliche Reaktion im Bereich der Gesamt-und Differential-Zellzahl in der BAL, Zytokin-Analyse und Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität.
5. BAL Fluid-Sammlung und Analyse
- Euthanize die Mäuse durch CO 2-Inhalation.
- Platzieren Sie die Maus in der Rückenlage. Desinfizieren Sie den Mantel der Maus mit 70% Ethanol.
- Aussetzen sowie die Trachea Brustkorbs durch einen vertikalen Schnitt der Haut. Expose der Lunge durch Schneiden der Membran.
- Setzen Sie einen Faden unter der Luftröhre mit einer Pinzette und Intubation der Luftröhre mit einer sterilen, flexible 22 g 0,9 mm x 25 mm IV-Katheter. Ziehen Sie die beiden Enden des Fadens Thread, um die ca. bindentheter zu der Trachea und verknoten den Faden um die Luftröhre.
- Nehmen Sie ein Volumen von 1 ml RPMI 1640 mit einer 1-ml-Spritze und befestigen es an dem Katheter. Drücken Sie den Kolben der Spritze, um die Lungen zu waschen und sofort wieder die Flüssigkeit, Speichern in einer 15 ml Tube.
HINWEIS: Wenn Zytokine analysiert werden sollen, fügen Sie Protease-Inhibitoren zu RPMI 1640. - Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal mit insgesamt 3 ml RPMI. Von nun an, speichern Sie die BAL-Flüssigkeit auf Eis. Zum für die Sammlung und Analyse von Lungen Schritt 6 weiter.
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass nicht alle der Flüssigkeit abgerufen werden (2,8 ml Maximum). - Zur Quantifizierung der in der BAL-Flüssigkeit Bakterien, probieren Sie eine kleine Teilmenge (300 ul) seriell verdünnt 1:10 in sterilem PBS, Platte auf TSA-Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht.
- Graf gesamten Zellen mit einem inversen Lichtmikroskop Verdünnung einen aliquoten Teil der BAL-Flüssigkeit 1:2 mit Tuerk Lösung in einer Burker Zellzahl Kammer.
- Zentrifugieren Sie die remaining BAL-Flüssigkeit bei 330 × g für 8 min bei 4 ° C. Mit der Überstand für ELISA Zytokin-Analyse, Lagerung bei -80 ° C. Folgen Sie den Schritten von 5,10 bis 5,13 für Differential-Zellzahl von Zytospin.
- Wenn die Pellets ist rot, lysieren die Erythrozyten Resuspendieren des Pellets in 250 bis 300 ul von RBC Lyse-Puffer 1:10 verdünnt in ultra-reinem destilliertem Wasser für 3 min. Neutralisiert mit 2 ml PBS und Zentrifugation bei 330 g für 8 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen und das Pellet in RPMI 10% fetales Rinderserum (FBS). Verwenden ein Volumen, das 1 x 10 6 Zellen / ml, bezogen auf die Gesamtzellzahl zur Verfügung stellt.
- Zeigen Mikroskop-Objektträger und Filter in entsprechende Schlitze in der Zytospin Karton mit den Filter vor der Mitte des Zytospin. Pipettieren Sie 150 ul jeder Probe in die entsprechenden Wells der Zytospin und in einer Zentrifuge Zytozentrifuge bei 300 g für 5 min.
- Stain Dias von Romanowsky Färbung mit einem kommerziellen Kit nach der masteller Anweisungen und 12, wie zuvor beschrieben. Folgen Sie den Schritten von 5,14 bis 5,17 für die MPO-Aktivität Analyse.
- Zentrifugieren des verbleibenden Volumens der BAL bei 380 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in 250 ul 0,5% Hexadecyltrimethylammoniumchlorid in ultra-reinem destilliertem Wasser, um die Zellen zu lysieren. Die Suspension kann bei -20 ° C für mehrere Tage vor dem Test eingefroren.
- Zentrifuge bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C lagern und den Überstand zu MPO-Assay in 96-Well-Platten durchzuführen, indem die Probe in Doppelbestimmung in jedes Loch und, wenn nötig, auch die richtige Verdünnungen der Probe.
- In den jeder Probe in die Vertiefungen ein gleiches Volumen von 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat für Peroxidase. Die Reaktion kann im Dunkeln für mindestens 5 Minuten dauern, und, bis keine weitere Entwicklung in der Farbe.
- Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 MH 2 SO 4 and messen die OD bei 450 nm auf. Der OD-Wert wird direkt proportional zur Peroxidase-Aktivität.
6. Messung der bakterielle Belastung in Lungen-und Zytokin-Analyse
- Unmittelbar nach der BAL-Flüssigkeit Sammlung, Verbrauch Lungen von der Maus, spülen Sie sie in sterilem PBS, separate Lappen, legte sie in einem Rundrohr mit 2 ml sterilem PBS und Lagerung auf Eis.
HINWEIS: Wenn Cytokine untersucht werden sollen, hinzuzufügen Proteaseinhibitoren PBS zu den Rohren. - Aseptisch homogenisiert Lunge, nehmen Sie eine kleine Teilmenge (300 ul) aus dem Homogenat, seriell verdünnt 1:10 in PBS, Platte auf TSA-Platten und bei 37 ° C über Nacht. Bitte beachten Sie, dass die Gesamtatemwege bakterielle Belastung wird die Summe der KBE in BAL und Lunge sein.
- Zentrifugieren des verbleibenden Homogenat bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Nehmen Sie den Überstand für ELISA Zytokin-Analyse und bei -80 ° C
7. Die histologische Untersuchung
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Representative Results
Wenn das Protokoll richtig gemacht wird, wird die P. aeruginosa Agar-Perlen zwischen 100-200 um zu messen und kann mit einem invertierten Lichtmikroskop durch Pipettieren ein kleines Volumen des Agar-Kügelchen-Suspension auf einen Objektträger beobachtet werden. Einzelnen bakteriellen Zellen sichtbar sind in den Agar-Perlen, wie im Detail in Fig. 1 gezeigt.
Die Wahl von P. im Agar-Kügelchen Herstellung verwendet aeruginosa Stamm ist kritisch. Abbildung 2 und Tabelle 1 zeigen, nach der Infektion der Mäuse mit S. die erhaltenen Daten aeruginosa PAO1 Referenzlaborstamm im Vergleich zum RP73 klinischen Isolat. Mortalität innerhalb der ersten 3 Tage nach der Infektion beobachtet, niedrig für beide Stämme, aber höher für PAO1 (2A und 2B). Erhebliche Unterschiede in Bezug auf den Anteil der chronischen Infektion in den überlebenden Mäuse können zwischen PAO1 und RP73 herausgefordert Mäusen beobachtet werden. While bei 3 Tage nach der Infektion, wurden alle Mäuse immer noch sowohl von P. infiziert Monas aeruginosa-Stämme, nach diesem Zeitpunkt, einige Mäuse gelöscht, die Bakterien und anderen entwickelt eine stabile chronische Infektion. Ab 7 Tage ab der Anteil der chronisch-infizierten Mäusen blieb stabil bis zu 28 Tage für die beiden Stämme. PAO1 führt zu einer chronischen Infektion in einem Prozentsatz von Mäusen, die zwischen 20 bis 27,8% (2A) betrug, während für RP73 war der Prozentsatz von 75 bis 87,1% (2B), was anzeigt, dass das P. aeruginosa Stamm wurde in klinischen Gründung eine chronische Infektion im Vergleich zum Laborstamm PAO1 effizienter. Anzahl von Bakterien auf 3 Tage nach der Infektion waren höher PAO1 (5 x 10 7 KBE / Lunge) (Fig. 2C und Tabelle 1) im Vergleich zu RP73 (1,3 × 10 6 KBE / Lunge) (Fig. 2D), dann 7 Tagen an, als chronische Infektion festgestellt wurde, die bakterielle Belastung stabilisiert sich auf zwischen 10 <sup> 4 und 10 5 KBE / Lunge für beide Stämme. Sobald chronische Infektion hergestellt ist, die Zahl der KBE / Lunge nicht wesentlich mehr als einem Monat ändern. Darüber hinaus ist die bakterielle Belastung in den Atemwegen unter ähnlichen Mäusen mit verschiedenen Bakterienstämmen 9,13 gestellt.
Andere Auslesen, einschließlich Host-entzündliche Reaktion und Histopathologie, kann zu verschiedenen Zeitpunkten von der Herausforderung gemessen werden. Abbildung 3 zeigt die entzündliche Reaktion in Bezug auf die Rekrutierung von Leukozyten in Maus-BAL-Flüssigkeit von 7 Tagen ab Herausforderung mit P. aeruginosa RP73 klinischen Belastung in Agar-Perlen eingebettet. RP73-infizierten Mäusen wurden in nicht infizierten Mäusen verglichen. Differential-Zellzahl enthalten Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten. Die Gesamtzahl der Zellen in RP73-infizierten Mäusen wesentlich höher als bei nicht-infizierten Mäusen. Neutrophile, insbesondere nahezu vollständig in der BAL-Flüssigkeit von nicht-infizierten Mäusen fehlen, waren die represented Zelltyp in RP73-infizierten Mäusen, was auf eine erhebliche Reaktion des angeborenen Immunsystems zu chronischen Infektion.
Die histopathologische Analyse der Lungen von Mäusen, die chronisch mit P. infiziert aeruginosa RP73, zeigt, dass die Infektion pluri-Brenn. 4C und 4F zeigen einen Lappen, die mehr beteiligt als andere Lappen, die nicht oder unwesentlich beteiligt (4B und 4E) sind, ist. Perlen können in Bronchiallumen beobachtet und Mikrokolonien von Bakterienzellen in den Perlen sichtbar (4C und 4F) sind. Lung Histopathologie in den Bereichen der Infektion beteiligt zeigte entzündliche Läsionen in den Bronchien und in der Lungenparenchyms. Die Bronchien wurden von einem massiven neutrophilen Entzündung rund um die Perlen gefüllt, während das Parenchym wurde von Makrophagen, Lymphozyten und Neutrophile einigen infiltriert. Histologie derein nicht-infizierten Maus wurde als Kontrolle verwendet, beide Parenchym und Bronchien waren klar von Entzündungszellen (4A und 4D).
2. Zeitverlauf der P. aeruginosa chronische Infektion mit PAO1 Referenzstamm und RP73 klinischen Stamm. C57BL/6NCrl (20-22 g) männliche Mäuse wurden durch intratracheale Injektion mit 1 bis 5 x 10 6 CFU von P. infiziert aeruginosa Stamm PAO1 (A und C) oder RP73 (B und D) in Agar-Kügelchen eingebettet. Für jeden Zeitpunkt, Histogramme stellen den Prozentsatz Sterblichkeit um Bakteriämie (rot) und Überleben (grau) oder der Anteil der Tiere, die die Infektion gelöscht (induzierteweiß) und die in der Lage, eine chronische Infektion (grün etablieren) (A und B). Die überlebenden Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten getötet, und die Lungen wurden entnommen, homogenisiert und auf TSA-Platten gezüchtet, um die bakterielle Belastung zu bestimmen. Die Wachstumskurven von PAO1 und RP73-Stämme in murinen Lungen gezeigt (C und D). Punkte stehen für Einzelmessungen und horizontalen Linien stellen die Medianwerte. Statistische Signifikanz von Fisher-Test ist indiziert: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Tabelle 1. Zeitverlauf der P. aeruginosachronische Infektion mit PAO1 Referenzstamm und RP73 klinischen Belastung. Die Prozentsätze der Mortalität und der chronischen Infektion von PAO1 und RP73 infizierten Mäusen und Anzahl der KBE pro Lunge (Median) werden angezeigt. Die Werte werden 2-4 verschiedene Experimente ausgewählt. N, nein. von gepoolten Mäusen analysiert für jede Bedingung. Statistische Signifikanz von Fisher-Test ist indiziert: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Bewertung der Entzündung in BAL-Flüssigkeit nach 7 Tagen der chronischen Infektion mit RP73 klinischen Belastung. (A) Die Grafik zeigt die Inhalte des gesamtenLeukozyten, Neutrophilen und Monozyten / Makrophagen in der BAL-Flüssigkeit von RP73 chronisch infizierten Mäusen gewonnen nach 7 Tagen von der Herausforderung gegenüber nicht-infizierten Mäusen (Kontrolle). Durchschnittswerte und SEM dargestellt. (B) In der Box unten Pfeile zeigen Neutrophilen und Makrophagen eine wie in einem Spot auf einer Folie nach Zytospin gesehen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. Hämatoxylin-und Eosin-Färbung auf histologischen Schnitten der Lunge nach 7 Tagen der chronischen Infektion mit RP73 klinischen Stamm. Die Tafel zeigt Hämatoxylin-und Eosin-Färbung von Lungenschnitten von nicht-infizierten Mäusen (A und D) und von Mäusen herausforderndened mit Agar-Perlen RP73 (B, C, E, F) mit. Die Infektion ist pluri-fokalen und beinhaltet im Allgemeinen eine oder mehrere Lungenlappen (C und F), während die anderen nicht oder unwesentlich beteiligt (B und E). Die Pfeile zeigen die Agar-Perlen in den Bronchien Lumen (b) abgeschieden. Linien (A, B, C) 250 um;. Leitungen (D, E, F) um 100 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Die kritischen Schritte in der P. aeruginosa-Perlen Vorbereitung und Maus Herausforderung sind nachstehend angegeben.
Die P. aeruginosa Stamm für Mäuse verwendet Herausforderung ist kritisch. Sterblichkeit, chronische Infektion oder Freiraum kann, abhängig von der Bakterienstamm für die Herausforderung unterscheiden. Die P. aeruginosa RP73 klinischen Stamm wurde über die PAO1 Referenzlaborstamm bevorzugt, da es zu einer vergleichsweise niedrigeren Sterblichkeit, mehr schwere Läsionen und höher chronischen Infektion. Drogentests in präklinischen Studien sollten durchgeführt werden, mit P. Monas aeruginosa-Stämme für ihre hohe Effizienz in eine langfristige chronische Infektion ausgewählt. Dies minimiert die Anzahl von Mäusen, die mit den Anforderungen der wissenschaftlichen Validierung und statistische Analyse 10,11 sind.
Die individuelle P. aeruginosa Agar-Bead-Präparate unterscheiden sich in Größe und in CFU / ml. Ein aurchschnittliche Durchmesser von 150 um mit 2 x 10 7 CFU / ml wird als optimal angesehen. Korngröße wird durch die Rührgeschwindigkeit während der Kühlphase (Schritt 2.9) betroffen. Beads mit Höchstgeschwindigkeit gerührt sind klein und kugelförmig (<50 um), während diejenigen gerührt sehr langsam sind groß und amorphen (> 1 mm). Darüber hinaus, wenn die endgültige Verdünnung zur Herausforderung bereit ist, Perlen mit einer niedrigen Keimbelastung kann klebrig sein, während solche mit hohen Keimbelastung übermäßig verdünnt werden. Die Impfung von Mäusen mit klebrigen Kügelchen mit hoher Sterblichkeit aufgrund Mäuse ersticken bald nach der Herausforderung verbunden, während übermäßig verdünnt Perlen können in Abwesenheit der chronischen Infektion führen. Das optimale Volumen der intratrachealen Injektion ist 50 ul aber höhere Volumen von bis zu 100 ul kann geimpft werden. Unterschiede in der Sterblichkeit oder chronischen Infektion von Mäusen werden selten beobachtet, wenn die inokulierten Dosis zwischen 5 x 10 5 und 5 x 10 &sup6; CFU / Maus.
ANGEMESSENE bakteriellen Wachstumsmedium muss für Agar-Perlen Bildung verwendet werden. In diesem Fall P. aeruginosa wurde in TSA eingebettet, andere Zeitungen berichteten, dass Burkholderia cenocepacia wurde in Nährlösung Agar 14,15 enthalten. Agar Perlen sollten eine microanaerobic Umgebung mit wichtigen Nährstoffen für die Verbreitung von Bakterien, die von Einzelzellen bis 9 Mikrokolonien bieten.
Atmungsleistung variiert abhängig von der Betäubung und Dosis verwendet, und betrifft die Sterblichkeit nach der Operation. Ketamin in einer Dosis von 0,1 mg / g Körpergewicht andxylazine in einer Dosis von 0,01 mg / g Körpergewicht werden die optimale Wahl. Die Atmung ist normal, wenn die Mäuse mit dem Katheter und sichtbar flacher intubiert werden, wenn Mäuse von P. geimpft aeruginosa Agar-Perlen. Idealerweise wird die Injektion von P. aeruginosa-Agar-Kügelchen sollte langsam mit einem optimalen Volumen von 50 &mgr; l durchgeführt werden. Höhere Lautstärken von bis zu 100 ul könnte zu höheren Sterblichkeit führenund größere Schwierigkeiten bei Mäusen Erholung. Alle Mäuse sind ausreichend infiziert, wenn durch intratracheale Operation in Frage gestellt.
Die P. aeruginosa RP73 Agar Wulst-induzierte chronische Lungenentzündung zeigt an, dass in diesem Modell die Infektion pluri-fokalen und beinhaltet im Allgemeinen eine oder mehrere Lungenlappen, ohne die gesamte Lunge. Folglich müssen Auswertung der bakteriellen Belastung und entzündliche Reaktion auf die totale Lungendurchgeführt werden. Die Analyse der selektiven Lappen produziert nicht valide Ergebnisse. Eine Gruppe von nicht-infizierten Mäusen sollte als Kontrolle zugesetzt und im Vergleich zu infizierten Mäusen, um eine mögliche Anomalie in Zellrekrutierung in BAL-Flüssigkeit oder in der Histologie der Lunge durch Verunreinigungen oder Fehler in der Vorgehensweise zu erkennen. Dieses Modell wurde in einer BSL-2 Labor fest mit allen Laborpersonal sollte in den entsprechenden Fähigkeiten für Maus Beobachtung geschult werden. Die Mäuse wurden zweimal pro Tag für die folgenden Parameter überwacht: Piloerektion, Haltung, Fortbewegung, Atmung, Neugier, Nasensekret, Pflege und Austrocknung. Mäuse, die ≥ 20% des Körpergewichts verloren und zeigte Anzeichen von schweren klinischen Erkrankung, wie struppiges Fell, Trägheit, Appetitlosigkeit, schlechte Fortbewegung, oder schmerzhafte Körperhaltung, wurden vor der Beendigung des Versuchs eingeschläfert. Mäuse, die mit P. infiziert aeruginosa RP73 Agar-beads zeigten niedrigere Anzeichen von Unwohlsein innerhalb von drei Tagen vor einer Infektion im Vergleich zu PAO1-infizierten Mäusen. Nach diesem Zeitpunkt einige Mäuse gelöscht, die Bakterien und anderen entwickelt eine stabile chronische Infektion, dauerhaft bis zu 28 Tage.
Wir zeigten, dass das Modell der chronischen Infektion schlagen wir in diesem Papier in der Lage ist, eine stabile P. induzieren aeruginosa chronische Infektion bei Mäusen. Diese Methode wurde optimiert, um die molekularen Mechanismen der Krankheitserreger Virulenz und Immunabwehr 8,9,16 oder für Drogentests von antibakteriellen und entzündungshemmenden Moleküle 10,11 zugrunde liegenden studieren. Ter präklinische Validierung dieser Verbindungen in geeigneten Tiermodellen für zukünftige therapeutische Interventionen für Lungeninfektionen bei Patienten mit CF unerlässlich.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Research in Bragonzi Labor wurde von der italienischen Cystic Fibrosis Foundation (CFaCore) und der EU-F7-2009-223670 finanziert. Ein Teil dieser Arbeit wurde in Alembic, einem fortgeschrittenen Mikroskopie Labor durchgeführt, Histopathologie und Maus wurde in der Abteilung für Pathologische Anatomie (San Raffaele Scientific Institute) durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
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