Summary
Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.
Abstract
Modelin kendisi ile ilgili endişeleri bir dizi olmasına rağmen, kronik solunum yolu enfeksiyonu fare modeli, kistik fibrozis (CF) araştırma önemli bir varlıktır. Yalnızca çok az sayıda rapor in vivo olarak uzun vadeli kronik enfeksiyon odaklı iken inflamasyon ve enfeksiyonun erken aşamaları yaygın olarak Pseudomonas aeruginosa agar-boncuk fare modeli kullanarak çalışılmıştır. Uzun süreli kronik enfeksiyon için temel zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir belirten mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi.
Bu çalışma, farede etkili, uzun vadeli kronik enfeksiyon elde etmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, P. katıştırma dayanır C57Bl/6NCrl farelerde trakea içi damlatma ardından in vitro agar-tanelerinde aeruginosa klinik suşları. Bilateral akciğer enfeksiyonu sev ile ilişkilikilo kaybı, ölüm, kronik enfeksiyon ve inflamatuar yanıt dahil eral ölçülebilir okuma-çıkışları. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu PAO1 referans laboratuvar suşu tercih edildi. P. aeruginosa kolonizasyonu üç aydan fazla akciğer devam edebilir. Murin akciğer patolojisi ilerlemiş kronik akciğer hastalığı olan hastalarda CF benzediği.
Bu fare modeli en yakın insan hastalığın seyrini taklit eden ve patojenez çalışmalarında ve yeni tedavilerin değerlendirilmesi için de kullanılabilir.
Introduction
Kistik fibrozis (CF) kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) gen mutasyonlarının neden olduğu genetik bir hastalıktır. Bu gen, en epitel hücrelerinin membranı üzerinde ifade edilen bir klorür kanal için kodlar. Bronşektazi, mukus tıkacı ve parankimal yıkım giderek ciddi akciğer hastalığı ve CF hastaların 1 çoğunda mortaliteye neden Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlar çoğunlukla neden oldu. Anlama CF patogenez ve yeni tedavilerin daha da geliştirilmesi CF karakteristik özellikleri ile hayvan modelinde güveniyor. Genetik CFTR geni değiştirilmiş çeşitli fareler, üretildi, ancak CF gibi akciğer hastalığı ve KF hastalarında görülen birçok diğer organ anormallikleri özetlemek için bu türlerin yeteneği sınırlamalar yaygın olarak 2 belgelenmiştir.
Enfeksiyon gelişimi CF hayvan modelinde önemli sorunlardan biridir. Edebiyat clErken fareler, ağar, agaroz, alginat ya da yosun 3-5 gibi bir hareketsiz kılma maddesini içine gömülü bakteri ile aşılanır yalnızca bir aydan fazla süren bir kronik enfeksiyon elde edilebileceğini göstermektedir. Bu hareketsizleştirici maddeler, bakteriler Benzer CF hastalarında 6'nın mukus büyümesine, mikrokoloniler şeklinde büyümeye izin mikroaerobik / anaerobik şartları sağlar. Kronik enfeksiyon Bu model hava yolu enflamasyonu ve hasara neden 7 akciğerlerde bakterilerin sürekli olmasına yol açmaktadır. Ancak, kullanılan yöntem, bakteri suşu ve akciğer aşılandı dozuna bağlı olarak, farklı zaman noktalarında akciğerlerde geri kronik enfekte edilmiş farelerin yüzdesi ve bakteri yükü önemli ölçüde farklı olabilir. Özellikle, uzun süreli kronik enfeksiyon için ana zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi belirten that bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir. P. seçerek CF bir koleksiyon aeruginosa RP73 klinik suş başarıyla C57Bl/6NCrl farelerde bir ay için istikrarlı bir bakteri yüküne kadar düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve kronik enfeksiyon yüksek oranda elde 8 ayırır.
Bu kağıt P. gömmek için metodoloji detayları Agar boncuk aeruginosa, biz, trakea içine aşılanmasıyla fareleri enfekte akciğerlerde bakteri yükü ve sitokinler ölçülen, BAL sıvısı toplanır ve histolojik muayene gerçekleştirdik. Genel olarak, bu protokol patogenez 8,9 tarihinde temelde önemli soruları ele P. karşı yeni tedaviler test araştırmacılarına yardımcı olacaktır aeruginosa kronik enfeksiyon 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kronik Enfeksiyon için hazırlık Bakteriler (önceki Fare Mücadelesi Üç ve İki Gün)
- Uygun P ismi seçin aeruginosa ırk test edilmesi.
- P. loopful inoküle Bir Trypticase Soy Agar (TSA) plakaya bir -80 ° C stok kültüründen aeruginosa ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Tek bir koloni almak ve bir 15 ml ek-kapaklı bir tüp içinde 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) içine inoküle ve 200 rpm'de bir çalkalama inkübatör içinde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. Kronik Enfeksiyon Agar Boncuk Bakteriler katıştırma (önceki Enfeksiyon One Day)
- , Bakteri kültürü gece boyunca küçük bir kısım al fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 1:50 seyreltilmiş ve 600 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçün.
- Taze TSB 20 ml içeren, yeni bir çırpıda-kapaklı tüp içinde 2 OD ekleyerek gecede bakteri kültürü sulandırmak.
- Yaklaşık 3 boyunca 37 ° C'de inkübe edin -10-15 OD toplam ulaşana kadar, 200 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe log fazına kadar 4 saat.
- Bu arada,% 1.5 ağar, otoklav ve bir su banyosu içinde 50 ° C'de dengeye ile TSB yapılmış TSA hazırlamak. Bir su banyosu içinde 50 ° C'de bir Erlenmeyer şişesi içinde preautoclaved ağır mineral yağ 150 ml dengelenmesi.
- Bir kez P. aeruginosa, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2700 x g'de santrifüj ile bakteriyel hücreleri toplamak ve supernatant atmak log fazına ulaşır.
- Iyice tamamen pelet tekrar süspansiyon için 1 ml steril PBS ve vorteks de bakteriyel pelet yeniden süspanse edin.
- Sıvı TSA 9 ml, 50 ° C'de önceden dengelendi ile karıştırın 1 ml bakteri süspansiyonu
- 10 ml-TSA P. ekleme hemen aeruginosa (50 ° C'de önceden ısıtılmış), ağır mineral yağ elde karışımı oda sıcaklığında 6 dakika boyunca karıştırın. Ajitasyon yağ içinde görünür bir girdap üretmelidir.
- En az sp karıştırıldıktan sonra, 4 ° C'ye soğutun35 dakika (Şekil 1) için Bayram.
- Ilave bir 20 dakika boyunca buz içinde agar-boncuk-yağ karışımı bekletin.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2700 x g'de 50 ml Falcon tüpleri ve santrifüj içine agar-boncuk Transferi
- Doğru mineral yağı çıkarmak ve aşama 2.11 'de tarif edildiği gibi, steril PBS ile altı kez yıkayın. Üç yıkamadan sonra, boncuklar yerine santrifüj kullanılarak yer çekimi ile tane haline edilebilir. Son yıkamadan sonra, 20-30 ml PBS içinde tekrar süspansiyon agar-boncuklar.
- Boncuklar (yaklaşık 0.5 mi) bir kısım alın ve aseptik homojenleştirin.
- Homojenize boncuk 100 ul alın ve steril PBS içinde 900 ul seyreltik. Seri 10 -6 aşağı 01:10 sulandırmak.
- -6 Aşağı 10 ve 37 ° C de inkübe etmek plakaları seyreltilmemiş örnek de dahil olmak üzere TSA plakaları üzerine Plate seri seyreltme,
- Çeşitli alanlarda bir ters ışık mikroskobu kullanarak boncuk çapını ölçün. Bir kordon çapı (100-200 um arasında olmalıdır
- 4 ° C de bir gece boncuk saklayın
Şekil 1. Agar boncuk hazırlama ve fare enfeksiyon bakış. P. aeruginosa hücreler PBS içinde 1 ml yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve sıvı TSA (50 ° C) 9 ml eklenir. Bu karışım, bir şişe içinde 50 ° C de, 150 ml, ağır mineral yağ ilave edildi ve oda sıcaklığında 6 dakika boyunca yüksek hızda karıştırılır. Şişe 35 dakika boyunca yavaş bir karıştırma ile 4 ° C'ye soğutulur, agar boncuk oluşturma katılaşarak ve bu karışım içinde mevcut bakteri agar boncuklar içine gömülürler. Bakteriyel hücreler ihtiva eden bir agar kordonun Detay (A) gösterilmektedir. Steril PBS ile birkaç yıkama ile mineral yağı ayrılmasından sonra, agar-boncuk süspansiyonu f hazırya da soluk borusuna enjeksiyon (B) farelerin akciğerlerinde aşılama. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
3. Agar-boncuk olan fareler meydan
Etik Beyanı: Bu protokol ve deney San Raffaele Bilimsel Enstitüsü hayvan bakımı ve etik komitesinin yönergeleri izleyin.
- Agar-boncuk süspansiyon CFU / ml sayısını belirlemek için TSA plakaları üzerine koloni oluşturan birim sayısı (CFU) sayısı. 50 ul 1-2 x 10 6 optimal inokülümü elde etmek için 2-4 x 10 7 CFU / ml steril PBS ile agar-boncuk seyreltin.
- C57Bl/6NCr (6-8 haftalık, 20-22 g) ile 0.002 ml / g vücut ağırlığı hacminde tatbik% 0.9 NaCI içinde ketamin (50 mg / ml) ve ksilazin (5 mg / ml) ile birlikte erkek farenin anestezisi intraperitoneal enjeksiyonu.
Not: Anestezi adeq düşünülmektedirUATE hayvan sessizce hala kaldığında, dış uyaranlara yanıt vermeyen ve sürekli kalp ve solunum oranları vardır. - Yatar pozisyonda fare yerleştirin. % 70 etanol ile fare kat dezenfekte edin.
- Cilt dikey kesim tarafından trakea Açığa ve trakea içine aşağı hareket ederken stylette kaldırmak dikkat tutarak, steril, esnek 22 G 0,9 mm x 25 mm IV kateter ile trakea entübe. Değil çok derin trakea içine kateter yerleştirin. Karina (çatallanma) ulaşmadan önce durdurun.
- Derhal bir 1 ml şırınga ile agar boncuk süspansiyonu, 50 ul bir hacmi almak ve katetere ekleyin. Yavaşça boncuklar akciğer içine implante izin vererek, şırınga pistonu itin. Dikiş klipleri kullanarak kesi kapatın.
- Tamamen uyanık kadar bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin.
4. Fareler Değerlendirme
- Ceket kalitesi, duruş dahil klinik belirtileri için günlük fareler gözlemlemek,ambulasyon ve hidrasyon durumu. Günlük vücut ağırlığı izleyin. ≥% 20 vücut kilo Fareler ötenazi edilmelidir.
- Bronkoalveoler lavaj (BAL) ile akciğer toplanması ve toplam CFU analizinde, histolojik analiz, BAL, sitokin analizleri için toplam ve diferansiyel hücrelerin sayısı açısından iltihap tepkisi ve için İlgi 6 ya da 7 toplanması için Noktası 5 izleyin miyeloperoksidaz (MPO) etkinliği.
5. BAL Sıvı Toplama ve Analizi
- CO 2 inhalasyon yoluyla fareler Euthanize.
- Yatar pozisyonda fare yerleştirin. % 70 etanol ile fare kat dezenfekte edin.
- Cilt dikey kesik ile trakea ve göğüs kafesi Açığa. Diyafram keserek akciğerleri Açığa.
- Cımbız kullanarak trakea altında bir dikiş ipliği takın ve bir steril, esnek 22 g 0,9 mm x 25 mm IV kateter ile trakea entübe. Ca bağlamak için dikiş ipliğinin her iki ucu çekintrakea için theter ve trakea etrafında iplik düğüm.
- Bir 1 ml şırınga ile RPMI 1640 içinde 1 ml'lik bir hacim alın ve katetere ekleyin. Akciğer yıkama ve hemen sıvı geri, bir 15 ml tüp içinde depolamak için, enjektörün pistonu itin.
NOT: sitokinler analiz edilecek ise, RPMI 1640 proteaz inhibitörleri ekleyin. - RPMI 3 ml bir toplam Bu adımı üç kez tekrarlayın. Şu andan itibaren, buz üzerinde BAL sıvısı saklayın. Akciğerlerin toplama ve analiz için 6. adıma gidin.
NOT: tüm sıvı (2.8 ml maksimum) alınacağını unutmayın. - BAL sıvısında bulunan bakteri miktarının için, küçük bir kısım (300 ul) örnek, seri TSA plakaları üzerinde, steril PBS içinde plaka 1:10 seyreltin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir Bürker hücre sayısı odası içinde Tuerk çözeltisi ile BAL sıvısı 1:02 arasında bir kısım seyreltilmesi ters bir ışık optik mikroskop kullanılarak toplam hücre sayımı.
- R santrifüj4 ° C 'de 8 dakika boyunca 330 x g BAL sıvısı emaining -80 ° C'de depolamadan, ELISA sitokin analizi için üstteki sıvı kısmı alınır Sitospin tarafından diferansiyel hücre sayımı için adımları 5,10-5,13 izleyin.
- Pelet kırmızı ise, RBC liziz tamponu 250-300 ul içinde topağın tekrar askıda eritrositler 3 dakika için ultra-saf damıtılmış su içinde 1:10 seyreltilir lize edildi. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 330 x g, 2 ml PBS ve santrifüj ile nötralize
- Süpernatant atılır ve RPMI,% 10 cenin sığır serumu (FBS) içinde pelletini. Toplam hücre sayısı göre 1 x 10 6 hücre / ml 'sağlayacak bir ses kullanın.
- Sitospin merkezine bakan karton filtreler ile Sitospin uygun yuvalara mikroskop slaytlar ve filtreleri yerleştirin. 5 dakika boyunca 300 x g'de bir sitosantrifüj olarak Sitospin ve santrifüj uygun kuyulara her bir numune 150 ul Pipet.
- Ma göre, Romanowsky bir ticari kit kullanılarak boyanarak slaytlar Lekenufacturer talimatları ve daha önce 12 açıklandığı gibi. Adımları MPO aktivite analizi için 5,14-5,17 izleyin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 380 x g 'de BAL kalan hacmi santrifüj Süpernatant atılır ve hücreleri lize etmek için ultra-saf damıtılmış su içinde heksadesiltrimetilamonyum klorür,% 0.5 250 ul pelletini. Süspansiyon deneyi gerçekleştirmeden önce birkaç gün -20 ° C de dondurulabilir.
- 30 ° C'de 4 dakika ve numunenin aynı zamanda uygun seyreltmeleri, iyi ve eğer gerekli her iki kez örneği ekleyerek, 96 oyuklu plakalar içinde MPO deneyi gerçekleştirmek için süpernatan kullanım için 16,000 x g'de santrifüjleyin.
- Kuyularda her bir örneğe ekle 3,3 eşit hacimde ', 5,5' da peroksidaz için bir alt-tabaka olarak-tetrametilbenzidin (TMB). Renginde bir gelişme söz kadar reaksiyon, en az 5 dakika süreyle karanlıkta yer alan ve izin verin.
- 2 MH 2 SO 4 ilave ederek reaksiyonu durdurunnd 450 nm'de OD'yi ölçün. OD değeri peroksidaz aktivitesi ile doğrudan orantılı olacaktır.
6. Akciğer ve Sitokin Analizi Bakteriyel Yük Ölçümü
- Hemen BAL sıvı toplandıktan sonra, fare tüketim akciğerler, steril PBS ayrı lobları yıkayın steril 2 ml PBS ile bir yuvarlak alt tüp koyun ve buz üzerinde saklayın.
NOT: sitokinler analiz edilecek ise, tüplere PBS proteaz inhibitörleri ekleyin. - Aseptik akciğer homojenleştirmek, homojenattan küçük bir kısım (300 ul) almak, seri TSA plakaları üzerinde, plaka PBS içinde 1:10 seyreltilmiş ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Toplam hava yolu bakteriyel yük BAL sıvısı ve akciğer bulunan CFU toplamı olacaktır unutmayın.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 16,000 xg'de kalan Homojenat santrifüj -80 ° C de ELISA sitokin analizi için supernatant ve mağaza almak
7. Histolojik Sınav
<ol>Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol P., doğru yapıldığında aeruginosa agar-boncuk 100-200 arasında mikron ölçmek ve bir slayt üzerinde agar-boncuk süspansiyon küçük bir hacim pipetleyerek bir ters ışık mikroskobu ile görülebilir. Şekil 1 'de ayrıntılı olarak gösterildiği gibi tek bakteri hücreleri, agar boncuk olarak görebilir.
P. seçimi agar-boncuk hazırlanmasında kullanılan aeruginosa ırk kritiktir. Şekil 2 ve Tablo 1 verileri P. ile farelerin enfeksiyonu takiben elde göstermektedir aeruginosa PAO1 referans laboratuvar suşu RP73 klinik izolat göre. Mortalite, enfeksiyonun ilk 3 gün içinde görülmüştür (Şekil 2A ve 2B), her iki soy için düşük ama PAO1 için daha yüksektir. Hayatta kalan farelerde kronik enfeksiyon yüzdesi bakımından kayda değer bir fark PAO1 ve RP73 mücadeleye davet edilen fareler arasında gözlemlenebilir. While 3 gün sonrası enfeksiyon, bütün fareler hala hem P. tarafından enfekte edildi aeruginosa suşları, bu zaman noktasından sonra bir farenin bakteri temizlenir ve diğerleri dengeli bir kronik enfeksiyon geliştirdi. Itibaren 7 gün kaynaktan kronik olarak enfekte farelerin yüzdesi suşları hem de 28 güne kadar sabit kalmıştır. PAO1 gösteren RP73 için yüzde% 75-87,1 (Şekil 2B) iken,% 20-27,8 (Şekil 2A) arasında değişmektedir farelerin bir yüzdesi, kronik enfeksiyona yol açmaktadır ki P. aeruginosa klinik suş PAO1 laboratuvar zorlanma göre kronik enfeksiyon oluşturarak daha verimli oldu. 3 gün Enfeksiyondan bakteri sayıları 7 gün sonra, RP73 (1.3 x 10 6 CFU / akciğer) (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında (Şekil 2C ve Tablo 1) (5 x 10 7 cfu / akciğer) PAO1 için daha yüksekti Kronik enfeksiyon kurulduğunda itibaren, bakteri yükü 10 arasındaki stabilize <sup> iki suş için 4 ve 10 5 CFU / akciğer. Kronik enfeksiyon kurulduktan sonra, CFU / akciğer sayısının bir ay içinde önemli ölçüde değiştirmez. Ayrıca, solunum yollarında bakteri yükü farklı bakteri türleri 9,13 ile mücadeleye davet edilen fareler arasında benzer.
Ev sahibi enflamatuar yanıtı ve histopatolojik dahil olmak üzere diğer okumaları, meydan zamanı itibarıyla farklı zaman noktalarında ölçülebilir. Şekil 3 7 gün P ile meydan gelen fare BAL sıvısındaki lökosit temini açısından enflamatuar cevabı göstermektedir aeruginosa RP73 klinik suşu agar-boncuk gömülü. RP73-enfekte edilmiş farenin enfekte edilmemiş fareler ile karşılaştırıldı. Diferansiyel hücre sayısı nötrofiller, makrofajlar ve lenfositler dahildir. Toplam hücre sayısı, enfekte edilmemiş fareler ile karşılaştırıldığında RP73 enfeksiyonlu farelerde önemli ölçüde daha yüksektir. Nötrofiller, özellikle, enfekte olmayan farelerinin BAL sıvısında neredeyse tamamen yok, en repr idikronik enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından ciddi bir tepki yüzdesini gösteren RP73 enfeksiyonlu farelerde esented hücre türü.
Farelerden alınan Akciğerlerin Histopatolojik analiz, kronik olarak enfekte olmuş olan P. aeruginosa RP73, enfeksiyon çoğul-odak olduğunu göstermektedir. 4C ve 4F (Şekil 4B ve 4E) etkilenmemiş ya da marjinal katılan diğer lobları daha karmaşıktır bir lobun göstermektedir. Boncuklar bronş lümen gözlenebilir ve bakteriyel hücrelerin mikrokoloniler (Şekil 4C ve 4F) boncuk olarak görebilir. Enfeksiyonu ile ilgili alanlarda akciğer histopatolojisi bronşlara ve akciğer parankimi enflamatuar lezyonlar görüldü. Parankim makrofajlar, lenfositler ve bazı nötrofiller tarafından sızmış oysa bronşlar, boncuk çevreleyen büyük bir nötrofil inflamasyon tarafından doldurulmuştur. HistolojiEnfekte olmamış bir fare, bir kontrol olarak kullanılmıştır; parankimi ve bronşlar, hem enflamatuar hücrelerden (Şekil 4A ve 4D) berrak idi.
Şekil 2. P. zaman ders PAO1 referans suşu ve RP73 klinik suş. C57BL/6NCrl (20-22 gr) erkek fareler P. 1 6 10 x 5 CFU ile soluk borusuna enjeksiyon yoluyla enfekte ile aeruginosa kronik enfeksiyon aeruginosa'nın PAO1 (A ve C) veya RP73 (B ve D) agar-boncuk gömülü. Her bir zaman noktası için, histogram bakteremi (kırmızı) ve hayatta kalma (gri) veya enfeksiyon temizlenir hayvanların yüzdesi (sebep olduğu ölüm oranı temsil ederbeyaz) ve kronik enfeksiyon (yeşil kurmak mümkün olanlar) (A ve B). Hayatta kalan fareler, belirtilen zaman noktalarında kurban edilmiştir ve akciğerleri hasat edildi, homojenize edilir ve bakteri yükü belirlemek için TSA plakaları üzerinde kültürlenmiştir. Murin akciğer PAO1 ve RP73 soylarının büyüme eğrileri (C ve D) gösterilmiştir. Nokta bireysel ölçümleri temsil ve yatay çizgiler medyan değerleri temsil eder. Fisher testi ile istatistiksel anlamlılık belirtilir: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Tablo 1. P. zaman ders aeruginosaPAO1 referans suşu ve RP73 klinik suş ile kronik enfeksiyon. Mortalite ve PAO1 ve RP73 enfekte farelerde ve akciğer (medyan) başına CFU sayısı kronik enfeksiyon yüzdeleri gösterilmiştir. Değerler Farklı deneylerden 2-4 arasından seçilir. N, no. toplanmış Farelerin oluşturduğu her bir durum için analiz edilmiştir. Fisher testi ile istatistiksel anlamlılık belirtilir: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. RP73 klinik suşu ile kronik enfeksiyon 7 gün sonra BAL sıvısı iltihabı değerlendirilmesi. (A) grafik toplam içeriğini gösterirlökositler, nötrofil ve monosit / makrofajlar, enfekte olmamış farelerin (kontrol) kıyasla cebine 7 gün sonra RP73, kronik olarak enfekte farelerinin BAL sıvısında iyileşti. Ortalama değerler ve SEM gösterilir. (B) okların altına kutusuna nötrofil belirtmek ve Sitospin sonra slayt üzerinde bir noktada görülen bir makrofaj. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. RP73 klinik suşu ile kronik enfeksiyon 7 gün sonra hematoksilin ve akciğerler histolojik bölümler üzerinde eozin boyama. Panel enfekte edilmemiş fareler (A ve D) ve akciğer bölümlerinin Challeng farelerin hematoksilin ve eozin boyama gösterirRP73 (B, C, E, F) ihtiva ed ile agar-boncuk. Enfeksiyon Çok-fokal ve diğerleri etkilenmemiş ya da marjinal ilgili (B ve E), oysa genel olarak, bir veya daha fazla, akciğer lobları (C ve F) içerir. Oklar bronş lümen (b) çökelmiş agar boncuk göstermektedir. Hatları (A, B, C) 250 um;. Hatları (D, E, F) 100 mikron büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
P. kritik adımlar aeruginosa-boncuk hazırlama ve fare meydan aşağıda rapor edilmiştir.
Farenin meydan okuma için kullanılan P. aeruginosa ırk kritiktir. Mortalite, kronik enfeksiyon veya açıklık meydan okuma için kullanılan bakteri suşuna bağlı olarak önemli ölçüde farklılık gösterebilir. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu PAO1 referans laboratuvar suşu tercih edildi. Ön-klinik çalışmalarda ilaç testi P. yapılmalıdır Uzun süreli kronik enfeksiyon oluşturarak kendi yüksek verimlilik için seçilen aeruginosa suşları. Bu bilim doğrulama ve istatistiksel analiz 10,11 gereklerine uygun olan farelerin sayısını en aza indirir.
Tek tek S. aeruginosa agar-boncuk preparatlar boyutunda ve CFU / ml olarak değişir. Bir a150 um ile 2 x 10 7 CFU / ml 'lik verage çapı uygun olarak kabul edilir. Boncuk büyüklüğü, soğutma aşamasında (aşama 2.9) boyunca karıştırma oranı ile etkilenir. (<1 mm) karıştırılmış olan, çok yavaş bir şekilde büyük ve amorf ise (50 um en yüksek hızda karıştırıldı Boncuklar)> küçük ve küreseldir. Meydan okuma için son seyreltme hazırlandığında yüksek bakteri yükü olan aşırı seyreltilebilen Buna ek olarak, düşük bakteriyel bir yük ile boncuk yapışkan olabilir. Aşırı sulandırılmış boncuk kronik enfeksiyon yokluğunda neden olabilir iken yapışkan boncuklar ile farelerin Aşılanması nedeniyle kısa bir süre mücadeleden sonra boğulma farelere yüksek mortalite ile ilişkilidir. , Soluk borusuna enjeksiyon optimum hacmi 50 ul, ancak en fazla 100 ul yüksek miktarlar inoküle edilebilir. Aşılanmış doz x 10 6 x 10 5 ve 5 arasında 5 CFU / fare aralıkları zaman farelerin ölüm veya kronik enfeksiyon farklılıklar nadiren gözlenmektedir.
Appropriate bakteri büyüme ortamı taneler agar oluşumu için kullanılmalıdır. Bu durumda, P. aeruginosa TSA gömülü halde diğer kağıtları Burkholderia cenocepacia besin sıvısı agar 14,15 dahil edildi bildirdi. Agar boncuk mikrokoloniler 9 tek hücrelerden bakteri yayılması için gerekli bir besin ortamı microanaerobic sağlamalıdır.
Solunum çaba kullanılan anestezik ve dozuna bağlı olarak değişir ve ameliyat sonrası mortaliteyi etkilemektedir. 0.01 mg / g vücut ağırlığı bir dozda 0.1 mg / g vücut ağırlığı andxylazine bir dozda ketamin en iyi seçimdir. Fareler P. tarafından aşılanır zaman fareler kateter ve gözle görülür sığ entübe zaman solunum normaldir aeruginosa agar-boncuk. İdeal olarak, P. enjeksiyon aeruginosa agar-boncuklar, 50 ul bir optimum hacmi ile yavaş yavaş yapılmalıdır. 100 ul kadar daha yüksek miktarlar daha yüksek ölüm oranı ile sonuçlanabilirve fareler iyileşme daha fazla zorluklar. Intratrakeal cerrahi ile meydan bütün fareler yeterince bulaşmış.
P. aeruginosa RP73 agar boncuk kaynaklı kronik pnömoni, bu modelde, enfeksiyon Çok-fokal ve genel olarak bütün akciğer ödün vermeden, bir ya da daha fazla, akciğer lobları içerir gösterir. Sonuç olarak, bakteri yükü ve enflamatuar yanıtın değerlendirilmesi, toplam akciğer gerçekleştirilmelidir. Seçici lob analizi doğru ve geçerli sonuçlar üretmez. Farelerin bir enfekte olmamış grup bir kontrol olarak ilave edildi ve nedeniyle prosedürde kontaminasyonların veya hata için BAL sıvısında veya akciğerin histolojide hücresi alımının herhangi bir potansiyel bir anormallik tespit etmek için, enfekte edilmiş fareler ile karşılaştırılmalıdır. Tüm laboratuvar personeli fare gözlem için uygun becerileri eğitilmelidir Bu model bir BSL2 laboratuvar kuruldu. Fareler aşağıdaki parametreler için günde iki kez izlenmiştir: piloerection, tutum, Hareket, solunum, merak, burun salgısı, tımar ve dehidratasyon. , ≥% 20, vücut ağırlığını kaybetti ve böyle pasaklı ceket, hareketsizlik, iştah kaybı, zayıf lokomosyon, veya ağrılı duruş gibi, ciddi bir klinik hastalık kanıt gösterdi fareler deney feshinden önce ötenazi edildi. P. ile enfekte edilen farelerin PAO1 ile enfekte edilmiş fareler ile karşılaştırıldığında aeruginosa RP73 agar-boncuk enfeksiyondan üç gün içinde rahatsızlık alt belirtileri gösterdi. Bu sefer noktadan sonra bazı fareler bakteri temizlendi ve diğerleri 28 gün kadar süren bir stabil kronik enfeksiyonu gelişti.
Biz bu yazıda teklif kronik enfeksiyon modeli istikrarlı P ikna etmek mümkün olduğunu gösterdi Farelerde kronik aeruginosa enfeksiyonu. Bu yöntem, patojen hastalık oluşturma ve bir ev sahibi savunma 8,9,16 veya anti-bakteriyel ve anti-enflamatuar moleküllerin 10,11 ilaç testleri için altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için optimize edilmiştir. Tuygun hayvan modellerinde, bu bileşiklerin de klinik öncesi doğrulama CF hastalarda akciğer enfeksiyonu için gelecekteki terapötik müdahaleler için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bragonzi laboratuarında Araştırma İtalyan Kistik Fibrozis Vakfı (CFaCore) ve AB-F7-2009-223670 tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışmanın bir parçası alembic, gelişmiş mikroskobu laboratuvarında gerçekleştirildi ve fare histopatoloji Patolojik Anatomi (San Raffaele Bilimsel Enstitüsü) Ünitesinde yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
