Generering af Shear Vedhæftning kort Brug SynVivo Syntetisk Mikrovaskulære Networks
Summary
Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.
Abstract
Cell / partikel adhæsionsassays er afgørende for at forstå de biokemiske vekselvirkninger i sygdom patofysiologi og har vigtige anvendelser i jagten på at udvikle nye lægemidler. Analyser ved hjælp af statiske forhold undlader at fange den afhængighed af vedhæftning på forskydning, hvilket begrænser deres korrelation med in vivo-miljø. Parallelle plade strømningskamre at kvantificere vedhæftning under flow fysiologisk væske behov for flere forsøg til generering af en forskydningshastighed vedhæftning kort. Desuden repræsenterer de ikke in vivo skala og morfologi og kræver store mængder (~ ml) af reagenser til eksperimenter. I denne undersøgelse viser vi, generering af shear vedhæftning kort fra et enkelt eksperiment ved hjælp af en mikrovaskulær netværk baseret mikrofluid enhed, SynVivo-SMN. Denne enhed genskaber komplekset in vivo vaskulatur herunder geometriske skala morfologiske elementer flow funktioner og cellulære interaktioner i enin vitro-format, hvilket giver et biologisk realistisk miljø for grundforskning og anvendt forskning i cellulær adfærd, drug delivery, og lægemiddelforskning. Assayet blev påvist ved at undersøge interaktionen af de 2 um biotin-overtrukne partikler med avidin-coatede overflader af mikrochip. Hele området af forskydning observeret i mikrovaskulaturen er fremstillet i et enkelt assay muliggør vedhæftning vs shear map for partiklerne under fysiologiske betingelser.
Introduction
Aktuelle analyser for at studere til celle-celle-og partikel-celle interaktioner typisk involverer statiske godt pladeformat i hvilke partikler eller celler inkuberes på protein matricer eller omliggende celler. Ved afslutningen af den angivne inkubationstid, er antallet af adhærente partikler eller celler kvantificeres ved hjælp af mikroskopi 1. Selv om disse undersøgelser giver betydelig indsigt i de biokemiske processer bag disse interaktioner, en central begrænsning er den manglende fysiologisk væske flow (typisk for mikrocirkulationen), og dens indvirkning på partikel vedhæftning.
For at overvinde denne begrænsning, har in vitro strømningskamre blevet udviklet i de seneste år. Et fælles element i disse strømningskamre er en gennemsigtig apparat perfunderet ved lave Reynolds tal til at matche vægforskydningshastighed satser observeret i blodkar in vivo 2. Karvæggen er modelleret ved enten belægning af biomolekyler eller vækst af celler på en overflade af strømmen cHamber 3. Partikler 4-7 eller celler 8-16 derefter flød ind på det ønskede flowhastigheder at kvantificere antallet af vedhængende partikler under forskellige forskydningsforhold.
Men brugen af parallelle plade strømningskamre at undersøge og validere de biokemiske fænomener er temmelig dyrt og tidskrævende. Dette skyldes primært det faktum, at flere forsøg skal udføres til generering af et kort over den fluide forskydningskraft vs antallet af partikler / celler klæbet. Desuden plade strømningskamre kræver store mængder reagenser på grund af deres store størrelse (højde> 250 um og bredde> 1 mm). Endelig har disse enheder ikke præcist modellere geometriske funktioner (f.eks bifurkationer) og flow (f.eks, konvergerende vs divergerende strømme), der er til stede in vivo.
Nylige fremskridt inden for litografi baseret microfabrication 17-19 har fremskyndet inden for lab-on-a-chipenheder 20-21. Disse enheder har været medvirkende til at udvikle en miniature udgave af den parallelle plade flowkammer med dimensioner i mikrometer regime. Reduktionen i dimension giver også betydelige fordele i form af mængder af reagenser, celler eller partikel kræves for eksperimenter. Men en vigtig begrænsning af de for tiden tilgængelige indretninger er brugen af lineære kanaler til at modellere mikrokar, som ikke efterligner den komplekse mikrovaskulatur observeret in vivo.
Vi har for nylig udviklet en ny metode til at genskabe mikrovaskulære netværk på engangs plast substrater, hvilket resulterer i syntetisk repræsentation af in vivo. Disse enheder betegnes SynVivo-Syntetiske Mikrovaskulære Networks (SMN), er udviklet ved hjælp af PDMS baseret soft-litografi proces. SynVivo-SMN enheder kan bruges til at opnå shear vedhæftning kort celle / partikeladhæsion 22, studere målrettet drug delivery 23 og have blevet valideret mod in vivo data 24-25. I dette papir, præsenterer vi en protokol, der muliggør generation af shear vedhæftning kort fra et enkelt eksperiment i mængder så små som 1-5 pi hvilket resulterer i betydelige besparelser af ressourcer og tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parallelle plade strømningskamre, samtidig med at væsentlige indsigt i celle-celle-og celle-partikel vekselvirkninger, lider af adskillige begrænsninger, såsom højt forbrug af reagenser, og behovet for flere eksperimentelle kørsler til at generere en forskydningshastighed vedhæftning kort. Anvendelsen af SynVivo-Syntetiske Mikrovaskulære Networks (SynVivo-SMNs) muliggør generering af en forskydningshastighed vedhæftning kort fra et enkelt eksperiment under betingelser, der efterligner in vivo-betingelser.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SynVivo teknologi blev udviklet under tilskud # 2R44HL076034 fra NHLBI.
Materials
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
- Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. Cell adhesion assays. Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).
- Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
- Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
- Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
- Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
- Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers – a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
- Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201 (2010).
- Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
- Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
- Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9 (2001).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
- Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
- Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
- Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
- Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
