Abstract
Cell / partikel adhæsionsassays er afgørende for at forstå de biokemiske vekselvirkninger i sygdom patofysiologi og har vigtige anvendelser i jagten på at udvikle nye lægemidler. Analyser ved hjælp af statiske forhold undlader at fange den afhængighed af vedhæftning på forskydning, hvilket begrænser deres korrelation med in vivo-miljø. Parallelle plade strømningskamre at kvantificere vedhæftning under flow fysiologisk væske behov for flere forsøg til generering af en forskydningshastighed vedhæftning kort. Desuden repræsenterer de ikke in vivo skala og morfologi og kræver store mængder (~ ml) af reagenser til eksperimenter. I denne undersøgelse viser vi, generering af shear vedhæftning kort fra et enkelt eksperiment ved hjælp af en mikrovaskulær netværk baseret mikrofluid enhed, SynVivo-SMN. Denne enhed genskaber komplekset in vivo vaskulatur herunder geometriske skala morfologiske elementer flow funktioner og cellulære interaktioner i enin vitro-format, hvilket giver et biologisk realistisk miljø for grundforskning og anvendt forskning i cellulær adfærd, drug delivery, og lægemiddelforskning. Assayet blev påvist ved at undersøge interaktionen af de 2 um biotin-overtrukne partikler med avidin-coatede overflader af mikrochip. Hele området af forskydning observeret i mikrovaskulaturen er fremstillet i et enkelt assay muliggør vedhæftning vs shear map for partiklerne under fysiologiske betingelser.
Introduction
Aktuelle analyser for at studere til celle-celle-og partikel-celle interaktioner typisk involverer statiske godt pladeformat i hvilke partikler eller celler inkuberes på protein matricer eller omliggende celler. Ved afslutningen af den angivne inkubationstid, er antallet af adhærente partikler eller celler kvantificeres ved hjælp af mikroskopi 1. Selv om disse undersøgelser giver betydelig indsigt i de biokemiske processer bag disse interaktioner, en central begrænsning er den manglende fysiologisk væske flow (typisk for mikrocirkulationen), og dens indvirkning på partikel vedhæftning.
For at overvinde denne begrænsning, har in vitro strømningskamre blevet udviklet i de seneste år. Et fælles element i disse strømningskamre er en gennemsigtig apparat perfunderet ved lave Reynolds tal til at matche vægforskydningshastighed satser observeret i blodkar in vivo 2. Karvæggen er modelleret ved enten belægning af biomolekyler eller vækst af celler på en overflade af strømmen cHamber 3. Partikler 4-7 eller celler 8-16 derefter flød ind på det ønskede flowhastigheder at kvantificere antallet af vedhængende partikler under forskellige forskydningsforhold.
Men brugen af parallelle plade strømningskamre at undersøge og validere de biokemiske fænomener er temmelig dyrt og tidskrævende. Dette skyldes primært det faktum, at flere forsøg skal udføres til generering af et kort over den fluide forskydningskraft vs antallet af partikler / celler klæbet. Desuden plade strømningskamre kræver store mængder reagenser på grund af deres store størrelse (højde> 250 um og bredde> 1 mm). Endelig har disse enheder ikke præcist modellere geometriske funktioner (f.eks bifurkationer) og flow (f.eks, konvergerende vs divergerende strømme), der er til stede in vivo.
Nylige fremskridt inden for litografi baseret microfabrication 17-19 har fremskyndet inden for lab-on-a-chipenheder 20-21. Disse enheder har været medvirkende til at udvikle en miniature udgave af den parallelle plade flowkammer med dimensioner i mikrometer regime. Reduktionen i dimension giver også betydelige fordele i form af mængder af reagenser, celler eller partikel kræves for eksperimenter. Men en vigtig begrænsning af de for tiden tilgængelige indretninger er brugen af lineære kanaler til at modellere mikrokar, som ikke efterligner den komplekse mikrovaskulatur observeret in vivo.
Vi har for nylig udviklet en ny metode til at genskabe mikrovaskulære netværk på engangs plast substrater, hvilket resulterer i syntetisk repræsentation af in vivo. Disse enheder betegnes SynVivo-Syntetiske Mikrovaskulære Networks (SMN), er udviklet ved hjælp af PDMS baseret soft-litografi proces. SynVivo-SMN enheder kan bruges til at opnå shear vedhæftning kort celle / partikeladhæsion 22, studere målrettet drug delivery 23 og have blevet valideret mod in vivo data 24-25. I dette papir, præsenterer vi en protokol, der muliggør generation af shear vedhæftning kort fra et enkelt eksperiment i mængder så små som 1-5 pi hvilket resulterer i betydelige besparelser af ressourcer og tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Priming den SynVivo-SMN Mikrofluid Device
- Hver port (indløb / udløb) af indretningen består af to parallelle porte - én for flyder i overfladecoatingfarver dele (adhæsionsmolekyler, vækst matricer, osv.) og / eller celler til podning, og den anden til at køre assayet (figur 1A ).
- Helt nedsænkes SynVivo-SMN mikrofluid enhed (figur 1B) i en petriskål, der indeholder vand sterilt deioniseret (DI) og placer fadet i vakuum. Lad ekssikkator køre, indtil al luften er fjernet fra kanalerne i enheden. Det tager cirka 15 minutter.
- Før du fjerner enheden fra vandet, placeres Tygon slange (OD på 0,06 "og id på 0,02"), primet med vand i hver havn af enheden med fine-punkts pincet. Slangen skal være ca 1 cm i længden. Apparatet kan nu fjernes fra vandet. Figur 1C viser billedet af Devae med slangen.
2.. Coating Mikrofluid enhed med ønsket protein (f.eks Avidin)
- Ved hjælp af en pipette, placere en dråbe vand (ca. 100 ul) rundt i bunden af den ene indgangsport slange. Fjern forsigtigt slange, der anvendes til at prime enheden. Faldet af vand vil forhindre luft ind i indretningen.
- Der fremstilles en 1 ml sprøjte fyldt med avidin i en koncentration på 20 ug / ml. Forbind sprøjten med en 24 G kanyle af rustfrit stål og slange. Sæt slangen til en af indgangsportene på enheden. Spænd indgangsporten ikke udnyttes med en kæbe klemme.
- Injicer avidin ved en strømningshastighed på 1 ul / min i 10 minutter for at tillade fuldstændig perfusion af enheden. Ved afslutningen af strømmen tid klemme slangen med kæben klemme og placere enheden ved 4 ° C natten over.
3.. Flyder det Biotinylated Partikler vedhæftningstesten Eksperimenter
- Lad enhedenkomme til stuetemperatur. Placer enheden på en inverteret fluorescens-mikroskop er udstyret med en motoriseret scene og en højtydende kamera.
- Der fremstilles en opløsning af 2 um biotinylerede partikler ved en koncentration på 5 x 10 6 partikler / ml i phosphatpuffersaltopløsning (PBS). Load partiklerne i en 1 ml sprøjte. Forbered en anden 1 ml sprøjte med kun PBS. Load hver sprøjte på en sprøjtepumpe og oprette forbindelse til nål og slange.
- Ved hjælp af en pipette, placere en dråbe vand (ca. 100 ul) omkring bunden af fjorden røråbningsorganer. Fjern forsigtigt slange, der anvendes til at belægge enheden. Faldet af vand vil forhindre luft ind i indretningen.
- Sæt forsigtigt slangen er for biotinylerede partikler og PBS fra trin 3.2 i hver af indløbsportene. Figur 2A viser billede af set-up.
- Start injektion biotinylerede partikler ved en strømningshastighed på 2,5 ul / min. Overvåg indløbsporten på mikroskopet. Ved det første tegnaf partikler, begynder timeren og fortsætter flow for 3 min.
- Ved afslutningen af de 3 minutter, stoppe strømmen af biotinylerede partikler samtidig stirrer strømmen af PBS ved en strømningshastighed på 2,5 ul / min. Tillad PBS til at strømme i apparatet i 3 minutter for at vaske ubundne partikler.
4.. Erhvervelse billeder og Making interesseområde (AOI) målinger ved hjælp Imaging Software (NIKON Elements)
- Brug "scan stort billede"-funktionen i imaging software til at hente billedet af hele enheden.
- Sekventielt nummererer bifurkationer i enheden, og skabe en cirkulær AOI med dobbelte diameter af kanalerne. I dette tilfælde indstilles AOI diameter til 200 um, idet kanalen diameter er 100 um.
- Brug den automatiske optælling funktion i imaging software til at eksportere antallet af partikler i hver AOI til en MS Excel-ark.
- Ligeledes bruger den automatiske optælling funktion for at eksportere antallet af partikler i heleenhed.
5.. Particle Flux Analyse Brug Computational Fluid Dynamics (CFD) Modeller
- CFD-simuleringer køres ved hjælp af kommercielt tilgængelige software (CFD-ACE +, ESI Inc.) for SynVivo-SMN enhed topologi. Resultaterne er lagret i en database til analyse af eksperimentelle observationer. Simuleringen resultater gemme informationer på væggen shear satser, hastighed, partikel flux og vedhæftning i enheden.
- Simuleringen Resultaterne bruges til at bestemme antallet af partikler, der kommer ind hver AOI baseret på en given koncentration indløb partikel.
6.. Generering Shear Vedhæftning Kort
- Beregn% af adhæsion ved at dividere de adhærerede partikler i forgreningen af partiklerne strømmer i forgreningen som vist i ligning 6.1.
hvor der opnås antallet af partikler adhærerede og partiklerne strømmer ud fra protokol trin 4.3 og 5.2, hhv. - Plot shear vedhæftning kortet ved hjælp af shear rate på hvert tvedeling af de opnåede fra databasen i trin (5.1) net og% vedhæftning værdier fra ligning 6.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1A viser en skematisk og et lyst felt billede af SynVivo-SMN enhed. Figur 1B viser SynVivo-SMN monteret på et objektglas. Figur 1C viser indretningen med slangen efter priming med vand i vakuum.
Figur 2A viser et billede af den eksperimentelle-oprettet. Figur 2B viser et typisk avidinbelagt SynVivo-SMN enhed efter binding af 2 um biotinylerede partikler. Bemærk, at partiklerne fortrinsvis klæbe nær bifurkationer i netværket.
Figur 3A viser de nummererede bifurkationer i SynVivo-SMN netværk. 3B viser prøve vægforskydningshastighed kort genereret af CFD model af enheden. Forskydningshastigheden varierer i indretningen i området fra 250 sek-1 til 15 sek-1 som observeret i mikrovaskulaturen in vivo. Bemærk, at de varierendeforskydningshastigheder kan ikke opnås samtidigt i lineære mikrofluidkanaler, da de giver en konstant forskydningshastighed for hver strømningshastighed. Figur 3C viser et plot af værdier forskydningshastigheden ved hvert af bifurkationer af netværket. Dataene viser, at forskydningshastigheden mønstre er komplekse og kan ikke opnås med en enkelt analytisk forhold modsætning lineære strømningskanaler. Desuden flere bifurcations (AOI'er) er til stede i det netværk, der falder i den samme forskydning bin, tilføjer den statistiske tillid af data.
4A viser prøveresultater af CFD analyse for partikel fluxe i det net, der anvendes til at beregne partikel flusmidler filialer og bifurkationer af eksperimentelle netværk. 4B viser forskydningsstyrken vedhæftning kort beregnet ud fra det indre SynVivo-SMN eksperiment. Det shear vedhæftning maps følger det omvendte forhold som observeret fra shear vedhæftning kort fås fralineære kanal eksperimenter. Men i modsætning ved hjælp af en SynVivo assay, en enkelt eksperiment tillader generation af denne forskydning kort i modsætning til flere eksperimentelle kørsler, der kræves fra de lineære kanaler, hvilket resulterer i betydelige besparelser af tid og ressourcer. Bemærk, at eksperimenter er kørt i tre eksemplarer for maksimal statistisk analyse.
Figur 1. SynVivo-SMN enheder. Venstre panel (figur 1A) viser en skematisk afbildning af enheden. Højre panel (figur 1A) viser lysfelt billede af enheden. Figur 1B viser SynVivo-SMN monteret på mikroskop objektglas. Figur 1C viser indretningen med Tygon ™ slange fastgjort til indløb / udløbsporte efter priming med vand.
Figur 2.. Typisk adhæsionsassay i SynVivo-SMN. Figur 2A viser et billede af den eksperimentelle-oprettet. Figur 2B viser biotinylerede partikler efter binding i enheden. Bemærk, at partikeladhæsion er fundet at være lokaliseret nær forgreningen i forhold til grenene af netværket.
Figur 3. Shear analyse SynVivo-SMN Figur 3A viser. Alle bifurkationer nummereret i netværk og et forstørret billede af bifurkationer fra forsøgene. 3B viser den kvalitative vægforskydningshastighed kort i bifurkationer i netværket. Figur3C viser de kvantitative oplysninger om forskydning i filialerne i netværket. Bemærk, at forskydnings-mønstre i netværket er komplekse og spænde de fysiologiske intervaller af forskydningshastigheder (0-240 sek -1) fundet in vivo.
Figur 4.. Generering af shear vedhæftning kort. Figur 4A fremhæver partikelbaner (vist i hvidt) i de netværk opnået fra CFD simulering. Disse baner er efterbehandlet for at opnå partikel flux i de forskellige grene og bifurkationer. Figur 4B viser forskydningsstyrken vedhæftning kortet fås fra en enkelt SynVivo-SMN eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parallelle plade strømningskamre, samtidig med at væsentlige indsigt i celle-celle-og celle-partikel vekselvirkninger, lider af adskillige begrænsninger, såsom højt forbrug af reagenser, og behovet for flere eksperimentelle kørsler til at generere en forskydningshastighed vedhæftning kort. Anvendelsen af SynVivo-Syntetiske Mikrovaskulære Networks (SynVivo-SMNs) muliggør generering af en forskydningshastighed vedhæftning kort fra et enkelt eksperiment under betingelser, der efterligner in vivo-betingelser. Desuden er betydelige besparelser (> 95%) i reagenser også opnået.
Det vigtigste skridt i køreklar partikeladhæsion eksperimenter med SynVivo-SMN er at sikre boble fri betingelser i chippen før eksperimenteren. Indførelse af bobler vil medføre flow ustabilitet og manglende adgang til "luft låst" områder af chippen. Derfor skal tages i løbet af indsætninger og ekstraktioner af slanger fra porte på enheden stor omhu. I tilfælde af en boble fundet i the enheden under priming trin, kan man gentage priming trin igen for at fjerne boblerne. Alternativt kan man flyde i medier / reagenser ved et lave strømningshastigheder (0,1 ul / min eller mindre) for at sikre boblefri priming af enheden.
Den vigtigste begrænsning af protokollen er chippen bliver uanvendelige efter tilstedeværelsen af en boble, der ikke kan fjernes. Men med omhyggelig praksis man kan udføre eksperimenter med næsten 100% succes. Også den generation af shear vedhæftning kort kræver oplysninger fra CFD-modeller. Dog kan en forud beregnet database af CFD resultater for forskellige strømningsforhold let at overvinde det er nødvendigt at udføre CFD-simuleringer.
Selv de metoder, der anvendes her, avidin-biotin-system til nem demonstration, kan enhver ligand-receptor kombination på partikler eller celler anvendes til at være studiet partikel-overflade eller celle-overflade vekselvirkninger i real-tid i enheden. Desuden kan celler cultured i enheden for at studere partikel-celle og celle-celle interaktioner. Kultur af celler kræver belægning af kanalerne i enhed med matrix egnet til ønskede celletyper. For eksempel kan endotelceller dyrkes på fibronectin belagte kanaler. Efter konfluens kan endotelceller aktiveres med TNF-α eller andre relevante cytokiner. Hvide blodlegemer (WBCs) kan injiceres og deres interaktioner på aktiverede endotelceller kan studeres realtid. Svarende til protokollen påvist i denne undersøgelse, kan en forskydningshastighed vedhæftning kort af hvide blodlegemer let genereres fra et enkelt eksperiment.
Den protokol, der er nævnt i dette dokument kan anvendes til at studere virkningen af netværk morfologi på partikel / celleadhæsion som en model for in vivo. Hertil kommer, at virkningen af strømmen på partikel / celleadhæsion og cellulær adfærd til at modellere fysiologiske betingelser kan også let vurderes. Endelig kan protokollen være osed at studere drug delivery og effektivitet for målrettet levering til ønskede cellulære populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Offentliggørelse gebyr for denne artikel sponsoreret af CFD Research Corporation.
Acknowledgments
SynVivo teknologi blev udviklet under tilskud # 2R44HL076034 fra NHLBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
- Weitz-Schmidt, G., Chreng, S.
- Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
- Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
- Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
- Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
- Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
- Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201 (2010).
- Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
- Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
- Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9 (2001).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
- Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
- Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- McDonald, J. C., et al.
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
- Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
- Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
