Summary
Descriviamo il metodo di agar-perle di stabilire persistente a lungo termine infezione delle vie respiratorie Pseudomonas aeruginosa cronica nel modello di topo.
Abstract
Un modello murino di infezione cronica delle vie aeree è un asset fondamentale nella fibrosi cistica (CF) di ricerca, anche se ci sono una serie di preoccupazioni per quanto riguarda il modello stesso. Prime fasi di infiammazione e infezione sono stati ampiamente studiati utilizzando il modello di agar-perle del mouse Pseudomonas aeruginosa, mentre solo pochi studi si sono concentrati sulla infezione cronica a lungo termine in vivo. La sfida principale per l'infezione cronica a lungo termine rimane la bassa carica batterica da P. aeruginosa e la bassa percentuale di infetti settimane topi dopo sfida, indicando che le cellule batteriche vengono progressivamente cancellati dall'host.
Questo articolo presenta un metodo per ottenere efficiente infezione cronica a lungo termine in topi. Questo metodo si basa sul radicamento del P. aeruginosa ceppi clinici nei agar-perle in vitro, seguita da instillazione nei topi C57Bl/6NCrl. Infezione polmonare bilaterale è associato SEVrali misurabili read-out, tra cui la perdita di peso, la mortalità, infezione cronica, e la risposta infiammatoria. Il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico è stato preferito rispetto al ceppo di laboratorio di riferimento PAO1 quanto ha determinato una mortalità relativamente bassa, le lesioni più gravi, e l'infezione cronica più elevata. P. colonizzazione aeruginosa può persistere nel polmone per oltre tre mesi. Murini patologia polmonare assomiglia a quella di pazienti CF con malattia avanzata cronica polmonare.
Questo modello murino imita più da vicino il corso della malattia umana e può essere utilizzato sia per studi sulla patogenesi e per la valutazione di nuove terapie.
Introduction
La fibrosi cistica (CF) è una malattia genetica causata da mutazioni nel transmembrana della fibrosi cistica regolatore della conduttanza (CFTR). Questo gene codifica per un canale del cloro espressi sulla membrana della maggior parte delle cellule epiteliali. Bronchiectasia, muco tamponamento e parenchimale distruzione causata principalmente da infezioni da Pseudomonas aeruginosa progressivamente portare a grave malattia polmonare e la mortalità nella maggior parte dei pazienti CF 1. Capire patogenesi CF e l'ulteriore sviluppo di nuove terapie si basano su modello animale con le caratteristiche di CF. Diversi topi, geneticamente modificati per il gene CFTR, sono stati generati, ma limitazioni nella capacità di queste specie di ricapitolare malattia polmonare CF-simili e diverse altre anomalie di organi visto in pazienti CF sono stati ampiamente documentati 2.
Sviluppo di infezione è una delle principali sfide CF modello animale. I cl letteraturasuggerisce presto che una infezione cronica che dura più di un mese può essere raggiunto solo se i topi vengono inoculati con i batteri incorporati in un agente di immobilizzazione come agar, agarosio, o alghe alginato 3-5. Questi agenti immobilizzanti forniscono le condizioni microaerobica / anaerobiche che permettono ai batteri di crescere in forma di microcolonie, analogamente alla crescita nel muco dei pazienti FC 6. Questo modello di infezione cronica porta alla persistenza dei batteri nei polmoni causando infiammazione delle vie respiratorie e danni 7. Tuttavia, a seconda del metodo utilizzato, il ceppo batterico e la dose inoculato nei polmoni, la percentuale di topi infettati croniche e la carica batterica recuperato nei polmoni a differenti tempi possono differire considerevolmente. In particolare, la sfida principale per l'infezione cronica a lungo termine rimane la bassa carica batterica da P. aeruginosa e la bassa percentuale di infetti settimane topi dopo sfida, indicando that cellule batteriche vengono progressivamente cancellati dall'host. Selezionando il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico da una raccolta di CF isolati 8 abbiamo ottenuto con successo una bassa mortalità, le lesioni più gravi, e l'alta percentuale di infezione cronica con una carica batterica stabile fino a un mese nei topi C57Bl/6NCrl.
Dettagli Questo documento metodologia per l'incorporamento P. aeruginosa nelle perle di agar, abbiamo infettato topi mediante instillazione, misurata la carica batterica e citochine nei polmoni, raccolta BAL ed eseguito un esame istologico. Nel complesso, questo protocollo sarà di aiuto ai ricercatori per affrontare questioni di fondamentale importanza sulla patogenesi 8,9 e testare nuove terapie contro il P. aeruginosa infezione cronica 10,11.
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Protocol
1. Batteri Preparazione per l'infezione cronica (tre e due giorni prima del mouse Challenge)
- Selezionare l'appropriato P. ceppo aeruginosa da testare.
- Seminare un'ansata di P. aeruginosa da -80 ° C delle colture per un piatto Trypticase Soy Agar (TSA) e incubare a 37 ° C durante la notte.
- Scegli una singola colonia e inoculare in 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) in una provetta snap-capped 15 ml ed incubare a 37 ° C per una notte in un incubatore agitazione a 200 rpm.
2. Incorporare batteri in Beads Agar per l'infezione cronica (un giorno prima infezione)
- Prendere una piccola aliquota della coltura batterica durante la notte, diluire 1:50 in tampone fosfato (PBS) e misurare la densità ottica (OD) a 600 nm.
- Diluire la coltura batterica overnight aggiungendo 2 OD in una nuova provetta con tappo a scatto contenente 20 ml di TSB fresca.
- Incubare a 37 ° C per circa 3 -4 ore di fase di login in un incubatore agitazione a 200 rpm, fino a raggiungere un totale di 10-15 OD.
- Nel frattempo, preparare la TSA, fatta di TSB con 1,5% agar, autoclave ed equilibrare a 50 ° C in un bagno d'acqua. Equilibrare 150 ml di olio minerale pesante preautoclaved in un matraccio di Erlenmeyer a 50 ° C in un bagno d'acqua.
- Una volta P. aeruginosa raggiunge la fase log, raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 2700 xg per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet batterico in 1 ml di PBS sterile e vortice accuratamente per risospendere completamente il pellet.
- Miscelare 1 ml di sospensione batterica con 9 ml di TSA liquido pre-equilibrata a 50 ° C.
- Aggiungere 10 ml TSA-P. aeruginosa miscela di olio minerale pesante (preriscaldata a 50 ° C) e subito mescolare per 6 minuti a temperatura ambiente. L'agitazione deve produrre un vortice visibile nell'olio.
- Raffreddare la miscela a 4 ° C, agitando alla sp minimoeed per 35 min (Figura 1).
- Appoggiare la miscela agar-perle di olio in ghiaccio per altri 20 min.
- Trasferire l'agar-perle in 50 ml provette Falcon e centrifugare a 2.700 xg per 15 min a 4 ° C.
- Accuratamente rimuovere l'olio minerale e lavare con PBS sterile sei volte, come descritto nel passaggio 2.11. Dopo tre lavaggi, le sfere possono essere pellet per gravità invece di utilizzare la centrifuga. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere l'agar-perle in 20-30 ml di PBS.
- Prelevare un 'aliquota delle perle (circa 0,5 ml) e asettico omogeneizzare.
- Prendete 100 ml di perline omogeneizzati e diluire in 900 ml di PBS sterile. Serie diluire 01:10 fino al 10 -6.
- Diluizione seriale piastra su piastre di TSA, compreso campione non diluito fino a 10 -6 e incubare le piastre a 37 ° C.
- Misurare il diametro tallone utilizzando un microscopio ottico invertito in vari campi. Il diametro cordone deve essere compreso tra 100-200 micron (
- Conservare le perle di una notte a 4 ° C.
Figura 1. Panoramica della preparazione e del mouse perline infezione agar. P. aeruginosa cellule sono risospese in 1 ml di PBS e aggiunti 9 ml di liquido TSA (50 ° C). Questa miscela viene aggiunta a 150 ml di olio minerale pesante a 50 ° C in un pallone e agitata ad alta velocità per 6 minuti a temperatura ambiente. Quando il pallone viene raffreddato a 4 ° C con agitazione lenta per 35 min, l'agar solidifica creando perline, e batteri presenti nella miscela sono incorporati nei branelli agar. Particolare di un cordone agar contenente cellule batteriche è (A) indicato. Dopo aver rimosso l'olio minerale con diversi lavaggi con PBS sterile, la sospensione di agar-perline è pronto fo inoculazione nei polmoni dei topi da un'iniezione endotracheale (B). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
3. Topi sfida con Agar-perle
Etica Dichiarazione: Questo protocollo e sperimentazione seguono le linee guida della cura degli animali e il comitato etico di Istituto Scientifico San Raffaele.
- Contare il numero di Unità Formanti Colonie (CFU) sulle piastre di TSA per determinare il numero di CFU / ml nella sospensione agar-perline. Diluire l'agar-perline con PBS sterile per 2-4 x 10 7 UFC / ml per raggiungere un inoculo ottimale di 1-2 x 10 6 in 50 microlitri.
- Anestetizzare C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 settimane) topi maschi con ketamina (50 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) in 0,9% NaCl somministrata ad un volume di 0,002 ml / g di peso corporeo da iniezione intraperitoneale.
NOTA: L'anestesia è considerato adeqlutare quando l'animale rimane ancora in silenzio, non risponde agli stimoli esterni, ed è costante il cuore e la frequenza respiratoria. - Posizionare il mouse in posizione supina. Disinfettare il cappotto del mouse con il 70% di etanolo.
- Esporre la trachea da un taglio verticale della pelle e intubare la trachea con una sterile, flessibile 22 G 0,9 millimetri x 25 mm catetere IV, mantenendo attenzione per rimuovere il stylette mentre si muove verso il basso nella trachea. Inserire il catetere non troppo in profondità nella trachea. Arrestare prima di raggiungere la carena (biforcazione).
- Immediatamente prendere un volume di 50 ml di sospensione di sferette agar da una siringa da 1 ml e collegarlo al catetere. Premere delicatamente il pistone della siringa, permettendo alle sfere di essere impiantati nel polmone. Chiudere l'incisione utilizzando clip di sutura.
- Posizionare l'animale su una piastra elettrica fino a completamente sveglio.
4. Valutazione Mice
- Osservare i topi al giorno per segni clinici tra cui la qualità del cappotto, la postura,deambulazione, e lo stato di idratazione. Controllo del peso corporeo al giorno. I topi che perdono ≥ 20% del peso corporeo devono essere eutanasia.
- Seguire il punto 5 per la raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) e dei punti 6 e 7 per la raccolta dei polmoni e l'analisi di totale CFU, l'analisi istologica, la risposta infiammatoria in termini di numero totale e differenziale delle cellule nel BAL, analisi di citochine, e mieloperossidasi (MPO) attività.
5. BAL Fluid Raccolta e analisi
- Euthanize i topi da CO 2 inalazione.
- Posizionare il mouse nella posizione supina. Disinfettare il cappotto del mouse con il 70% di etanolo.
- Esporre la trachea e la gabbia toracica da un taglio verticale della pelle. Esporre i polmoni tagliando il diaframma.
- Inserire un filo di sutura sotto la trachea utilizzando una pinzetta e intubare la trachea con una sterile, flessibile 22 g 0,9 millimetri x 25 mm catetere IV. Tirare le due estremità del filo di sutura di impegnare la catheter alla trachea e annodare il filo attorno alla trachea.
- Prendere un volume di 1 ml di RPMI 1640 utilizzando una siringa da 1 ml e fissarlo al catetere. Spingere lo stantuffo della siringa per lavare i polmoni e immediatamente recuperare il liquido, riporlo in una provetta da 15 ml.
NOTA: Se le citochine sono da analizzare, aggiungere inibitori della proteasi per RPMI 1640. - Ripetere questa operazione tre volte per un totale di 3 ml di RPMI. Da ora in poi, conservare il liquido BAL su ghiaccio. Andare al punto 6 per la raccolta e l'analisi dei polmoni.
NOTA: Si prega di notare che non tutto il liquido sarà recuperato (2,8 ml al massimo). - Per la quantificazione dei batteri presenti nel BAL, campionare una piccola aliquota (300 microlitri), serialmente diluire 1:10 in PBS sterile, piastra su piastre di TSA e incubare a 37 ° C per una notte.
- Contare le cellule totali utilizzando un microscopio ottico invertito luce diluendo un'aliquota del BAL 1:2 con Tuerk in una camera di conta cellulare Burker.
- Centrifugare la remaining BAL a 330 xg per 8 minuti a 4 ° C. Prendere il surnatante per l'analisi di citochine ELISA, riporlo a -80 ° C. Seguire i passaggi 5,10-5,13 per la conta cellulare differenziale cytospin.
- Se il pellet è rosso, lisare gli eritrociti risospendere il pellet in 250-300 ml di tampone di lisi diluito 1:10 in acqua distillata ultrapura per 3 min. Neutralizzare con 2 ml di PBS e centrifugare a 330 xg per 8 minuti a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in RPMI 10% di siero fetale bovino (FBS). Utilizzare un volume che fornirà 1 x 10 6 cellule / ml, in base al numero di celle totale.
- Posizionare vetrini da microscopio e dei filtri in apposite cave nel cytospin con i filtri di cartone di fronte al centro del cytospin. Pipettare 150 ml di ciascun campione nei pozzetti appropriati del cytospin e centrifugare in una citocentrifuga a 300 xg per 5 min.
- Colorare i vetrini da Romanowsky colorazione utilizzando un kit commerciale, secondo la maistruzioni di nufacturer e come descritto in precedenza 12. Seguire i passaggi 5,14-5,17 per l'analisi delle attività MPO.
- Centrifugare la rimanente quantità di BAL a 380 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di cloruro di esadeciltrimetilammonio 0,5% in acqua distillata ultrapura per lisare le cellule. La sospensione può essere congelato a -20 ° C per diversi giorni prima dell'esecuzione del test.
- Centrifugare a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C e utilizzare il surnatante effettuare test MPO in piastre a 96 pozzetti, aggiungere il campione in duplicato a ciascun pozzetto e, se necessario, anche vere diluizioni del campione.
- Aggiungere a ciascun campione nei pozzetti un volume uguale di 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) come substrato per la perossidasi. Lasciare che la reazione abbia luogo al buio per almeno 5 minuti e fino a quando non vi è un ulteriore sviluppo nel colore.
- Arrestare la reazione aggiungendo 2 MH 2 SO 4 unand misurare la densità ottica a 450 nm. Il valore di assorbanza sarà direttamente proporzionale all'attività perossidasi.
6. Misurazione della carica batterica nei polmoni e citochine analisi
- Subito dopo la raccolta BAL, polmoni accise del topo, li lavare in PBS sterile, lobi distinti, metterli in un tubo a fondo rotondo con 2 ml di PBS sterile e memorizzare sul ghiaccio.
NOTA: Se citochine sono da analizzare, aggiungi inibitori della proteasi di PBS ai tubi. - Asetticamente omogeneizzare i polmoni, prendere una piccola aliquota (300 microlitri) dall'omogenato, serie diluire 1:10 in PBS, la piastra su piastre di TSA e incubare a 37 ° C durante la notte. Si prega di notare che il carico totale delle vie aeree batterica sarà la somma dei CFU trovati in BAL e del polmone.
- Centrifugare l'omogeneizzato rimanendo a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C. Prendete il surnatante per l'analisi di citochine ELISA, e conservare a -80 ° C.
7. Esame istologico
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Representative Results
Quando il protocollo è fatto correttamente, il P. aeruginosa agar-perle misureranno tra 100-200 micron e può essere osservato con un microscopio ottico invertito pipettando un piccolo volume della sospensione di agar-perline su un vetrino. Singole cellule batteriche sono visibili nelle perline agar, come mostrato in dettaglio in figura 1.
La scelta di P. ceppo aeruginosa usati nella preparazione agar-perline è critica. Figura 2 e Tabella 1 mostra i dati ottenuti seguendo l'infezione di topi con P. riferimento aeruginosa PAO1 ceppo di laboratorio rispetto al RP73 isolato clinico. Mortalità, osservate entro i primi 3 giorni di infezione, è basso per entrambi i ceppi, ma superiore per PAO1 (Figure 2A e 2B). Notevoli differenze in termini di percentuale di infezione cronica nei topi sopravvissuti possono essere osservati tra PAO1 e RP73 topi disabili. While in tre giorni dopo l'infezione, tutti i topi sono stati ancora infettati da entrambi P. ceppi aeruginosa, dopo questo tempo-punto alcuni topi cancellati i batteri e altri hanno sviluppato un'infezione cronica stabile. Da 7 giorni in poi la percentuale di topi cronicamente infettati rimasto stabile fino a 28 giorni per entrambi i ceppi. PAO1 porta ad infezione cronica in una percentuale di topi che variava tra 20-27,8% (Figura 2A), mentre per RP73 la percentuale era 75-87,1% (Figura 2B), indicando che il P. aeruginosa ceppo clinico era più efficiente nella creazione di una infezione cronica rispetto al ceppo di laboratorio PAO1. Numero di batteri a 3 giorni dopo l'infezione è stata superiore per PAO1 (5 x 10 7 CFU / polmone) (Figura 2C e Tabella 1) rispetto al RP73 (1,3 x 10 6 CFU / polmone) (Figura 2D), poi da 7 giorni poi, quando è stato istituito l'infezione cronica, la carica batterica si stabilizza tra il 10 <sup> 4 e 10 5 CFU / polmone per entrambi i ceppi. Una volta stabilita infezione cronica, il numero di CFU / polmone non cambia significativamente più di un mese. Inoltre, la carica batterica nelle vie aeree è simile tra topi sfidati con differenti ceppi batterici 9,13.
Altri read-out, compresa la risposta infiammatoria ospitante e istopatologia, può essere misurata in diversi punti temporali di sfida. Figura 3 mostra la risposta infiammatoria in termini di reclutamento dei leucociti nel BAL topo 7 giorni dalla sfida con P. aeruginosa RP73 ceppo clinico incorporato in agar-perline. RP73-topi infettati sono stati confrontati con i topi non infetti. Conta cellulare differenziale inclusa neutrofili, macrofagi e linfociti. Il numero di cellule totali è sensibilmente maggiore nei topi RP73-infettati rispetto ai topi non infetti. I neutrofili, in particolare, quasi completamente assente nel BAL di topi non infetti, erano i più reprtipo cellulare esented in topi infettati RP73, indicando una notevole risposta da parte del sistema immune innato di infezione cronica.
L'analisi istopatologica dei polmoni di topi, cronicamente infettati con P. aeruginosa RP73, dimostra che l'infezione è pluri-focale. Figure 4C e 4F mostrano un lobo che è più coinvolta di altri lobi che sono influenzate o marginalmente coinvolto (figure 4B e 4E). Le perle possono essere osservati nel lume bronchiale e microcolonie di cellule batteriche sono visibili nelle perline (figure 4C e 4F). Polmone istopatologia nelle aree interessate da infezione mostrato lesioni infiammatorie nei bronchi e nel parenchima polmonare. I bronchi sono stati riempiti da una massiccia infiammazione dei neutrofili che circonda le perline, mentre il parenchima è stato infiltrato da macrofagi, linfociti e dei neutrofili. Istologia diun topo infetto è stato usato come controllo, sia parenchima e bronchi erano chiaramente da cellule infiammatorie (Figure 4A e 4D).
Figura 2. Naturalmente il tempo di P. aeruginosa infezione cronica con ceppo di riferimento PAO1 e RP73 ceppo clinico. C57BL/6NCrl (20-22 g) topi maschi sono stati infettati per via intratracheale con da 1 a 5 x 10 6 CFU di P. aeruginosa ceppo PAO1 (A e C) o RP73 (B e D) incorporati in agar-perline. Per ogni punto temporale, istogrammi rappresentano la percentuale di mortalità indotta da batteriemia (rosso) e la sopravvivenza (grigio) o la percentuale di animali che riesce l'infezione (bianco) e quelli in grado di stabilire una infezione cronica (verde) (A e B). Topi sopravvissuti sono stati sacrificati ai punti temporali indicati, ei polmoni sono state raccolte, omogeneizzati e coltivati su piastre di TSA per determinare la carica batterica. Le curve di crescita del pao1 e RP73 tensioni polmoni murini sono mostrati (C e D). Punti rappresentano le singole misure e le linee orizzontali rappresentano i valori mediani. La significatività statistica con il test di Fisher è indicato: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Tabella 1. Naturalmente il tempo di P. aeruginosainfezione cronica con il ceppo di riferimento PAO1 e RP73 ceppo clinico. Sono mostrate le percentuali di mortalità e di infezione cronica di PAO1 e RP73 topi infettati e il numero di CFU al polmone (mediana). I valori sono selezionati dai 2-4 diversi esperimenti. N, n. di topi pool analizzati per ogni condizione. La significatività statistica con il test di Fisher è indicato: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Valutazione della infiammazione nel BAL dopo 7 giorni di infezione cronica da RP73 ceppo clinico. (A) Il grafico mostra il contenuto totale dileucociti, neutrofili e monociti / macrofagi recuperati nel BAL di RP73 topi cronicamente infettati dopo 7 giorni dalla sfida rispetto ai topi non infetto (controllo). I valori medi e SEM sono rappresentati. (B) Nel riquadro sottostante frecce indicano neutrofili e macrofagi come si è visto in un posto su un vetrino dopo cytospin. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Ematossilina e eosina su sezioni istologiche di polmoni dopo 7 giorni di infezione cronica con RP73 ceppo clinico. Il pannello mostra ematossilina e eosina delle sezioni polmonari di topi non infetti (A e D) e di topi ContestandoED con agar-perle contenenti RP73 (B, C, E, F). L'infezione è pluri-focale e generalmente coinvolge uno o più lobi polmonari (C e F), mentre gli altri non sono interessati o coinvolti marginalmente (B ed E). Le frecce indicano perline agar depositati nel lume bronchiale (b). Linee (A, B, C) 250 micron,. Linee (D, E, F) 100 micron Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Le fasi critiche del P. aeruginosa-perline preparazione e la sfida del mouse sono riportati di seguito.
Il ceppo P. aeruginosa utilizzato per i topi sfida è critica. Mortalità, infezione cronica o di liquidazione potrebbero differire significativamente a seconda del ceppo batterico utilizzato per la sfida. Il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico è stato preferito rispetto al ceppo di laboratorio di riferimento PAO1 quanto ha determinato una mortalità relativamente bassa, le lesioni più gravi, e l'infezione cronica più elevata. Test anti-droga in studi preclinici deve essere eseguita con P. aeruginosa ceppi selezionati per la loro elevata efficienza nello stabilire l'infezione cronica a lungo termine. Ciò minimizza il numero di topi che sono coerenti con le esigenze di validazione scientifica e analisi statistica 10,11.
L'individuo P. aeruginosa preparazioni agar-perline di varie dimensioni e in CFU / ml. Un unverage diametro di 150 micron, con 2 x 10 7 UFC / ml è considerato ottimale. Formato del branello è influenzato dalla velocità di agitazione durante la fase di raffreddamento (passo 2.9). Beads agitata a velocità superiore sono piccole e sferiche (<50 micron) mentre quelle agitata molto lentamente sono grandi e amorfo (> 1 mm). Inoltre, quando la diluizione finale per la sfida è pronta, perline con una carica batterica bassa possono essere appiccicosa, mentre quelli con alta carica batterica può essere eccessivamente diluito. L'inoculazione di topi con perle appiccicose è associata ad alta mortalità dovuta a soffocamento topi subito dopo sfida, mentre perle eccessivamente diluiti possono comportare l'assenza di infezione cronica. Il volume ottimale dell'iniezione endotracheale è di 50 ml, ma maggiori volumi fino a 100 ml può essere inoculato. Le differenze nella mortalità o infezione cronica di topi sono raramente osservati quando la dose inoculato varia tra il 5 x 10 5 e 5 x 10 6 CFU / mouse.
NECESSARIOe terreno di coltura batterica deve essere utilizzato per la formazione di perline agar. In questo caso, P. aeruginosa è stato incorporato in TSA; altri giornali hanno riferito che, Burkholderia cenocepacia è stato incluso nel brodo nutriente agar 14,15. Agar perle dovrebbero fornire un ambiente microanaerobic con sostanze nutritive essenziali disponibili per la proliferazione batterica da singole cellule a microcolonie 9.
Sforzo respiratorio varia a seconda del anestetico e dose utilizzata, e colpisce mortalità dopo intervento chirurgico. Ketamina alla dose di 0,1 mg / g di peso corporeo andxylazine alla dose di 0,01 mg / g di peso corporeo sono le scelte ottimali. La respirazione è normale quando i topi sono intubati con il catetere e visibilmente meno profondo quando i topi vengono inoculati da P. aeruginosa agar-perline. Idealmente, l'iniezione di P. aeruginosa agar-perle devono essere eseguiti lentamente con un volume ottimale di 50 microlitri. Volumi superiori fino a 100 microlitri potrebbe causare una maggiore mortalitàe maggiori difficoltà nei topi recupero. Tutti i topi sono adeguatamente infettati quando provocati da un intervento chirurgico endotracheale.
Il P. aeruginosa RP73 agar branello indotta polmonite cronica indica che in questo modello l'infezione è pluri-focale e generalmente comporta una o più lobi polmonari senza compromettere l'intero polmone. Di conseguenza, la valutazione della carica batterica e la risposta infiammatoria deve essere eseguita su polmonare totale. L'analisi dei lobi selettivi non produce risultati validi. Un gruppo di topi non infetti dovrebbe essere aggiunto come controllo e rispetto ai topi infettati per rilevare qualsiasi anomalia potenziale nel reclutamento di cellule nel BAL o in istologia del polmone a causa di contaminazioni o errore nella procedura. Questo modello è stato stabilito in un laboratorio BSL-2 con tutto il personale di laboratorio deve essere addestrato nelle competenze adeguate per l'osservazione del mouse. I topi sono stati monitorati due volte al giorno per i seguenti parametri: piloerezione, atteggiamento, Locomozione, la respirazione, la curiosità, la secrezione nasale, la cura e la disidratazione. I topi che hanno perso ≥ 20% del peso corporeo e hanno mostrato evidenza clinica di malattia grave, come il cappotto trasandato, inattività, perdita di appetito, scarsa locomozione, o la postura dolorosa, sono stati sacrificati prima della conclusione dell'esperimento. Topi infettati con P. aeruginosa RP73 agar-perle hanno mostrato minori segni di disagio entro tre giorni dalla infezione rispetto ai topi PAO1 infettati. Dopo questo punto di tempo alcuni topi cancellati i batteri e altri hanno sviluppato un'infezione cronica stabile, durata fino a 28 giorni.
Abbiamo dimostrato che il modello di infezione cronica proponiamo in questo lavoro è in grado di indurre una stabile P. aeruginosa infezione cronica nei topi. Questo metodo è stato ottimizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base della virulenza patogeno e l'ospite difesa 8,9,16 o per il test anti-droga di antibatteriche e anti-infiammatori molecole 10,11. Tegli validazione preclinica di questi composti nei modelli animali appropriati è essenziale per i futuri interventi terapeutici per le infezioni polmonari in pazienti con FC.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
La ricerca nel laboratorio di Bragonzi è stato finanziato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (CFaCore) e UE-F7-2009-223.670. Parte di questo lavoro è stato svolto in ALEMBIC, un laboratorio di microscopia avanzata, e il mouse istopatologia è stato eseguito presso l'Unità di Anatomia Patologica (Istituto Scientifico San Raffaele).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
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