Summary
预防性和治疗性疫苗往往不能刺激强烈的免疫反应，由于疫苗的周向引流淋巴结细胞和免疫细胞的参与因而不佳。通过直接注射疫苗到淋巴结的，所谓的淋巴内注射，疫苗的有效性，可以大大地改善和疫苗的剂量可以减少。
Abstract
疫苗一般是皮下或肌内注射对免疫应答的刺激。这样做的成功需要疫苗的有效引流淋巴结，其中抗原呈递细胞可以与淋巴细胞相互作用的一代想要的免疫反应。的强度和诱导免疫反应的类型也取决于相互作用的密度或频率以及微环境，细胞因子，特别是内容。作为外周注射疫苗仅一分钟级分到达淋巴结，小鼠和人类的疫苗通过直接注射疫苗被执行到腹股沟淋巴结， 即淋巴内注射。在男人中，程序是由超声引导。在小鼠中，小（5-10毫米）切口，在麻醉的动物的腹股沟区域，淋巴结进行定位和固定钳，和10-20微升的疫苗的一定体积的视觉控制下喷射。切口闭合使用手术缝合线单针。小鼠接种的质粒DNA，RNA，肽，蛋白质，颗粒，细菌以及佐剂，并观察到对所有类型的疫苗的免疫应答的强改善。接种淋巴方法特别适合在常规疫苗接种产生的免疫力不足或可用的疫苗量有限的情况下。
Introduction
疫苗通常是皮下或肌内注射对免疫应答的刺激。这个程序的成功需要疫苗的有效引流淋巴结其中抗原呈递细胞可以与淋巴细胞相互作用用于生成的T-和B-细胞应答。此外，强度和诱导免疫反应的类型也取决于这种相互作用的密度或频率以及微环境本身，细胞因子，特别是内容。作为注入到外周组织的疫苗只有一小部分到达淋巴结，小鼠和人类通过直接注射该疫苗进入淋巴结的疫苗，该网站被产生的免疫反应，已被执行。在男人中，程序是通过超声波，一个程序也可以用于可视化和诊断在淋巴系统成像剂的给药指导。在小鼠体内，是侵入性检查。在这里，一个小的（5-10毫米）incision被制成在麻醉的动物1的腹股沟区域，淋巴结进行定位和固定钳，和10-20微升的疫苗的一定体积的视觉控制下注入; 10微升用于第一注射和在年轻小鼠用小淋巴结，而20微升可以注入更旧的淋巴结或已催芽的小鼠，其具有较大的淋巴结。切口可闭合使用外科缝合线的单个针迹。通过该方法，将小鼠已接种的质粒DNA 2,3，信使RNA 4，1,3,5,6肽，蛋白质7-10，颗粒11，细菌12以及辅助剂7,13，和免疫大幅改善对所有类型的疫苗反应已被观察到。接种淋巴方法特别适合在常规疫苗接种产生的免疫力不足或可用疫苗的量是有限的或版本的情况下Ÿ昂贵。在人类，免疫的淋巴管内的方法已被应用到过敏患者14,15或癌症患者16-21。虽然目前的看法是，在淋巴管内的方法比其它可注射的方法，如肌内和皮下注射更具侵入性的，疼痛感觉不大于静脉穿刺15后更高。预期淋巴内注射疫苗将成为一种替代或补充的预防和治疗尤其是疫苗的其它方法。本文详细阐述了如何淋巴管内接种疫苗的过程中小鼠进行。描述的所有程序，批准了苏黎世和州兽医局，并根据瑞士联邦指导方针以及用于科学目的的动物的保护指令执行。
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Protocol
1。小鼠麻醉
- 在缓冲液混合氯胺酮（分离性麻醉剂）和甲苯噻嗪（镇静，镇痛）准备麻醉剂。氯胺酮和甲苯噻嗪最终溶液中的浓度是12.5和2毫克/毫升。
- 使用注射器用25-30号针头通过腹膜内给药注射麻醉剂将小鼠。使用0.1 ml/10克的机身重量。
- 为了防止干燥出的角膜应用眼用软膏对小鼠的眼睛。
- 确保鼠标充分捏它的脚或脚趾与镊子麻醉。如果鼠标不与反射的捏反应，继续手术。如果鼠标反应捏有反射或肌肉收缩，等待1-2分钟，然后重复捏测试。如果鼠标仍然反应，请更换鼠标采用了新的动物，并从步骤1.2开始重复步骤。
2。我的手术鼠标的腹股沟区ncision
- 把鼠标在它的后面。
- 湿1腹股沟区域用消毒乙醇（70％）。为了提供更好的消毒，腹股沟区可被剃光，除去皮毛消毒前用乙醇。
- 取后腿和弯曲髋关节，产生髋关节的一个大约90°的角度。
- 使用弯曲microdissecting钳，取小鼠皮肤在腹股沟区，其中髋关节弯曲和拉湿皮肤略有上升。
- 同时保持肌肤与镊子，通过使用手术剪皮肤切开一个小切口（<5毫米）。
- 将闭合的剪刀的尖端插入切口，并进一步通过打开的剪刀，同时保持它的切口内打开切口。这会导致皮肤撕裂，并应当产生一个直径小于10毫米。注：具有灵活的光导冷光源，可以用来提高知名度。在较老的小鼠，特别是男性，淋巴结的识别可能是困难的，由于在腹股沟区过多的脂肪组织。
3。淋巴管内注射
- 准备一个注射器（0.5毫升或更少）用28-30ģ皮下注射针，短斜面可能是优选的一长斜面。吸出10μl的疫苗被注射并保证该注射器是自由的空气。
- 本地化与弯钳的帮助和闭合剪刀的尖端处的腹股沟淋巴结。淋巴结会出现灰内越发白的脂肪组织，并且可以通过传入和传出的毛细血管进入和离开淋巴结进行进一步鉴定。
- 受弯钳的分支之间保持它固定的淋巴结。
- 就拿注射器和针头插入朝上的斜面淋巴结;确保整个斜面进入淋巴结。
- 注射了疫苗（10微升）。如果淋巴结点头e的肿胀（吹），注射可以假设成功。如果针头未放置足够深到淋巴结，部分或整个疫苗可能会泄漏出来，而不是进入淋巴结。如果针头插入过深，注射的疫苗将被释放皮下下面的淋巴结。在后一种情况下，重复注射或用新的未处理的小鼠代替鼠标。
4。通过缝合关闭切口
- 打开无菌手术缝合线的包。
- 抓住的缝合针与针座的针体的远端部分。通过挤压它，直到第一棘轮渔获拧紧持针器。
- 使用镊子抓住皮肤的切口的一侧（取决于外科医生的偏好，齿形或不带齿的钳或皮肤钩可以使用）。插入针约 2-3毫米的切口的边缘上，从皮肤的外部进入。
- 洛斯烯保持与钳子的皮肤和把握切口用钳子的相对侧。插入针约 2-3毫米的切口的边缘上，从皮肤的内侧进入。
- 松开持针器，把握针端与钳。拉带通过皮肤胎面针，而使胎面的方便长度的第一针插入点之外（如果几个小鼠是被处理，留下较短端5-10小鼠可被操作上与一个缝合针/踩）。
- 根据标准协议操刀制作的首选结。一个线圈就足够了，如果切口不大于10mm。对于较大的切口，进行第二次缝合。
5。运行后的治疗
- 将鼠标放置在笼子里，用纸巾覆盖保暖。当处理多个老鼠，把它们接近对方，以保持温暖。或者，将鼠标在一个温暖的垫子，直到他们才如梦初醒起来。
- 观察小鼠直到他们醒来。
- 每天观察小鼠的问候伤口愈合以及其他临床症状，如伤口感染。伤口通常足以在两天内关闭，并在该过程七天痊愈。
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Representative Results
在小鼠淋巴内注射的方法，尽管在手术的性质，是直线前进和比较快的。一个训练有素的人能在3-4分钟执行程序。是与一针封闭切口通常在两天内愈合（ 图1）
淋巴内注射疫苗或免疫接种用的mRNA被执行时，质粒DNA，肽，蛋白质，病毒和细菌。 图2示出了免疫与蛋白质磷脂酶A2（PLA2），主要蜜蜂毒液变应原后的抗体产生。 CBA小鼠进行免疫在0天，14，和28与0.01，0.1，或10微克PLA2通过皮下（SC）或淋巴内（ILN）注射液吸附于氢氧化铝。的磷脂酶A2特异性抗体（IgG2a的）的测定在血液后8周，结果表明，0.01微克PLA2是足以刺激强烈的抗体应答，而10微克PLA2须当u唱皮下注射9。
淋巴内注射疫苗也被用来刺激细胞毒性T细胞应答， 例如 ，从LCMV糖蛋白，其结合的MHC-I类在H-2DB的CD8 + T细胞的刺激的情况下，肽GP33（KAVYNFATM）。而单次皮下注射TCR318小鼠的GP33触发细胞毒性CD8 + T细胞应答，其效果是约。幅度淋巴内注射后更强的六个数量（ 图3A）;的TCR318小鼠是转基因特异的GP33 1的CD8 + T-细胞受体。
CD4 + T-细胞的功能也被在肿瘤攻击试验中测试。再次C57BL / 6小鼠皮下免疫或intralymphatically与来自VSV核蛋白，其结合的MHC-II类为CD4 + T细胞的刺激肽np52（SDLRGYVYQGLKSG），以及肽与ODN的CpG 1826混合。当小鼠静脉与挑战 np52表达同源EL4肿瘤细胞，小鼠全身性淋巴瘤（ 如图3B）。由淋巴内途径进行免疫的小鼠显示了比通过皮下途径（<22天）免疫的小鼠更长的存活时间（> 75天）。
也已在人淋巴管内进行免疫接种的方法，特别适用于过敏，如花粉热的治疗。该方法是目前已知的ILIT（内淋巴免疫治疗）。在对165例花粉症一项研究中，超过2个月，草花粉过敏原3 ILIT会议也同样有效，因为传统疗法与54皮下注射3年以上15。此外，该剂量可超过1000倍减少。同样，在对20例猫毛过敏，与intralymphatically管理的猫毛过敏原3阶段的研究是足以引起耐受性提高到后来接触过敏原14。
jove_content“>淋巴内免疫的改善的功效相比，皮下免疫接种的一种解释可能在人进行说明。使用标记有放射性鎝和图4所示的蛋白质，皮下注射，观察到差的漏极至淋巴结，而当然直接淋巴内注射递送整个疫苗内容到淋巴系统，因此，该应用程序是免疫细胞提供对免疫应答的刺激22。类似的结果在注射放射性蛋白9只小鼠获得的。
图1。治疗淋巴管内注射后手术伤口的。雌性BALB / c小鼠淋巴管内注射免疫。该incis离子被封闭，单一的缝合针。两天后，手术和注射部位被拍到在伤口愈合的管理。
图2。淋巴免疫蛋白对刺激的抗体应答。母CBA小鼠进行免疫在0天，14，和28与吸附在氢氧化铝磷脂酶A2蛋白质的所指示的剂量。关于天0和28的左淋巴结和第14天的右淋巴结：该疫苗是通过注射50μl的在腹股沟淋巴结颈部或10微升的颈背给药皮下（SC）。
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图3。淋巴内接种肽刺激细胞毒性CD8 + T细胞应答（A）女性TCR318小鼠注射GP33多肽进入腹股沟淋巴结（ILN）或皮下（SC）到足垫。 24小时后，引流淋巴结收获和GP33-特异性CTL活性分析以30:1的effector/target-（E / T）的细胞的比率。 （B）中 雌性C57BL / 6小鼠进行免疫的天0,2和4用10微克np52通过皮下（SC）或淋巴内（ILN）给药途径。小鼠然后用同基因细胞淋巴瘤（EL-4）表达VSVnp52挑战，而小鼠的存活是示出采用Kaplan-迈耶曲线。
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在人类中图4。淋巴内施用疫苗。在人类淋巴内施用疫苗是通过分配皮下淋巴结超声的帮助下完成的。的皮下针被插入到淋巴结的副皮质，注入可以通过观察即时淋巴结的超声图像肿胀的控制。 （ 一 ）淋巴管内注射是通过超声引导。 （二）超声图像显示针（直发白线）插入淋巴结副皮质区。和皮下（“Injekt subkutan”;左前）;注射放射性标记的蛋白质入腹股沟淋巴结（右前“Injekt IM LK”）后（C）生物分布。在人点击这里查看大图。
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Discussion
淋巴内免疫接种和免疫治疗已被证明是合适的两个抗体应答和T细胞应答的刺激。这表现这个视频文章中，接种疫苗的淋巴管内的程序是一个快速简便的方法刺激强烈的免疫反应的小鼠。一个训练有素的外科医生可以在3-4分钟执行程序。这次会议也可两名外科医生，其中一个通常做麻醉和缝合，第二个外科医生在做切口和注射之间共享。该过程的效率，更取决于运营商以外的免疫方法，尤其是当外科医生还没有良好的训练。然而，有经验的操作者能够再现的实验结果也定量免疫应答分析监测。法中甲的改变是接种疫苗注射入脾1,2该制剂是类似于淋巴内注射，但第切口电子商务尺寸通常较大，两针都是为了关闭它。例如脾内免疫的主要优点是，脾是更容易找到并打比淋巴结，较大的注射量和更频繁的注射可以应用，并同时造成进针或注射淋巴结的任何损害将涉及淋巴结的主要领域，脾的损伤会涉及相对较少的器官，更加地方性质。
淋巴内免疫的小鼠中的过程可以重复（ 例如疫苗加强注射）3-4周第二次注射在相同的淋巴结前一恢复时间后，就完成了。如果更频繁的注射计划，左，右腹股沟淋巴结应该被使用。每淋巴结至少两次注射是可以，但需要进一步的研究，以更精确地定义此潜在的限制。继续注资可能难以ðUE对瘢痕形成两者在淋巴结和在皮肤上，以及造成潜在的佐剂肉芽肿形成。另一方面，免疫接种会引起瞬态淋巴结炎，以及增加的淋巴结大小将简化后续的定位和注射。事实上，淋巴结的定位是该方法的一个主要限制。而年轻小鼠（小于5周）可具有非常小的淋巴结，年龄较大，特别是年龄较大的雄性小鼠可具有如此多的皮下脂肪，即定位是困难的。最佳条件是用6-12周的雌性小鼠获得的。事实上，该过程中最关键的步骤之一是在注射入淋巴结本身。一个注入节点的相邻区域将相当于皮下注射用弱得多触发的免疫应答比直接淋巴内注射。的原因是，而固体胶囊周围的节点是不可渗透的大分子。为抗原进入淋巴结，它具有排与淋巴。此行程通常开始于皮肤中的初始淋巴管，继续在更深的层的皮肤，其漏极淋巴到收集容器中的皮下组织，从那里的淋巴由蠕动向着下一个排出从动较大的管道淋巴结23,24。进一步下行的抗原沿着这条道路沉积，它的较少将获得进入输入淋巴。
淋巴内免疫接种的方法是抗原时，通过常规方法如肌内或皮下途径给药是弱免疫原性的给药特别有趣。淋巴内注射疫苗已经执行了与mRNA表达，质粒DNA，肽，蛋白质，病毒和细菌22,25-27。虽然肽和蛋白质没有在建的佐剂，基因的质粒DNA病毒和细菌发挥内在的辅助EFFE仙通过提供危险信号（复制的病毒和细菌）或通过刺激Toll样受体（TLR），其能够感测相关的病原体分子模式（PAMP），如单链RNA（TLR7和TLR8），双链RNA（TLR3），非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡核苷酸群（TLR9），细菌flaggelin（TLR5），脂多糖（TLR2和4）以及其他病毒和细菌的分子28。因此，尤其是肽和蛋白质为基础的疫苗将受益于注射疫苗直接进入淋巴结的免疫增强作用。事实上，已经证明，B-和T-细胞应答的小鼠1,8,9淋巴内肽和蛋白质在接种后增加。此外，基因疫苗，尤其是基因为基础的疫苗，是非常不稳定的原因，他们一定会从启用短文次在细胞外组织的给药方法获利。事实上，淋巴管内接种抗原恩编码RNA诱发的小鼠肿瘤模型4强效预防和治疗免疫力。类似地，佐剂如CpG基的淋巴内给药使能的降低毒性，由于所需的较低的剂量，并增加佐剂效应，观察由于对免疫细胞13的直接和未稀释的效果。还有其它佐剂或抗原递送系统如聚合物纳米微粒以及脂质体的性能可通过淋巴内给药11得到改善。淋巴内优于常规疫苗接种途径的另一个主要优点是低得多的剂量通常是必需的。对于蛋白质和抗体应答的刺激时，剂量可以由100-1,000倍9被降低，而DNA对细胞毒性CD8 + T细胞应答的刺激的剂量可以减少与大约。 10,000倍2。
而相比之下，亚单位抗原或死疫苗，活VIR人与细菌疫苗通常不预期可从淋巴主管部门受益。这样做的原因是在活的微生物通常排水良好，淋巴结无任何辅助帮助的一部分。此外，感染性微生物可以通过复制应付抗原稀释效应在外围组织。因此，抗原剂量到达次级淋巴系统通常将足以产生免疫力。然而，在现有的活疫苗生产的免疫力不足，淋巴内给药能提供必要使疫苗有效的校正。这是最近证明接种目前唯一可用的结核疫苗米后免疫力牛分枝杆菌 BCG可以通过直接注射卡介苗可显著改善到小鼠12的腹股沟淋巴结。淋巴政府还允许100-1000倍，降低卡介苗的接种量相比，皮下adminis滤过。这代表淋巴免疫接种的安全利益，尤其是在免疫受损的人。
淋巴内免疫接种和免疫治疗在人类到目前为止已应用于癌症患者和过敏的患者。在人类的方法是无创的，但最好的结果和质量控制是通过超声引导注射，这可能会限制应用到医院或大型医疗单位获得的。在癌症研究中，初免-加强接种的质粒DNA和肽用于治疗转移性恶性黑色素瘤的治疗中发现的免疫原性和在一个确定的患者群29控制疾病的证据。还淋巴自体接种树突状细胞已经在癌症患者进行的。虽然一些试验增强免疫反应30,31，其他试验未能证明淋巴管内给药32,33的利益。淋巴管内给药的方法已经证明是尤其cially实益过敏的患者的免疫治疗。通过切换到淋巴内法，注射剂的完整的和成功的免疫疗法的数目可以是从约50次皮下注射3年以上减少到只有3次注射2个月以上14,15。由于这两种注射剂量数可以通过执行变应原特异性免疫治疗淋巴内被大大减少，并且因为淋巴结不含有组胺释放肥大细胞中，该方法代表了安全性的好处，并用短的治疗时间，患者的依从性提高。在接下来的几年，过敏也许是表明会看到这个新的疫苗和免疫治疗的方法，最直接的好处。
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Disclosures
TMK被命名为专利涉及在人淋巴免疫疗法的发明者。 TMK一直是科学顾问，并已收到差旅费由ImVisioN有限公司，Cytos生物技术，Mannkind公司，并XBiotech美国公司PJ没有任何利益冲突披露。
Acknowledgments
作者感谢的实验帮助发展中国家从虹膜埃德曼，芭芭拉·冯·博伊斯特，朱莉娅玛丽亚·马丁内斯·戈麦斯小鼠淋巴免疫的方法。还要感谢玛吉阿拉斯和尼古拉Cesarovic您让我们使用他们的手术剧场这个视频制作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Ketasol-100) | Graeub AG, Switzerland | Anesthetics | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer, Germany | Anesthetics | |
| Viscotears Eye-Gel | Novartis, Switzerland | To keep eyes from drying out during anesthesia. | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml | BD Medical, France | 29 G Insulin syringes with permanently attached needles | |
| 6-0 Dermalon Monofilament Nylon | Covidien, MA, USA | For sutures (0.7 metric, 18 G, 45 cm, Blue) | |
| Curved forceps, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision and holding of lymph node | |
| Straight surgical scissors, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision | |
| Needle holder, 5.5 in | Polymed, Switzerland | To close incision with suture |
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