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Immunology and Infection

Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen

Published: February 2, 2014 doi: 10.3791/51031
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology, University Hospital Zurich

Summary

Prophylaktischen und therapeutischen Impfung oft nicht starke Immunantworten aufgrund Woche Entwässerung des Impfstoffs zu stimulieren, um Knoten und folglich schlechte Beteiligung von Immunzellen Lymphe. Durch direkte Injektion des Impfstoffes in Lymphknoten, sogenannte intralymphatischer Injektion, die Wirksamkeit des Impfstoffes kann stark verbessert werden, und Impfstoffdosen verringert werden.

Abstract

Impfstoffe werden typischerweise zur Stimulation von Immunantworten subkutan oder intramuskulär injiziert. Der Erfolg dieses erfordert effiziente Entwässerung des Impfstoffs Lymphknoten wo Antigen-präsentierenden Zellen mit Lymphozyten zur Erzeugung des gewünschten Immunantworten interagieren. Die Stärke und die Art der Immunantwort induziert auch von der Dichte oder Häufigkeit der Wechselwirkungen sowie der Mikroumgebung, insbesondere der Gehalt an Cytokinen. Da nur ein geringer Bruchteil der peripher injiziert Impfstoffe die Lymphknoten erreicht wurden Impfungen von Mäusen und Menschen durch direkte Injektion des Impfstoffes in die inguinalen Lymphknoten, dh intralymphatischer Injektion durchgeführt. Beim Menschen wird das Verfahren durch Ultraschall geführt. Bei Mäusen wird eine kleine (5-10 mm) Einschnitt in der Leistengegend des anästhesierten Tieren, die Lymphknoten lokalisiert und mit einer Pinzette immobilisiert und ein Volumen von 10-20 ul der Impfstoff unter Sichtkontrolle injiziert.Der Einschnitt wird mit einer einzelnen Masche mit chirurgischen Nähten verschlossen. Mäuse wurden mit Plasmid-DNA, RNA, Peptid-, Protein-, Partikel und Bakterien sowie Adjuvantien geimpft und starke Verbesserung der Immunantwort gegen alle Arten von Impfstoffen beobachtet. Die intralymphatischen Impfverfahren ist besonders geeignet in Situationen, in denen herkömmliche Impfung erzeugt unzureichende Immunität oder wenn die Menge der verfügbaren Impfstoff ist begrenzt.

Introduction

Impfstoffe werden typischerweise zur Stimulation von Immunantworten subkutan oder intramuskulär injiziert. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert effiziente Entwässerung des Impfstoffs Lymphknoten, wo Antigen-präsentierenden Zellen mit Lymphozyten zur Erzeugung von T-und B-Zellantworten zu interagieren. Darüber hinaus ist die Stärke und die Art der Immunantwort induziert auch von der Dichte oder Häufigkeit solcher Wechselwirkungen sowie der Mikroumgebung selbst, insbesondere der Gehalt an Cytokinen. Da nur ein kleiner Bruchteil eines Impfstoffs in eine periphere Gewebe injiziert in einen Lymphknoten erreicht, Impfungen von Mäusen und Menschen durch direkte Injektion des Impfstoffes in den Lymphknoten, dem Ort wurden Immunantworten erzeugt werden, durchgeführt. Beim Menschen wird das Verfahren durch Ultraschall, ein Verfahren auch für die Verabreichung von Bildgebungsmittel zur Visualisierung und Diagnose in der lymphatischen Systems verwendet geführt. Bei Mäusen ist das Verfahren invasiv. Hier eine kleine (5-10 mm) incision in der Leistengegend des betäubten Tieren 1 erfolgt, wird der Lymphknoten lokalisiert und mit einer Pinzette immobilisiert, und ein Volumen von 10-20 ul der Impfstoff wird unter Sichtkontrolle injiziert; 10 ul zur ersten Injektionen verwendet und bei jungen Mäusen mit kleinen Lymphknoten, während 20 ul kann in Lymphknoten von älteren oder bereits grundiert Mäuse, die größere Lymphknoten injiziert werden. Der Schnitt kann mit einem einzelnen Stich mit chirurgischen Nähten geschlossen werden. Durch dieses Verfahren haben Mäuse mit Plasmid-DNA 2,3 Boten-RNA 4, 1,3,5,6-Peptid, Protein 7-10, 11-Partikel, Bakterien 12 sowie Hilfsstoffe 7,13 und einer starken Verbesserung der Immun geimpft Antworten gegen alle Arten von Impfstoffen beobachtet worden. Die intralymphatische Verfahren der Impfung besonders geeignet in Situationen, in denen herkömmliche Impfung produziert nicht genügend Immunität oder wo die Menge der zur Verfügung stehenden Impfstoff begrenzt ist, oder ist very teuer. Beim Menschen hat die intralymphatische Immunisierungsverfahren zur Allergiepatienten 14,15 oder um Patienten mit Krebs 16-21 angewandt. Obwohl die aktuelle Vorstellung ist, dass die intralymphatische Methode ist invasiv als andere injizierbare Methoden wie intramuskuläre und subkutane Injektionen, die Schmerzwahrnehmung nicht höher als nach einer Venenpunktion 15. Es wird erwartet, dass intralymphatische Impfung eine Alternative oder Ergänzung zu anderen Methoden der prophylaktischen und therapeutischen Impfungen besonders geworden. Dieser Artikel beschreibt im Detail, wie das Verfahren der intralymphatische Impfung bei Mäusen durchgeführt. Alle beschriebenen Verfahren wurden von der Kantonstieragentur Zürich genehmigt und durchgeführt nach Schweizer Bundesrichtlinien und Richtlinien über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.

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Protocol

1. Anästhesie Mäuse

  1. Bereiten Sie die Anästhetika durch Mischen von Ketamin (dissoziative Anästhetikum) und Xylazin (Sedativum und Analgetikum) in Kochsalzlösung. Die Konzentrationen von Ketamin und Xylazin in der fertigen Lösung werden 12,5 und 2 mg / ml.
  2. Injizieren Anästhetika an die Mäuse durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung einer Spritze mit einer Nadel von 25-30 G. Verwenden Sie 0,1 ml/10 g Körpergewicht.
  3. Tragen Sie eine Augensalbe, um die Mäuse die Augen, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  4. Sicher, dass die Maus ausreichend durch Kneifen seinem Fuß-oder Zehen mit der Zange betäubt. Wenn die Maus nicht mit Reflexen auf die Prise zu reagieren, Operation fortzufahren. Wenn die Maus reagiert auf die Prise mit Reflexen oder Muskelkontraktionen, warten Sie 1-2 Minuten und wiederholen Sie den Pinch-Test. Wenn die Maus immer noch reagiert, ersetzen Sie die Maus mit einem neuen Tier, und wiederholen Sie die Prozeduren ab Schritt 1.2 ab.

2. Chirurgische ichncision der Leistengegend der Maus

  1. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken.
  2. Befeuchten Sie ein Leistenbereich mit Desinfektions Ethanol (70%). Um eine bessere Desinfektion bereitzustellen, kann der Leistenregion rasiert werden, um Fell vor der Desinfektion mit Ethanol zu entfernen.
  3. Nehmen Sie die Hinterbein und beugen das Hüftgelenk zu einem etwa 90 °-Winkel des Hüftgelenks zu produzieren.
  4. Mit einer gebogenen Pinzette microdissecting, nehmen Sie die Maus Haut in der Leistengegend, wo das Hüftgelenk gebeugt und leicht nach oben ziehen die benetzte Haut.
  5. Während bis halten die Haut mit der Zange, schneiden Sie einen kleinen Schnitt (<5 mm) durch die Haut mittels chirurgischer Schere.
  6. Setzen Sie die Spitze der geschlossenen Schere in der Schnittführung und den Schnitt weiter zu öffnen, durch das Öffnen der Schere, während es in den Schnitt halten. Dies bewirkt, dass die Haut zu reißen und sollte einen Durchmesser von weniger als 10 mm zu produzieren. Hinweis: Eine Kaltlichtquelle mit flexiblem Lichtleiter verwendet werden, um die Sichtbarkeit zu verbessern. In älterenMäuse, besonders Männern kann die Identifizierung des Lymphknotens schwierig, da viel Fettgewebe in der Leiste sein.

3. Intralymphatische Injection

  1. Bereiten Sie eine Spritze (0,5 ml oder weniger) mit einem 28-30 G Injektionsnadel, eine kurze Abschrägung kann bevorzugt sein, eine lange Kegel sein. Saugen Sie 10 ul der Impfstoff injiziert werden und sicherzustellen, dass die Spritze ist frei von Luft.
  2. Lokalisieren der Leistenlymphknoten mit Hilfe der gekrümmten Pinzette und der Spitze der geschlossenen Schere. Die Lymphknoten werden im Fettgewebe mehr weißlich grau angezeigt und kann weiter durch zu-und abführenden Kapillaren Betreten und Verlassen der Lymphknoten identifiziert werden.
  3. Immobilisieren, den Lymphknoten, indem sie zwischen den Zweigen der gebogenen Pinzette.
  4. Nehmen Sie die Spritze und die Nadel in den Lymphknoten mit der Kegel nach oben, machen, dass der ganze Kegel in den Lymphknoten.
  5. Spritzen Sie die Impfstoff (10 ul). Wenn die Lymphe Nickene Schwellungen (Sprengung), kann die Injektion erfolgreich angenommen werden. Wenn die Nadel nicht tief genug in die Lymphknoten platziert, können einige oder die gesamte Impfstoff austreten und nicht in die Lymphknoten. Wenn die Nadel zu tief eingeschoben, wird der Impfstoff subkutan injiziert unterhalb der Lymphknoten erscheinen. Im Falle der letzteren, wiederholen Sie die Injektion oder ersetzen Sie die Maus mit einem neuen unbehandelten Maus.

4. Das Schließen der Inzision durch Naht

  1. Öffnen Sie eine Packung von sterilen OP-Naht.
  2. Fassen der Nähnadel mit einem Nadelhalter an dem distalen Teil des Nadelkörpers. Ziehen Sie die Nadelhalter, indem Sie ihn bis zu den ersten Ratschen Fänge.
  3. Fassen der Haut auf einer Seite des Einschnitts mit einer Pinzette (je nach der Präferenz des Operateurs, Zahn-oder Zahn un-Zange oder Haken Haut verwendet werden können). Führen Sie die Nadel ca. 2-3 mm vom Rand des Einschnitts, der Eingabe von der Außenseite der Haut.
  4. Loosen Halt der Haut mit der Zange und erreichen die gegenüberliegende Seite des Einschnitts mit der Zange. Führen Sie die Nadel ca. 2-3 mm vom Rand des Einschnitts, der Eingabe von der Innenseite der Haut.
  5. Lösen Sie die Nadelhalter und fassen Sie den Nadelende mit der Zange. Ziehen Sie die Nadel mit der Lauffläche durch die Haut, so dass eine bequeme Länge der Lauffläche außerhalb des ersten Nadel Einfügemarke (wenn mehrere Mäuse behandelt werden sollen, lassen Sie einen kürzeren Ende, 5-10 Mäuse können mit einer Nähnadel betrieben werden / treten).
  6. Machen Sie den bevorzugten Knoten nach Standardprotokollen Chirurg. Eine Masche ist ausreichend, wenn der Schnitt nicht größer ist als 10 mm. Für größere Einschnitte, einen zweiten Stich.

5. Post-operative Behandlung

  1. Platzieren Sie die Maus in den Käfig und Abdeckung mit Gewebe warm zu halten. Bei der Behandlung von mehreren Mäusen, legen Sie sie nahe beieinander warm zu halten. Alternativ legen Sie die Mäuse an einem warmen Kissen, bis sie aufgewachtauf.
  2. Beachten Sie die Mäuse, bis sie aufwachen.
  3. Beachten Sie die Mäuse täglich mit Bezug auf die Heilung sowie andere klinische Symptome, wie Wundinfektionen gewickelt. Die Wunde wird in der Regel innerhalb von zwei Tagen ausreichend geschlossen und innerhalb von sieben Tagen nach dem Verfahren geheilt.

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Representative Results

Das Verfahren von intralymphatische Injektionen bei Mäusen trotz der chirurgischen Natur, ist einfach und relativ schnell. Eine ausgebildete Person kann das Verfahren in 3-4 min durchzuführen. Der Einschnitt, der mit einer Masche geschlossen heilt typischerweise innerhalb von zwei Tagen (Abbildung 1)

Intralymphatischer Impfung oder Immunisierung mit mRNA durchgeführt wurde, Plasmid-DNA, Peptiden, Proteinen, Viren und Bakterien. Fig. 2 veranschaulicht die Produktion von Antikörpern nach Immunisierung mit dem Protein die Phospholipase A2 (PLA2), der Hauptbienengift-Allergen. CBA-Mäuse wurden an den Tagen 0, 14 und 28 mit 0,01, 0,1 oder 10 ug PLA2 von Aluminiumhydroxid durch subkutane (sc) oder intralymphatische (iln) adsorbiert Injektionen immunisiert. Die PLA 2-spezifische Antikörper (IgG2a) im Blut wurden nach 8 Wochen gemessen, und die Ergebnisse zeigten, daß 0,01 ug PLA2 ausreichend starke Antikörperreaktionen stimulieren, während 10 &mgr; g PLA2 wurde erforderlich, wenn usingen die subkutane 9.

Intralymphatischer Impfung wurde auch verwendet, um zytotoxische T-Zellreaktionen zu stimulieren, z. B. das Peptid gp33 (KAVYNFATM) von LCMV Glykoprotein, das MHC-Klasse-I im Rahmen der H-2Db zur Stimulation von CD8-T-Zellen zu binden. Während eine einzelne subkutane Injektion von Mäusen mit gp33 TCR318 zytotoxischen CD8 ausgelöst T-Zell-Antworten, war der Effekt ca. sechs Größenordnungen stärker nach intralymphatischer Injektion (Fig. 3A), die TCR318 transgenen Mäuse sind für die CD8-T-Zellrezeptor spezifisch für gp33 1.

CD4 T-Zell-Funktionen wurden auch in einem Tumor-Challenge-Test getestet. Wieder C57BL / 6 Mäuse wurden subkutan oder intralymphatisch mit dem Peptid NP52 (SDLRGYVYQGLKSG) aus dem VSV-Nukleoprotein, die MHC-Klasse-II zur Stimulation von CD4-T-Zellen zu binden, und das Peptid wurde mit CpG-ODN 1826 gemischt. Wenn die Mäuse wurden intravenös mit herausgefordert NP52-exprimierenden syngenen EL4-Tumorzellen, entwickelten die Mäuse systemisch Lymphom (Fig. 3B). Mäuse, die durch den intralymphatischen Weg immunisiert wurden, zeigten viel längere Überlebenszeiten (> 75 Tage) als Mäuse subkutan (<22 Tage) immunisiert.

Das Verfahren nach intralymphatischer Immunisierung wurde auch am Menschen durchgeführt worden, insbesondere für die Behandlung von Allergien, wie Heuschnupfen. Das Verfahren wird derzeit als ILIT (Intra Lymphatische Immuntherapie) bekannt. In einer Studie an 165 Patienten mit Heuschnupfen, war 3 ILIT Sitzungen über 2 Monate mit Gräserpollenallergenen ebenso effizient wie herkömmliche Therapie mit 54 subkutane Injektionen über 3 Jahre 15. Darüber hinaus könnte die Dosis von mehr als 1000-fache reduziert werden. Auch in einer Studie über 20 Patienten mit Katzenfell-Allergie, 3 Sitzungen mit intralymphatisch verabreicht Katzenfell Allergen war ausreichend, um eine verbesserte Toleranz gegenüber später 14 Allergenexposition führen.

jove_content "> Eine Erklärung für die verbesserte Wirksamkeit der intralymphatische Immunisierung im Vergleich zu subkutanen Immunisierung könnte im Menschen veranschaulicht. Verwendung eines Proteins mit radioaktivem 99m Tc und wie in Fig. 4 dargestellt gekennzeichnet, subkutane Injektionen beobachtet, schlecht zu Lymphknoten entleeren natürlich Direkteinspritz intralymphatischer Lieferung der gesamte Impfstoff Inhalt des lymphatischen Systems, damit er sie an Immunzellen und zur Immunantwort Stimulations 22. Ähnliche Ergebnisse wurden in Mäusen, die mit radioaktiven Proteine ​​injiziert 9 erhalten.

Figur 1
1. Heilung nach intralymphatischer Pritzoperationswunde. Weibliche BALB / c-Mäuse wurden durch Injektion immunisiert intralymphatischer. Die Incis Ionen mit einzelnen Nahtstich geschlossen. Zwei Tage später wurden die Operationsstelle und Injektion zur Verwaltung der Wundheilung fotografiert.

Figur 2
2. Intralymphatischer Immunisierung mit Protein zur Stimulation Antikörper-Reaktionen. Weibliche CBA-Mäuse wurden an den Tagen 0, 14 immunisiert und 28 mit der angezeigten Dosis von Phospholipase A2-Protein an Aluminiumhydroxid adsorbiert ist. Links Lymphknoten an den Tagen 0 und 28 und die rechte Lymphknoten am Tag 14: Der Impfstoff wurde subkutan (sc) Injektion von 50 &mgr; l in der Genick oder 10 &mgr; l in einer Leistenlymphknoten verabreicht.

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3. Intralymphatischer Immunisierung mit Peptid zur Stimulation zytotoxischer CD8-T-Zellantworten. (A) Weibliche TCR318 Mäuse wurden mit gp33-Peptid in den Leistenlymphknoten (iln) oder subkutan (sc) in die Hinterpfote injiziert. Nach 24 Stunden wurden die drainierenden Lymphknoten geerntet und bei einer effector/target- (E / T)-Zellen-Verhältnis von 30:1 für gp33-spezifischen CTL-Aktivität analysiert. (B) Weibliche C57BL / 6 Mäuse wurden an den Tagen 0, 2 immunisiert und 4 mit 10 ug NP52 durch subkutane (sc) oder intralymphatische (iln) Verabreichungswege. Die Mäuse wurden dann mit einem syngenen Zell-Lymphom (EL-4) exprimieren VSVnp52 herausgefordert, und das Überleben der Mäuse wurde mit Kaplan-Meyer-Kurven dargestellt.

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Intralymphatische Verabreichung des Impfstoffes bei Menschen Abbildung 4.. Intralymphatische Verabreichung des Impfstoffes bei Menschen wird durch die Zuweisung subkutanen Lymphknoten mit Hilfe von Ultraschall machen. Die Hypodermis Nadel in Parakortex der Lymphknoten eingeführt und die Injektion kann durch Beobachtung der unmittelbaren Lymphknotenschwellungen im Ultraschallbild gesteuert werden. (A) Die intralymphatische Injektion wird durch Ultraschall geführt. (B) Ultraschall-Bild zeigt Nadel (gerade weißliche Linie) in den Paracortex der Lymphknoten eingelegt. (C) Biodistribution nach der Injektion von radioaktiv markiertem Protein in einen Leistenlymphknoten ("Injekt im LK", rechts anterior) und subkutan ("Injekt subkutan", links anterior). Im Menschen Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

Immunisierung und intralymphatische Immuntherapie hat sich gezeigt, zur Stimulation der Antikörperantworten und den beiden T-Zell-Reaktionen geeignet. Wie in diesem Video-Beitrag gezeigt hat, ist die intralymphatische Verfahren der Impfung eine schnelle und einfache Methode für die Stimulierung starke Immunantwort in Mäusen. Ein ausgebildeter Chirurg kann das Verfahren während 3-4 min durchzuführen. Die Sitzung kann auch zwischen zwei Chirurgen, wo man in der Regel tun, Anästhesie und die Naht und die zweite Chirurg macht den Schnitt und die Einspritz geteilt werden. Die Effizienz des Verfahrens ist abhängig vom Betreiber als andere Immunisierungsverfahren, insbesondere, wenn der Operateur noch nicht gut ausgebildet. Jedoch ist ein erfahrener Bediener in der Lage, experimentellen Ergebnisse quantitativ wiederzugeben, wie durch Immunreaktion-Analyse überwacht. Eine Modifikation des Verfahrens ist es, den Impfstoff in der Milz 1,2 einzuspritzen. Die Herstellung ist ähnlich zu der des intralymphatischer Injektion, aber the Größe der Schnitt ist in der Regel größer und zwei Stiche gemacht werden, um es zu schließen. Die wesentlichen Vorteile einer solchen Immunisierung intrasplenische sind, dass die Milz ist leichter zu finden und zu treffen als einen Lymphknoten, größere Volumina Injektionen und häufigere Injektionen angewendet werden kann, und während ein Schaden von einem Lymphknoten von Nadeleinführung oder Injektion verursacht würde bedeuten, ein Hauptbereich des Lymphknotens, würde die Beschädigung der Milz relativ weniger des Organs beinhalten und sein lokaler Natur.

Das Verfahren von intralymphatischer Immunisierung von Mäusen kann wiederholt werden (z. B. Impfstoff Steigerung Injektionen) nach einer Erholungszeit von 3-4 Wochen vor der zweiten Injektion in der gleichen Lymphknoten erfolgen. Wenn häufigere Injektionen sind geplant, sollten beide linken und rechten Leistenlymphknoten verwendet werden. Mindestens zwei Injektionen pro Lymphknoten können gemacht werden, aber weitere Studien erforderlich, um diese mögliche Einschränkung genauer zu definieren. Weitere Injektionen kann schwierig sein, dUE zur Narbenbildung sowohl in den Lymphknoten und in der Haut, sowie mögliche Granulombildung durch Adjuvantien verursachte. Auf der anderen Seite wird die Immunisierung eine vorübergehende Lymphknoten-Entzündung, und die erhöhte Lymphknotengröße anschließende Lokalisierung und Injektionen zu vereinfachen. Tatsächlich ist die Lokalisation der Lymphknoten eine große Einschränkung des Verfahrens. Während junge Mäuse (weniger als 5 Wochen) kann sehr klein Lymphknoten, ältere und vor allem älteren männlichen Mäuse können so viel Unterhautfett haben, ist, dass die Lokalisierung schwierig. Optimale Bedingungen sind mit weiblichen Mäusen von 6-12 Wochen erhalten. Tatsächlich ist einer der wichtigsten Schritte des Verfahrens der Injektion in die Lymphknoten sich. Injektion in den angrenzenden Bereich der Knoten entspricht einer subkutanen Injektion mit viel schwächer Auslösung von Immunantworten als nach der direkten Injektion intralymphatischer sein. Der Grund dafür ist, dass der eher festen Kapsel, die den Knoten umgibt, ist nicht durchlässig für große Moleküle.Für ein Antigen in einem Lymphknoten erhalten, muss es mit der Lymphe abfließen. Diese Reise beginnt in der Regel in den ersten Lymphgefäße in der Haut, weiter in den größeren Kanälen in der tieferen Schicht der Haut, die die Lymphe Auffanggefäße im Unterhautgewebe, von wo aus der Lymphe durch Peristaltik zur nächsten Entleerung angetrieben Drain Lymphknoten 23,24. Die weiter stromabwärts ein Antigen auf diesem Weg abgeschieden wird, desto weniger davon erhalten Zugang zu der afferenten Lymphe.

Das Verfahren nach intralymphatischer Immunisierung ist besonders interessant für die Verabreichung von Antigenen, die, wenn sie durch herkömmliche Verfahren, wie intramuskuläre oder subkutane Wege verabreicht schwach immunogen sind. Intralymphatischer Impfung mit mRNA, Plasmid-DNA, Peptiden, Proteinen, Viren und Bakterien 22,25-27 geführt. Während Peptide und Proteine ​​haben keine in-bauen Adjuvantien, Plasmid-DNA, mRNA Viren und Bakterien ausüben Eigen adjuvante effects durch Gefahrensignale (Replikation von Viren und Bakterien) oder durch die Stimulierung der Toll-like-Rezeptoren (TLRs), die Erreger associated molecular patterns (PAMPs), wie zB Einzelstrang-RNA (TLR7 und TLR8), Doppelstrang-RNA (TLR3) erfassen kann, nicht-methylierte Cytosin und Guanin Oligonukleotid Cluster (TLR9), bakterielle flaggelin (TLR5), Lipopolysaccharid (TLR2 und 4) sowie andere virale und bakterielle Moleküle 28. Daher, insbesondere Peptid-und Protein-basierte Impfstoffe würden von Immunpotenzierung der Injektion des Impfstoffs direkt in den Lymphknoten profitieren. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass B-und T-Zell-Reaktionen werden nach intralymphatischer Peptid-und Protein-Impfung von Mäusen 1,8,9 erhöht. Darüber hinaus sind genetische Impfstoffe, insbesondere mRNA-basierte Impfstoffe, sehr instabil, weshalb sie würden sicherlich von einer Verwaltungsmethode, die kurze Durchlaufzeiten in der extrazellulären Gewebe aktiviert profitieren. Tatsächlich intralymphatische Impfung mit Antigen-enkodierende RNA ausgelöst starke prophylaktische und therapeutische Immunität in Maus-Tumormodellen 4. Ebenso intralymphatische Verabreichung von Adjuvantien wie CpG aktiviert eine Verringerung der Toxizität aufgrund der niedrigeren Dosis erforderlich ist, und einer erhöhten Adjuvans-Wirkung wurde durch die direkte und unverdünnt Wirkung auf die Immunzellen 13 beobachtet. Auch die Leistung der anderen Hilfsstoffe oder Antigen-Abgabesysteme, wie polymere Nano-und Mikropartikeln sowie Liposome könnte durch intralymphatische Verabreichung 11 verbessert werden. Ein weiterer großer Vorteil gegenüber herkömmlichen Impfung intralymphatische Wege ist, dass viel niedrigere Dosen sind typischerweise erforderlich. Für Proteine ​​und zur Stimulation von Antikörperantworten, kann die Dosis von 100-1000 fache 9 verringert werden, wobei die Dosis der DNA für die Stimulation von cytotoxischen CD8 + T-Zell-Antworten können mit ca. verringert werden. 10.000-fach 2.

Im Gegensatz zu Untereinheit Impfstoffe Antigene oder tot, leben viral und bakterielle Impfstoffe werden in der Regel nicht zu erwarten, von intralymphatische Verwaltungen profitieren. Der Grund dafür ist zum Teil, dass Mikroben in der Regel gut abtropfen zu den Lymphknoten ohne Adjuvans Hilfe leben. Darüber hinaus infektiöse Mikroben können mit Antigen Verdünnungseffekte in peripheren Geweben durch Replikation zu bewältigen. Daher wird die Antigendosis Erreichen des sekundären lymphatischen Systems typischerweise ausreichend, um Immunität zu erzeugen. Wenn jedoch die vorhandenen Live-Impfstoffe produzieren unzureichende Immunität, intralymphatische Verwaltung konnte die erforderliche der Impfstoff wirksam zu machen Korrektur bieten. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Immunität nach der Impfung mit dem derzeit nur Tuberkulose Impfstoff M. bovis BCG könnte durch direkte Injektion von BCG in die inguinalen Lymphknoten von Mäusen 12 verbessert werden. Intralymphatische Verwaltung erlaubt auch eine Verringerung der Menge an eingeimpft BCG von 100-1000 fache im Vergleich zu subkutanen Verwaltungtration. Dies stellt einen Sicherheitsvorteil von intralymphatische Impfung, vor allem in immungeschwächten Personen.

Intralymphatische Immunisierung und Immuntherapie in der menschlichen bisher für Krebspatienten und Allergie-Patienten angewandt. Das Verfahren ist nicht invasiv in menschlichen, aber die besten Ergebnisse und die Qualitätskontrolle durch die Verwendung von Ultraschall zur Einspritzung zu führen, welche Anwendung in Krankenhäusern oder größer Stationen einschränken erhalten. In der Krebsstudien, Prime-Boost-Impfung mit Plasmid-DNA und Peptid für die Behandlung von metastasierendem Melanom zeigte Immunogenität und der Nachweis der Krankheitsbekämpfung in einem definierten Patientenpopulation 29. Auch intralymphatische autologen Impfung mit dendritischen Zellen bei Tumorpatienten durchgeführt worden. Während einige Studien erhöhte Immunantworten 30,31, scheiterte anderen Studien, um den Nutzen der intralymphatische Verwaltungen 32,33 demonstrieren. Das Verfahren von intralymphatische Verwaltung hat sich insbe zu seinders vorteilhaft in der Immuntherapie von Allergiepatienten. Mit dem Wechsel zu dem intralymphatische Methode, die Anzahl der Injektionen für vollständige und erfolgreiche Immuntherapie konnte von ca. 50 subkutane Injektionen über 3 Jahren auf nur drei Injektionen über 2 Monate 14,15 reduziert werden. Da beide Einspritz Zahlen Dosen können stark indem allergenspezifischen Immuntherapie intralymphatischer reduziert werden, und da Lymphknoten enthalten keine Histamin-freisetzenden Mastzellen, stellt die Methoden ein Sicherheitsvorteil, und mit der kurzen Behandlungsdauer, ist die Patientencompliance verbessert. In den nächsten Jahren ist eine Allergie vielleicht der Hinweis, dass die meisten unmittelbaren Nutzen dieser neuen Methode der Impfung und Immuntherapie sehen würde.

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Disclosures

TMK ist als Erfinder der Patente, die sich mit intralymphatische Immuntherapie beim Menschen benannt. TMK ist wissenschaftlicher Berater und hat die Reisekosten von ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, Mannkind Corporation und XBiotech USA Inc. PJ hat kein Interesse Konflikt offen zu legen empfangen.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar für die experimentelle Hilfe bei der Entwicklung der Methode der intralymphatische Immunisierung bei Mäusen von Iris Erdmann, Barbara von Beust und Julia Maria Martínez-Gómez. Vielen Dank auch an Maggy Arras und Nikola Cesarovic, dass Sie uns nutzen ihre Operationssaal für diese Video-Produktion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine (Ketasol-100) Graeub AG, Switzerland Anesthetics
Xylazine (Rompun) Bayer, Germany Anesthetics
Viscotears Eye-Gel Novartis, Switzerland To keep eyes from drying out during anesthesia.
BD Micro-Fine 0.5 ml BD Medical, France 29 G Insulin syringes with permanently attached needles
6-0 Dermalon Monofilament Nylon Covidien, MA, USA For sutures (0.7 metric, 18 G, 45 cm, Blue)
Curved forceps, 4.5 in Polymed, Switzerland For incision and holding of lymph node
Straight surgical scissors, 4.5 in Polymed, Switzerland For incision
Needle holder, 5.5 in Polymed, Switzerland To close incision with suture

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References

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Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen
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Johansen, P., Kündig, T. M.… More

Johansen, P., Kündig, T. M. Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51031, doi:10.3791/51031 (2014).

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