Abstract
Ensayos de adhesión celular / partículas son fundamentales para la comprensión de las interacciones bioquímicas involucradas en la fisiopatología de la enfermedad y tienen importantes aplicaciones en la búsqueda del desarrollo de nuevas terapias. Los ensayos con condiciones estáticas no logran captar la dependencia de adherencia en cizalla, lo que limita su correlación con el medio ambiente en vivo. Cámaras de flujo de placas paralelas que cuantifican la adhesión bajo un flujo de fluido fisiológico necesitan múltiples experimentos para la generación de un mapa de adhesión por cizalladura. Además, no representan la escala in vivo y la morfología y requieren volúmenes grandes (~ ml) de reactivos para los experimentos. En este estudio, hemos demostrado la generación de cizalla mapa adhesión de un solo experimento utilizando una red microvascular basado en un dispositivo de microfluidos, SynVivo-SMN. Este dispositivo recrea el complejo en la vasculatura vivo incluyendo una escala geométrica, elementos morfológicos, las características de flujo y las interacciones celulares en unFormato in vitro, proporcionando de esta manera un ambiente biológicamente realista para la investigación básica y aplicada en el comportamiento celular, la administración de fármacos, y el descubrimiento de fármacos. El ensayo se demostró mediante el estudio de la interacción de las partículas de 2 micras de biotina-revestido con superficies recubiertas con avidina del microchip. Se obtiene toda la gama de cizallamiento observado en la microvasculatura en un único ensayo que permite la adhesión vs mapa de cizallamiento para las partículas en condiciones fisiológicas.
Introduction
Los ensayos actuales para estudiar a la célula-célula y las interacciones célula-partícula implican típicamente formato de placa de estática en la que las partículas o células se incuban en matrices de proteínas o células adherentes. Al final del tiempo de incubación especificado, los números de partículas adherentes o células se cuantifican mediante microscopía de 1. A pesar de que estos ensayos proporcionan una información valiosa sobre los procesos bioquímicos detrás de estas interacciones, una limitación clave es la falta de flujo de fluido fisiológico (típico de la microcirculación) y su impacto en la adherencia de partículas.
Para superar esta limitación, en cámaras de flujo in vitro se han desarrollado en los últimos años. Un elemento común de estas cámaras de flujo es un aparato transparente perfundido a bajos números de Reynolds para que coincida con velocidades de cizallamiento de pared observadas en los vasos sanguíneos in vivo 2. La pared del vaso se modela por cualquiera de recubrimiento de biomoléculas o crecimiento de células en una superficie del flujo Chamber 3. Las partículas de 4-7 o 8-16 células son luego fluyeron en al intervalo deseado de velocidades de flujo para cuantificar el número de adherirse partículas bajo diversas velocidades de cizallamiento.
Sin embargo, el uso de cámaras de flujo de placas paralelas para estudiar y validar los fenómenos bioquímicos es bastante caro y consume mucho tiempo. Esto se debe principalmente al hecho de que múltiples experimentos deben llevarse a cabo para generar un mapa de la cizalla de fluidos vs el número de partículas / células adheridas. Además, las cámaras de flujo placa requieren grandes volúmenes de reactivos debido a su gran tamaño (altura> 250 micras y la anchura> 1 mm). Finalmente, estos dispositivos no modelan con precisión las características geométricas (por ejemplo, bifurcaciones) y las condiciones de flujo (por ejemplo, convergentes vs flujos divergentes) que están presentes in vivo.
Los recientes avances en la litografía basada microfabricación 17-19 han acelerado el campo de lab-on-a-chipdispositivos 20-21. Estos dispositivos han sido fundamentales en el desarrollo de una versión en miniatura de la cámara de flujo de placas paralelas con las dimensiones en el régimen micrómetro. La reducción en la dimensión también produce beneficios significativos en términos de volúmenes de reactivos, células o de partícula requerido para los experimentos. Sin embargo, una limitación clave de los dispositivos actualmente disponibles es el uso de canales lineales para modelar microvasos, que no imitan la microvasculatura complejo observado in vivo.
Recientemente hemos desarrollado una nueva metodología para recrear las redes microvasculares sobre sustratos de plástico desechables resultantes en representación sintética de las condiciones in vivo. Estos dispositivos denominados redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SMN) se desarrollan utilizando PDMS basado proceso de soft-litografía. Dispositivos SynVivo-SMN se pueden utilizar para obtener cizallamiento mapa de adhesión de la adhesión celular / de partículas 22, estudio dirigido de suministro de fármacos 23 y HAVE ha validado contra datos in vivo 24-25. En este trabajo, presentamos un protocolo que permite la generación del mapa de adhesión de cizallamiento de un solo experimento en volúmenes tan pequeños como 5.1 l que resulta en un ahorro significativo de recursos y tiempo.
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Protocol
1. Cebado del dispositivo de microfluidos SynVivo-SMN
- Cada puerto (entrada / salida) del dispositivo se compone de dos puertos paralelos - uno para hacer fluir en restos de revestimiento de superficies (moléculas de adhesión, matrices de crecimiento, etc) y / o células para la siembra y el otro para realizar el ensayo (Figura 1A ).
- Sumerja completamente el dispositivo de microfluidos SynVivo-SMN (Figura 1B) en una placa de Petri que contiene desionizada estéril (DI) y colocar el plato en un desecador de vacío. Permitir que el desecador a funcionar hasta que todo el aire se elimina de los canales del dispositivo. Esto debe tomar unos 15 min.
- Antes de extraer el dispositivo del agua, coloque la tubería de Tygon (OD de 0,06 "y el ID de 0,02") cebado con agua en cada puerto del dispositivo con una pinza de punta fina. El tubo debe ser de aproximadamente 1 pulgada de longitud. El dispositivo puede ahora ser retirado del agua. Figura 1C muestra la imagen de la DevicE con la tubería.
2. Revestimiento del dispositivo de microfluidos con proteína deseada (por ejemplo, avidina)
- Con una pipeta, coloque una gota de agua (aproximadamente 100 l) alrededor de la base del tubo de un puerto de entrada. Retire con cuidado la tubería usada para cebar el dispositivo. La gota de agua evitará que entre aire en el dispositivo.
- Preparar una jeringa de 1 ml cargado con avidina a una concentración de 20 mg / ml. Conectar la jeringa a un 24 T de la aguja y tubo de acero inoxidable. Inserte la tubería a uno de los puertos de entrada del dispositivo. Sujete el puerto de entrada que no se utiliza con una pinza mandíbula.
- Inyectar avidina a un caudal de 1 l / min durante 10 min para permitir la perfusión completa del dispositivo. Al final del tiempo de flujo, sujetar el tubo con la abrazadera de la mandíbula y colocar el dispositivo a 4 ° C durante la noche.
3. Transmitir el Biotinylated Partículas los estudios de adhesión
- Deje que el dispositivollegar a temperatura ambiente. Coloque el dispositivo en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una platina motorizada y una cámara de alto rendimiento.
- Preparar una solución de 2 micras partículas biotinilados a una concentración de 5 x 10 6 partículas / ml en tampón fosfato salino (PBS). Cargue las partículas en una jeringa de 1 ml. Preparar una segunda jeringa de 1 ml de PBS solo. Cargue cada jeringa en una bomba de jeringa y conectar con la aguja y el tubo.
- Con una pipeta, coloque una gota de agua (aproximadamente 100 l) alrededor de la base del tubo de orificio de entrada. Retire con cuidado el tubo utilizado para recubrir el dispositivo. La gota de agua evitará que entre aire en el dispositivo.
- Inserte con cuidado el tubo de partículas con biotina y PBS de la etapa 3.2 en cada uno de los puertos de entrada. Figura 2A muestra la imagen de la puesta a punto.
- Iniciar la inyección de partículas biotiniladas a un caudal de 2,5 l / min. Monitorear el puerto de entrada en el microscopio. A la primera señalde partículas, iniciar el temporizador y continuar flujo durante 3 min.
- Al final de los 3 minutos, detener el flujo de partículas biotiniladas, mientras que mirando simultáneamente el flujo de PBS a un caudal de 2,5 l / min. Permita PBS fluya en el dispositivo durante 3 min para lavar las partículas no unidas.
4. Adquisición de imágenes y realización de su área de interés (AOI) Mediciones Usando software de imágenes (NIKON Elementos)
- Utilice la función "imagen grande de exploración" en el software de imágenes para adquirir la imagen de todo el dispositivo.
- Número secuencialmente las bifurcaciones en el dispositivo y crear un AOI circular con dos veces el diámetro de los canales. En este caso, ajuste el diámetro AOI a 200 m desde el diámetro del canal es de 100 micras.
- Utilice la función de conteo automatizado en el software de imagen para exportar el número de partículas en cada AOI a una hoja de MS Excel.
- Del mismo modo, utilizar la función de conteo automatizado para exportar el número de partículas en todo eldispositivo.
5. Análisis de partículas de fundente Usando Dinámica de Fluidos Computacional (CFD) Modelos
- Simulaciones CFD se ejecutan mediante un software comercial (CFD-ACE +, ESI Inc.) para la topología de dispositivo SynVivo-SMN. Los resultados se almacenan en una base de datos para el análisis de observaciones experimentales. La información del almacén resultados de la simulación en las tasas de cizallamiento, velocidad, flujo de partículas, y la adhesión en el dispositivo.
- Los resultados de la simulación se utilizan para determinar el número de partículas que entran en cada AOI basado en una concentración de partículas de entrada dada.
6. Generación de cizallamiento Adhesión Mapa
- Calcular el% de adherencia dividiendo las partículas adheridas en la bifurcación por las partículas que fluyen en la bifurcación como se muestra en la ecuación 6.1.
donde el número de partículas adheridas y las partículas que fluyen se obtienen a partir de protocol los pasos 4.3 y 5.2, respectivamente. - Trazar el mapa de adhesión por cizalladura usando la velocidad de cizallamiento en cada bifurcación de las redes obtenidas a partir de la base de datos en el paso (5.1) y los valores de adhesión% obtenidos a partir de la ecuación 6.1.
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Representative Results
La Figura 1A muestra una imagen de un campo brillante y esquemática de dispositivo de SynVivo-SMN. Figura 1B muestra el dispositivo SynVivo-SMN montado en un portaobjetos de vidrio. Figura 1C muestra el dispositivo con un tubo siguiente cebado con agua en un desecador de vacío.
La Figura 2A muestra una imagen de la-montaje experimental. Figura 2B muestra un típico dispositivo SynVivo-SMN avidina-revestido después de la unión de 2 micras partículas biotiniladas. Tenga en cuenta que las partículas se adhieren preferentemente cerca de las bifurcaciones en la red.
La Figura 3A muestra las bifurcaciones numerados en la red SynVivo-SMN. Figura 3B muestra la pared muestra el mapa de cizalla generada por el modelo CFD del dispositivo. La velocidad de cizallamiento varía en el dispositivo que van desde 250 s-1 a 15 segundos -1 como se observa en la microvasculatura in vivo. Tenga en cuenta que estas variablesvelocidades de cizallamiento no se pueden obtener de forma simultánea en los canales de microfluidos lineales, ya que proporcionan una velocidad de cizallamiento constante para cada tasa de flujo. Figura 3C muestra un gráfico de los valores de la velocidad de cizallamiento en cada una de las bifurcaciones de la red. Los datos muestran que los patrones de velocidad de cizallamiento son complejos y no se pueden obtener con una relación analítico simple diferencia de los canales de flujo lineal. Además, múltiples bifurcaciones (AOI) están presentes en la red que caen en el mismo bin cizalla, sumándose a la fiabilidad estadística de los datos.
La Figura 4A muestra los resultados de la muestra del análisis CFD para los flujos de partículas en la red que se utiliza para calcular los flujos de partículas en las ramas y bifurcaciones de la red experimental. Figura 4B muestra el mapa de adhesión por cizalladura calculado a partir de la solo experimento SynVivo-SMN. La mapas de adhesión por cizalladura sigue la relación inversa como se observa a partir de cizallamiento mapa adhesión obtenida a partirexperimentos canal lineal. Sin embargo, en contraste utilizando un ensayo de SynVivo, un solo experimento permite la generación de este mapa de cizallamiento a diferencia de múltiples corridas experimentales requeridas de los canales lineales resultantes en ahorros significativos de tiempo y recursos. Tenga en cuenta que los experimentos se realizan por triplicado para el análisis estadístico máximo.
Figura 1. Dispositivos SynVivo-SMN. Panel izquierdo (Figura 1 A) muestra un esquema del dispositivo. Panel de la derecha (Figura 1A) muestra la imagen de campo brillante del dispositivo. Figura 1B muestra el dispositivo SynVivo-SMN montado en portaobjetos de vidrio de microscopio. Figura 1C muestra el dispositivo con tubo de Tygon ™ enchufado a los puertos de entrada / salida siguientes cebado con agua.
Figura 2. Ensayo de adhesión típica en SynVivo-SMN. Figura 2A muestra una imagen de la-montaje experimental. Figura 2B muestra partículas biotinilados después de la unión en el dispositivo. Tenga en cuenta que la adherencia de las partículas se encuentra para ser localizada cerca de la bifurcación en comparación con las ramas de la red.
Figura 3. Análisis cortante en SynVivo-SMN. Figura 3A muestra todas las bifurcaciones numerados en la red y una vista ampliada de las bifurcaciones de los experimentos. Figura 3B muestra la pared mapa de cizallamiento cualitativa en las bifurcaciones en la red. Figura3C muestra la información cuantitativa sobre la cizalladura en las ramas de la red. Tenga en cuenta que los patrones de corte en la red son complejos y abarcan los rangos fisiológicos de velocidades de cizallamiento (0-240 sec -1) que se encuentran in vivo.
Figura 4. Generación de la cizalladura del mapa adherencia. La figura 4A se destacan las trayectorias de las partículas (como se muestra en blanco) en las redes obtenidos de la simulación CFD. Estas trayectorias son post-procesados para obtener los flujos de partículas en las diferentes ramas y las bifurcaciones. Figura 4B muestra el mapa de adhesión por cizallamiento obtenido a partir de un único experimento SynVivo-SMN.
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Discussion
Cámaras de flujo de placas paralelas, mientras que proporciona una mejor aproximación a las interacciones célula-célula y célula-partículas, sufren de varias limitaciones tales como el alto consumo de reactivos y la necesidad de múltiples corridas experimentales para generar un mapa de adhesión por cizalladura. El uso de redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SynVivo-las SNM) permite la generación de un mapa de adhesión al cizallamiento de un solo experimento en condiciones que imitan las condiciones in vivo. Además, también se obtiene un ahorro significativo (> 95%) en los reactivos.
El paso más importante en la gestión de los estudios de adhesión de partículas con SynVivo-SMN es asegurar burbuja condiciones libres en el chip antes de la experimentación. La introducción de burbujas llevaría a fluir la inestabilidad y la falta de acceso a "aire encerrado" regiones del chip. Por lo tanto, el gran cuidado debe ser tomado durante las inserciones y extracciones de los tubos de los puertos del dispositivo. En caso de una burbuja encontrado en thdispositivo electrónico durante la etapa de imprimación, se puede repetir el proceso de purgado de nuevo para eliminar las burbujas. Alternativamente, se puede circular en los medios de comunicación / reactivos en una baja tasa de flujo (0,1 l / min o menos) para garantizar la libre burbuja cebado del dispositivo.
La limitación principal del protocolo es el chip siendo inutilizables después de la presencia de una burbuja que no se puede quitar. Sin embargo, con la práctica de cuidado se puede llevar a cabo experimentos con el 100% de éxito cercano. Además, la generación de cizalla mapa adhesión requiere información de los modelos CFD. Sin embargo, una base de datos de pre-calculado de los resultados de CFD para diferentes condiciones de flujo puede superar fácilmente la necesidad de realizar las simulaciones de CFD.
Aunque, la metodología que aquí se presenta utiliza el sistema avidina-biotina para la facilidad de demostración, cualquier combinación ligando-receptor en partículas o células puede ser usado para ser estudio de partículas en la superficie o las interacciones de la superficie celular en tiempo real en el dispositivo. Además, las células se pueden Cultured en el dispositivo para estudiar de células de las partículas y las interacciones célula-célula. Cultivo de células requerirá recubrimiento de los canales del dispositivo con matriz adecuada para tipos de células deseados. Por ejemplo, las células endoteliales pueden ser cultivadas en los canales de fibronectina recubierto. Tras la confluencia, las células endoteliales se pueden activar utilizando el TNF-α u otras citoquinas relevantes. Glóbulos blancos (leucocitos) se pueden inyectar y sus interacciones en las células endoteliales activadas se pueden estudiar en tiempo real. Similar al protocolo demostrado en este estudio, un mapa de adhesión por cizalladura de las células blancas de la sangre se puede generar fácilmente a partir de un único experimento.
El protocolo mencionado en este documento puede ser utilizado para estudiar el efecto de la morfología de la red sobre la adhesión de partículas / célula como un modelo de las condiciones in vivo. Además, el efecto del flujo sobre la adhesión de partículas / célula y el comportamiento celular para el modelado de condiciones fisiológicas también se puede evaluar fácilmente. Por último, el protocolo puede ser nosotrosed para estudiar administración de fármacos y la eficacia de la administración dirigida a las poblaciones celulares deseados.
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Disclosures
Tasa de publicación de este artículo, patrocinado por CFD Research Corporation.
Acknowledgments
Tecnología SynVivo fue desarrollada bajo la concesión # 2R44HL076034 del NHLBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
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