Abstract
Cel / deeltje hechting assays zijn cruciaal voor het begrijpen van de biochemische interacties betrokken bij de ziekte pathofysiologie met belangrijke toepassingen in de zoektocht naar de ontwikkeling van nieuwe therapeutica. Testen met behulp van statische omstandigheden niet aan de afhankelijkheid van de hechting op afschuiving vastleggen, het beperken van hun correlatie met in vivo omgeving. Parallelle plaat stromingskamers dat hechting kwantificeren onder fysiologische stroming moeten meerdere experimenten voor het genereren van een afschuifweerstand kaart. Bovendien, ze vertegenwoordigen niet de in vivo schaal en morfologie en vereisen grote volumes (~ ml) van reagentia voor experimenten. In deze studie demonstreren we de generatie afschuifweerstand kaart uit een experiment met behulp van een microvasculaire netwerk gebaseerde microfluïdische apparaat, SynVivo-SMN. Dit apparaat herschept het complex in vivo vaatstelsel inclusief geometrische schaal, morfologische elementen, stroom functies en cellulaire interacties in eenin vitro-formaat, waardoor een biologisch realistische omgeving voor fundamenteel en toegepast onderzoek in cellulaire gedrag, drug delivery en drug discovery. De assay werd aangetoond door de interactie van de 2 urn biotine beklede deeltjes met avidine gecoate oppervlakken van de microchip. Het volledige gamma afschuiving waargenomen in de microvasculatuur is verkregen in een enkele assay waardoor hechting tegen afschuiving map for de deeltjes onder fysiologische omstandigheden.
Introduction
Voor deze assays bestuderen in cel-cel en deeltjes-cel interacties omvatten gewoonlijk een statisch putjes waarin deeltjes of cellen worden geïncubeerd op eiwit matrices of adherente cellen. Aan het einde van de incubatietijd, is het aantal hechtende deeltjes of cellen gekwantificeerd microscopische 1. Hoewel deze testen leveren significant inzicht in de biochemische processen achter deze interacties, een belangrijke beperking is het ontbreken van fysiologische vloeistofstroom (typisch voor de microcirculatie) en de impact ervan op deeltje hechting.
Om deze beperking te overwinnen, hebben in vitro stromingskamers ontwikkeld in de afgelopen jaren. Een gemeenschappelijk element van deze stroming Chambers is een transparante inrichting doorbloed bij lage Reynolds getallen shear tarieven waargenomen in de bloedvaten in vivo 2 overeenkomen. De vaatwand wordt gemodelleerd door een bekleding van biomoleculen of groei van cellen op een oppervlak van de stroming cHamber 3. Deeltjes 4-7 of 8-16 cellen worden vervolgens stroomde op gewenste bereik van stroomsnelheden van het aantal hechtende onder verschillende afschuifsnelheden kwantificeren.
Het gebruik van parallelle plaat stroming kamers te bestuderen en bevestig de biochemische verschijnselen is nogal duur en tijdrovend. Dit is voornamelijk te wijten aan het feit dat meerdere experimenten moeten worden uitgevoerd voor het genereren van een kaart van de vloeibare shear versus het aantal deeltjes / cellen gehandeld. Daarnaast plaat stromingskamers vereisen grote hoeveelheden reagentia vanwege hun grote omvang (lengte> 250 micrometer en een breedte van> 1 mm). Tot slot, deze apparaten niet nauwkeurig geometrische kenmerken (bijvoorbeeld vertakkingen) en stroom (bv., convergerende vs divergerende stromen) die aanwezig zijn in vivo model.
Recente ontwikkelingen in de lithografie gebaseerd microfabrication 17-19 hebben op het gebied van lab-on-a-chip versneldeapparaten 20-21. Deze apparaten zijn instrumenteel in de ontwikkeling van een geminiaturiseerde versie van de parallelle plaat stroom kamer met afmetingen in de micrometer regime geweest. De vermindering van de dimensie levert ook aanzienlijke voordelen in termen van volumes van reagentia, cellen of deeltjes die nodig is voor experimenten. Echter, een belangrijke beperking van de momenteel beschikbare inrichtingen is het gebruik van lineaire kanalen model microvaatjes, dat de complexe microvasculatuur waargenomen in vivo niet nabootsen.
We hebben onlangs een nieuwe methode voor het herstellen microvasculaire netwerken op wegwerp plastic substraten waardoor synthetische voorstelling van de in vivo omstandigheden. Deze apparaten genoemd SynVivo-Synthetische Microvasculaire Networks (SMN) worden ontwikkeld met behulp van PDMS gebaseerde soft-lithografie-proces. SynVivo-SMN apparaten kunnen worden gebruikt om afschuifhechting kaart van de mobiele / deeltje hechting 22 te verkrijgen, studie gerichte toediening van medicijnen 23 en have gevalideerd tegen in vivo gegevens 24-25. In dit artikel presenteren we een protocol dat generatie van de afschuifhechting kaart stelt uit een experiment in volumes zo klein als 1-5 ul hetgeen resulteert in een aanzienlijke besparing van tijd en middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Priming de SynVivo-SMN Microfluidic Device
- Elke poort (ingang / uitgang) van de inrichting bestaat uit twee parallelle poorten - een voor stromen in oppervlaktecoating eenheden (adhesiemoleculen groei matrices, enz.) en / of cellen voor het zaaien en de andere voor het uitvoeren van de test (Figuur 1A ).
- Volledig onderdompelen SynVivo-SMN microfluïdische apparaat (Figuur 1B) in een petrischaal met steriel gedeïoniseerd (DI) water en plaats de schaal in een vacuüm exsiccator. Laat de exsiccator lopen totdat alle lucht uit de kanalen van de inrichting. Dit moet ongeveer 15 minuten duren.
- Voordat u het apparaat uit het water, plaats Tygon slangen (OD van 0,06 "en ID van 0,02") gegrond met water in iedere haven van de inrichting met fijne punt pincet. De buis moet ongeveer 1 cm in lengte. Het apparaat kan nu uit het water worden verwijderd. Figuur 1C toont beeld van de device met de slang.
2. De microfluïdische apparaat met gewenste eiwit Coating (bijv. Avidin)
- Met behulp van een pipet een druppel water (ongeveer 100 pl) rond de basis van de ene inlaatpoort buizen. Verwijder de slang gebruikt om prime het apparaat zorgvuldig. De daling van het water zal voorkomen dat er lucht in het apparaat.
- Bereid een 1 ml injectiespuit geladen met avidine in een concentratie van 20 ug / ml. Verbind de spuit met een 24 G roestvrijstalen naald en slangen. Plaats de slang aan een van de inlaatpoorten van de inrichting. Klem de inlaat poort niet wordt gebruikt met een kaak klem.
- Injecteer avidine met een stroomsnelheid van 1 pl / min gedurende 10 minuten om volledige perfusie van de inrichting mogelijk. Aan het einde van de looptijd, klem de buis met de kaak klem en plaats het apparaat bij 4 ° C overnacht.
3. Vloeiende de Biotinylated Deeltjes voor Adhesie Experimenten
- Laat het apparaatkamertemperatuur komen. Plaats het apparaat op een omgekeerde fluorescentie microscoop uitgerust met een gemotoriseerde podium en een high performance camera.
- Bereid een oplossing van 2 urn gebiotinyleerd deeltjes in een concentratie van 5 x 10 6 deeltjes / ml in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). Laad de deeltjes in een 1 ml spuit. Bereid een tweede spuit van 1 ml van alleen PBS. Plaats elke spuit op een injectiepomp en verbinding maken met naald en leidingen.
- Met behulp van een pipet een druppel water (ongeveer 100 pl) rond de basis van de inlaatpoort slang. Verwijder de slang gebruikt voor het bekleden van het apparaat zorgvuldig. De daling van het water zal voorkomen dat er lucht in het apparaat.
- Steek de slang voor gebiotinyleerde deeltjes en PBS uit stap 3.2 in elk van de inlaatpoorten. Figuur 2A toont beeld van de set-up.
- Begin het injecteren gebiotinyleerde deeltjes bij een stroomsnelheid van 2,5 ul / min. Monitor de inlaat poort op de microscoop. Bij het eerste tekendeeltjes, begint de timer en blijft stroom voor 3 minuten.
- Aan het einde van de 3 min, stop de stroom gebiotinyleerde deeltjes tegelijkertijd staren de stroom van PBS bij een stroomsnelheid van 2,5 ul / min. Laat PBS te stromen in het apparaat gedurende 3 minuten te wassen ongebonden deeltjes.
4. Afbeeldingen ophalen en Making Area of Interest (AOI) metingen met behulp van imaging software (NIKON Elements)
- Gebruik de functie "scan grote afbeelding" in de imaging software om het beeld van de gehele inrichting te verwerven.
- Opeenvolgend nummer van de vertakkingen in de inrichting en een cirkelvormige AOI met tweemaal de diameter van de kanalen. In dit geval stelt de AOI diameter tot 200 pm omdat het kanaal een diameter van 100 micrometer.
- Gebruik de automatische telling functie in de imaging software om het aantal deeltjes in elk AOI exporteren naar een MS Excel sheet.
- Gebruik ook de geautomatiseerde telling functie om het aantal deeltjes te exporteren in het geheleapparaat.
5. Deeltjesflux analyse met behulp van Computational Fluid Dynamics (CFD) modellen
- CFD simulaties worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (CFD-ACE +, ESI Inc) voor de SynVivo-SMN apparaat topologie. De resultaten worden opgeslagen in een database voor het analyseren van experimentele waarnemingen. De simulatieresultaten slaan informatie op de muur scheurverhoudingen, snelheid, deeltjesflux, en hechting in het apparaat.
- De simulatieresultaten worden gebruikt om het aantal deeltjes in elk AOI basis van een gegeven inlaat deeltjesconcentratie bepalen.
6. Genereren Shear Hechting Kaart
- Bereken% adhesie door deling van het gehecht deeltjes in de vertakking van de deeltjes stroomt in de vertakking zie vergelijking 6.1.
waarbij het aantal deeltjes gehecht en de deeltjes stromen verkregen uit pROTOCOL stappen 4.3 en 5.2, respectievelijk. - Teken de afschuifhechting kaart met behulp van de afschuifsnelheid bij elke splitsing van de resultaten van de database in stap (5.1) netwerken en het% hechting waarden verkregen uit vergelijking 6.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een helder veld een schematische en SynVivo-SMN apparaat. Figuur 1B toont de SynVivo-SMN apparaat gemonteerd op een glasplaatje. Figuur 1C toont het apparaat met slang na priming met water in een vacuüm exsiccator.
Figuur 2A toont een afbeelding van de experimentele opstelling. Figuur 2B toont een typische avidine beklede SynVivo SMN-inrichting binding van 2 urn gebiotinyleerde deeltjes. Merk op dat deeltjes hechten voorkeur bij vertakkingen in het netwerk.
Figuur 3A toont de genummerde vertakkingen in het SynVivo-SMN. Figuur 3B toont monster wandschuifspanning kaart gegenereerd door het CFD model van het apparaat. De afschuifsnelheid varieert in de inrichting van 250 sec -1 15 sec -1 zoals waargenomen in de microvasculatuur in vivo. Merk op dat deze variërendeafschuifsnelheden niet tegelijkertijd worden verkregen lineaire microfluïdische kanalen omdat ze een constante afschuifsnelheid voor elke stroomsnelheid. Figuur 3C toont een grafiek van de waarden van de afschuifsnelheid bij elk van de vertakkingen van het netwerk. De gegevens tonen dat de afschuifsnelheid patronen zijn complex en kunnen niet worden verkregen met een eenvoudige analytische relatie tegenstelling lineaire stroomkanalen. Bovendien, verschillende vertakkingen (AOI) aanwezig in het netwerk die vallen in dezelfde bak afschuiving, waardoor de statistische betrouwbaarheid van de gegevens.
Figuur 4A toont de resultaten van voorbeeld CFD analyses van deeltjesfluxen in het netwerk die worden gebruikt om de deeltjesfluxen berekenen in de takken en vertakkingen van de experimenteel netwerk. Figuur 4B toont de afschuifsterkte kaart berekend uit de interne SynVivo SMN-experiment. De afschuifhechting kaarten volgt de omgekeerde relatie gezien vanuit afschuifhechting kaart verkregen uitlineaire kanaal experimenten. In tegenstelling met een SynVivo assay een experiment kan generatie van deze afschuiving kaart tegenstelling meerdere vereist van de lineaire kanalen resulteert in aanzienlijke besparing van tijd en middelen experimentele runs. Merk op dat experimenten worden uitgevoerd in drievoud voor maximale statistische analyse.
Figuur 1. SynVivo SMN-apparaten. Linkerpaneel (figuur 1A) toont een schema van de inrichting. Helder veld beeld van het apparaat rechterpaneel (Figuur 1A) toont. Figuur 1B toont de SynVivo-SMN apparaat gemonteerd op de microscoop glasplaatje. Figuur 1C toont het apparaat met Tygon ™ slang aangesloten op de inlaat / uitlaatpoorten na priming met water.
Figuur 2. Typische adhesie assay SynVivo-SMN. Figuur 2A toont een afbeelding van de experimentele opstelling. Figuur 2B toont gebiotinyleerde deeltjes na binding in de inrichting. Merk op dat deeltje hechting blijkt te zijn gelokaliseerd nabij vertakking tegenover de takken van het netwerk.
Figuur 3. Shear analyse SynVivo-SMN. Figuur 3A toont alle vertakkingen genummerd in het netwerk en een vergrote weergave van vertakkingen van de experimenten. Figuur 3B toont de kwalitatieve shear kaart in de vertakkingen in het netwerk. Figuur3C toont de kwantitatieve informatie over afschuiving in de takken in het netwerk. Merk op dat de shear patronen in het netwerk zijn complex en span de fysiologische bereik van shear rates (0-240 sec-1) gevonden in vivo.
Figuur 4. Generatie van shear hechting kaart. Figuur 4A benadrukt de deeltjestrajecten (in het wit) in de netwerken verkregen uit de CFD simulatie. Deze trajecten zijn nabewerkt om deeltjesfluxen verkrijgen in de verschillende branches en de vertakkingen. Figuur 4B toont de afschuifhechting kaart verkregen uit een enkel SynVivo-SMN experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parallelle plaat stroomkamers, terwijl belangrijke inzichten in cel-cel en cel-deeltje interacties lijden aan verschillende beperkingen, zoals hoge consumptie van reagentia en de noodzaak voor meerdere experimentele runs een afschuifweerstand kaart te genereren. Het gebruik van SynVivo synthetisch microvasculaire Networks (SynVivo-SMNs) maakt het genereren van een afschuifweerstand kaart van een experiment onder omstandigheden nabootsen in vivo omstandigheden. Bovendien is aanzienlijke besparingen (> 95%) in reagentia ook verkregen.
De belangrijkste stap in het runnen van deeltje adhesie experimenten met SynVivo-SMN is ervoor te zorgen bubble vrije omstandigheden in de chip voorafgaand aan de experimenten. Introductie van bellen leidt tot instabiliteit en gebrek aan toegang tot vloeien "air geblokkeerd" gebieden van de chip. Vandaar dat veel zorg nodig heeft tijdens de toevoegingen en onttrekkingen van buizen uit de havens van het apparaat moeten worden genomen. Bij een luchtbel in the apparaat tijdens de priming stap, kan men de priming stap opnieuw herhalen om de bellen te verwijderen. Alternatief kan men stromen media / reagentia bij lage stroomsnelheden (0,1 pl / min of minder) om luchtbellen priming van het apparaat te verzekeren.
De belangrijkste beperking van het protocol is de chip onbruikbaar wordt gemaakt nadat de aanwezigheid van een luchtbel die niet kan worden verwijderd. Echter, met een zorgvuldige praktijk kan men experimenten uit te voeren met bijna 100% succes. Ook de generatie van afschuifhechting kaart behoeft van CFD-modellen. Toch kan een vooraf berekende database van CFD resultaten voor verschillende stromingsomstandigheden gemakkelijk overwinnen van de noodzaak de CFD simulaties.
Hoewel de hier gepresenteerde methode gebruikt de avidine-biotine systeem voor eenvoudige demonstratie kan elke ligand-receptor combinatie van deeltjes of cellen bestudeerd worden deeltjes-oppervlak of celoppervlak interacties in real time in het apparaat. Bovendien kunnen cellen worden cultured in het apparaat deeltjes-cel en cel-cel interacties te bestuderen. Kweek van cellen bekleding van de kanalen van de inrichting met matrix voor gewenste celtypen vereist. Zo kunnen endotheelcellen worden gekweekt op fibronectine gecoate kanalen. Na samenvloeiing, kan de endotheelcellen worden geactiveerd met TNF-α of andere relevante cytokinen. Witte bloedcellen (WBC's) kan worden geïnjecteerd en hun interacties op geactiveerde endotheliale cellen kunnen worden bestudeerd real-time. Net als het protocol aangetoond in deze studie, een afschuifsterkte kaart witte bloedcellen eenvoudig worden gegenereerd uit een enkel experiment.
De in dit document genoemde protocol kan worden gebruikt beïnvloeding netwerk morfologie van deeltjes / celadhesie onderzoeken als een model van in vivo omstandigheden. Bovendien, het effect van stroming op deeltjes / cel adhesie en cellulair gedrag modelleren fysiologische omstandigheden kan gemakkelijk worden geëvalueerd. Ten slotte kan het protocol onsed naar drug delivery en effectiviteit voor gerichte levering aan gewenste cellulaire bevolking te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vergoeding publicatie voor dit artikel gesponsord door CFD Research Corporation.
Acknowledgments
SynVivo technologie werd ontwikkeld in het kader van subsidie # 2R44HL076034 van de NHLBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
- Weitz-Schmidt, G., Chreng, S.
- Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
- Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
- Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
- Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
- Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
- Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201 (2010).
- Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
- Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
- Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9 (2001).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
- Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
- Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- McDonald, J. C., et al.
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
- Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
- Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
