Summary
غالبا ما يفشل التطعيم الوقائية والعلاجية لتحفيز الاستجابات المناعية القوية بسبب الصرف الأسبوع من اللقاح إلى الغدد الليمفاوية وبالتالي إشراك الفقراء من الخلايا المناعية. عن طريق الحقن المباشر للقاح إلى الغدد الليمفاوية، ما يسمى الحقن داخل الوعاء اللمفي، نجاعة اللقاح يمكن تحسين بقوة ويمكن تقليل جرعات اللقاح.
Abstract
وعادة ما يتم حقن تحت الجلد أو في العضل لقاحات لتحفيز الاستجابات المناعية. نجاح هذا يتطلب كفاءة الصرف لقاح إلى الغدد الليمفاوية حيث الخلايا مستضد تقديم يمكن أن تتفاعل مع الخلايا الليمفاوية لتوليد الاستجابات المناعية أراد. قوة ونوع الاستجابات المناعية التي يسببها تعتمد أيضا على كثافة أو تردد من التفاعلات وكذلك المكروية، وخاصة محتوى السيتوكينات. كما سوى دقيقة واحدة جزء من اللقاحات حقن محيطيا تصل إلى الغدد الليمفاوية، وأجريت التطعيمات من الفئران والبشر عن طريق الحقن المباشر للقاح في الغدد الليمفاوية الأربية، أي حقن داخل الوعاء اللمفي. في الإنسان، ويسترشد الإجراء بواسطة الموجات فوق الصوتية. في الفئران، يتم إجراء الصغيرة (5-10 مم) شق في المنطقة الأربية تخدير الحيوانات، المترجمة العقدة الليمفاوية ويجمد مع ملقط، ويتم حقن حجم 10-20 ميكرولتر من اللقاح تحت المراقبة البصرية.يتم إغلاق شق مع غرزة واحدة باستخدام خيوط الجراحة. تم تلقيح الفئران مع الحمض النووي البلازميد، RNA، الببتيد، والبروتين، والجسيمات، والبكتيريا وكذلك المواد المساعدة، ولوحظ تحسن قوي من الاستجابات المناعية ضد كل نوع من اللقاحات. طريقة التطعيم داخل الوعاء اللمفي غير مناسبة وخاصة في الحالات التي تنتج التطعيم التقليدية كافية أو الحصانة حيث كمية اللقاح المتاحة محدودة.
Introduction
وعادة ما يتم حقن تحت الجلد أو في العضل لقاحات لتحفيز الاستجابات المناعية. نجاح هذا الإجراء يتطلب الصرف كفاءة اللقاح إلى الغدد الليمفاوية حيث الخلايا مستضد تقديم يمكن أن تتفاعل مع الخلايا الليمفاوية لتوليد T-B-والاستجابات الخلية. بالإضافة إلى ذلك، قوة ونوع الاستجابات المناعية التي يسببها تعتمد أيضا على كثافة أو تواتر هذه التفاعلات وكذلك المكروية نفسها، خصوصا محتوى السيتوكينات. كما سوى جزء صغير من لقاح يحقن الأنسجة الطرفية تصل إلى العقدة الليمفاوية، واللقاحات من الفئران والبشر عن طريق الحقن المباشر للقاح في الغدد الليمفاوية، ويتم إنشاؤها الاستجابات المناعية للموقع، وقد أجريت. في الإنسان، ويسترشد الإجراء بواسطة الموجات فوق الصوتية، وهو إجراء يستخدم أيضا لإدارة وكلاء التصوير لتصور وتشخيص في النظام اللمفاوي. في الفئران، وهذا الإجراء هو الغازية. هنا، وهو صغير (5-10 ملم) incisioن يتم في المنطقة الأربية الحيوانات تخدير 1، المترجمة العقدة الليمفاوية ويجمد مع ملقط، ويتم حقن حجم 10-20 ميكرولتر من اللقاح تحت المراقبة البصرية، ويستخدم 10 ميكرولتر لحقن الفئران في الأول والشباب مع الغدد الليمفاوية صغيرة، في حين أن 20 ميكرولتر يمكن حقنها في الغدد الليمفاوية من الفئران الأكبر سنا أو تستعد بالفعل، والتي لديها الغدد الليمفاوية أكبر. شق يمكن أن تكون مغلقة مع غرزة واحدة باستخدام خيوط الجراحة. بواسطة هذه الطريقة، وتحصين الفئران مع البلازميد الحمض النووي 2،3، رسول الحمض النووي الريبي 4، 1،3،5،6 الببتيد، البروتين 7-10، الجسيمات 11، 12 البكتيريا وكذلك المواد المساعدة 7،13، وتحسن قوي من المناعة وقد لوحظت استجابات ضد كل نوع من اللقاحات. طريقة التطعيم داخل الوعاء اللمفي غير مناسبة وخاصة في الحالات التي تنتج التطعيم التقليدية الحصانة غير كافية أو حيث كمية اللقاح المتاحة محدودة أو النسخةذ مكلفة. في الإنسان، وقد تم تطبيق الأسلوب داخل الوعاء اللمفي التحصين للمرضى الحساسية 14،15 أو المرضى الذين يعانون من سرطان 16-21. على الرغم من أن الفكرة الحالية هو أن الأسلوب داخل الوعاء اللمفي هو أكثر الغازية من الطرق الأخرى عن طريق الحقن مثل حقن العضلي وتحت الجلد، تصور الألم ليست أعلى من بعد ثقب الوريدي 15. ومن المتوقع أن التطعيم داخل الوعاء اللمفي سوف تصبح بديلا أو مكملا لأساليب أخرى من اللقاحات الوقائية والعلاجية على وجه الخصوص. توضح هذه المقالة في التفاصيل كيف يتم تنفيذ الإجراء التطعيم داخل الوعاء اللمفي في الفئران. ، تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي وصفها الوكالة البيطرية كانتون زيورخ وتنفيذ المبادئ التوجيهية والتوجيهات وفقا لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية الاتحادية السويسرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تخدير الفئران
- إعداد التخدير عن طريق خلط الكيتامين (مخدر فصامي) وزيلازين (مهدئ ومسكن) في مخزنة المالحة. تركيزات الكيتامين وزيلازين في الحل النهائي هي 12.5 و 2 ملغ / مل، على التوالي.
- حقن التخدير إلى الفئران بالإعطاء البريتون باستخدام حقنة مع G إبرة 25-30. استخدام 0.1 ml/10 غرام من وزن الجسم.
- تطبيق مرهم للعين للعيون الفئران من أجل منع جفاف التدريجي من القرنيات.
- أؤكد أن الفأر هو تخدير بما فيه الكفاية من قبل معسر قدم لها أو أخمص القدمين مع ملقط. إذا لا يتفاعل مع الماوس ردود الفعل لقرصة، والمضي قدما لعملية جراحية. إذا يتفاعل الماوس إلى قرصة مع ردود الفعل أو تقلصات العضلات، والانتظار 1-2 دقائق ثم كرر الاختبار قرصة. إذا كان الماوس لا يزال يتفاعل، استبدال الماوس مع حيوان جديد وتكرار الإجراءات من الخطوة 1.2 وما بعده.
2. أنا الجراحيةncision في المنطقة الأربي للماوس
- ضع الماوس على ظهرها.
- تبلل المنطقة الأربية واحد مع تطهير الايثانول (70٪). لتوفير أفضل التطهير، قد يكون حلق المنطقة الأربية لإزالة الفراء تطهير مسبق مع الايثانول.
- تأخذ الساق الخلفية وثني مفصل الورك لإنتاج ما يقرب من زاوية 90 درجة من مفصل الورك.
- باستخدام ملقط microdissecting المنحني، واتخاذ الجلد الماوس في منطقة الأربية حيث مفصل الورك عازمة وسحب الجلد مبلل ارتفاعا طفيفا.
- في حين الضغط على الجلد مع ملقط، وقطع شق صغير (<5 مم) من خلال الجلد باستخدام مقص جراحي.
- وضع غيض من مقص مغلقة في شق وفتح مزيد من شق طريق فتح مقص أثناء الضغط عليه داخل شق. وسوف يسبب هذا الجلد المسيل للدموع، وينبغي أن إنتاج قطر من أقل من 10 ملم. ملاحظة: مصدر ضوء بارد مع ضوء مرونة أدلة يمكن استخدامها لتحسين الرؤية. في كبار السنالفئران، وخاصة الذكور، وتحديد العقدة الليمفاوية قد يكون من الصعب بسبب الكثير الأنسجة الدهنية في المنطقة الاربية.
3. حقن داخل الوعاء اللمفي
- تحضير حقنة (0.5 مل أو أقل) مع 28-30 إبرة تحت الجلد G؛ قد يكون شطبة قصيرة أفضل من شطبة طويلة. نضح 10 ميكرولتر من اللقاح ليتم حقنه، وأؤكد أن حقنة خالية من الهواء.
- توطين العقدة الليمفاوية الأربية مع مساعدة من ملقط المنحني وغيض من مقص مغلقة. فإن العقدة الليمفاوية تظهر رمادي داخل الأنسجة الدهنية أكثر بيضاء ويمكن التعرف على المزيد من خلال ارد وصادر الشعيرات الدموية الداخلة والخارجة من العقدة الليمفاوية.
- شل العقدة الليمفاوية بوضعها بين فروع ملقط المنحني.
- أخذ حقنة وادخال الإبرة في العقدة الليمفاوية مع شطبة مواجهة؛ التأكد من شطبة كله يدخل العقدة الليمفاوية.
- حقن لقاح (10 ميكرولتر). إذا كانت إيماءة الليمفاويةه وتورم (تفجير)، وحقن يمكن افتراض ناجحة. إذا لم يتم وضع الإبرة عميقة بما فيه الكفاية في العقدة الليمفاوية، وبعض أو لقاح كامل قد يتسرب ولا تدخل العقدة الليمفاوية. إذا تم إدخال الإبرة عميقة جدا، وسوف يتم الافراج عن لقاح حقن تحت الجلد تحت العقدة الليمفاوية. في الحالة الأخيرة، كرر الحقن أو استبدال الماوس مع ماوس غير المعالجة الجديدة.
4. إغلاق شق من قبل التخييط
- فتح علبة خياطة جراحية معقمة.
- اتخاذ اجراء من إبرة خياطة مع حامل إبرة في الجزء الأعلى من الجسم إبرة. تشديد حامل إبرة عن طريق الضغط عليه حتى المصيد اسئلة الأول.
- اتخاذ اجراء من الجلد في جانب واحد من شق باستخدام ملقط (اعتمادا على تفضيل الجراح، مسننة أو غير مسننة ملقط أو السنانير الجلد ويمكن استخدام). إدراج إبرة كاليفورنيا. 2-3 مم من حافة الجرح، والدخول من الخارج من الجلد.
- لوسأون عقد من الجلد مع ملقط وفهم الجانب الآخر من شق مع ملقط. إدراج إبرة كاليفورنيا. 2-3 ملم من حافة الجرح، والدخول من الداخل من الجلد.
- تخفيف حامل الإبرة وفهم نهاية الإبرة مع ملقط. سحب الإبرة مع فقي من خلال الجلد، وترك طول مناسب للفقي خارج أول نقطة إبرة الإدراج (إن عدة الفئران هي أن تعامل، وترك نهاية أقصر؛ 5-10 الفئران يمكن تشغيلها على إبرة خياطة مع واحد / فقي).
- جعل عقدة يفضل وفقا لبروتوكولات جراح القياسية. واحد غرزة غير كافية إذا شق ليست أكبر من 10 ملم. لشقوق أكبر، وجعل غرزة الثانية.
5. علاج ما بعد العمليات
- ضع الماوس في قفص، وتغطي مع الأنسجة للحفاظ على الدفء. عند معالجة الفئران متعددة، ووضعها قريبة من بعضها البعض للتدفئة. بدلا من ذلك، وضع الفئران على وسادة دافئة حتى قد أفاقيصل.
- مراقبة الفئران حتى يستيقظون.
- مراقبة الفئران يوميا فيما يتعلق التئام الجروح فضلا عن غيرها من الأعراض السريرية مثل التهابات الجروح. وعادة ما يتم إغلاق الجرح بشكل كاف خلال يومين وتلتئم في غضون سبعة أيام من العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إجراء الحقن داخل الوعاء اللمفي في الفئران، على الرغم من الطبيعة الجراحية، هي على التوالي إلى الأمام وسريع نسبيا. ويمكن لشخص مدرب تنفيذ الإجراء في 3-4 دقيقة. شق أن يتم إغلاق مع غرزة واحدة يشفى عادة في غضون يومين (الشكل 1)
وقد تم تنفيذ التطعيم داخل الوعاء اللمفي أو التحصين مع مرنا، الحمض النووي البلازميد، والببتيدات والبروتينات والفيروسات والبكتيريا. الشكل 2 يوضح إنتاج الأجسام المضادة بعد التطعيم مع فسفوليباز A2 البروتين (PLA2)، كبرى حساسية سم النحل. تم تحصين الفئران CBA في أيام 0، 14، و 28 مع 0.01، 0.1، أو 10 ميكروغرام PLA2 كثف على هيدروكسيد الألومنيوم عن طريق تحت الجلد (الشوري) أو داخل الوعاء اللمفي (iln) الحقن. تم قياس الأجسام المضادة PLA2 محددة (IgG2a) في الدم بعد 8 أسابيع، وأظهرت النتائج أن 0.01 ميكروغرام PLA2 كان كافيا لتحفيز استجابات الأجسام المضادة القوية، في حين كان المطلوب 10 ميكروغرام PLA2 عندما uالغناء الطريق تحت الجلد 9.
كما تم استخدام التلقيح داخل الوعاء اللمفي لتحفيز السامة للخلايا T استجابات الخلايا، على سبيل المثال gp33 الببتيد (KAVYNFATM) من بروتين سكري LCMV، التي تربط MHC من الدرجة-I في سياق H-2DB لتحفيز خلايا CD8 T. في حين أن الحقن تحت الجلد واحد من الفئران TCR318 مع gp33 أثار السامة للخلايا CD8 تي خلية الاستجابات، كان التأثير تقريبا. ستة أوامر من حجم أقوى بعد الحقن داخل الوعاء اللمفي (الشكل 3A)، والفئران المعدلة وراثيا هي TCR318 لCD8 تي خلية مستقبلة محددة لgp33 1.
تم اختبار وظائف CD4 T خلايا الورم أيضا في التحدي الفحص. تم تحصين مرة أخرى C57BL / 6 الفئران تحت الجلد أو intralymphatically مع np52 الببتيد (SDLRGYVYQGLKSG) من البروتين النووي VSV، التي تربط MHC من الدرجة الثانية لتحفيز خلايا CD4 T، وكانت مختلطة مع الببتيد ODN الدليل السياسي الشامل 1826. عندما طعن في الفئران عن طريق الوريد مع np52، معربا عن الخلايا السرطانية EL4 مسانج، وضعت الفئران سرطان الغدد الليمفاوية النظامية (الشكل 3B). وأظهرت الفئران التي تم تحصين بالطريق داخل الوعاء اللمفي مرات البقاء على قيد الحياة لفترة أطول (> 75 يوما) من الفئران تحصين بالطريق تحت الجلد (<22 يوما).
كما تم تنفيذ أسلوب التحصين داخل الوعاء اللمفي في الإنسان، وخاصة لعلاج الحساسية مثل حمى القش. الأسلوب هو معروف حاليا باسم عيليت (داخل الجهاز اللمفاوي العلاج المناعي). في دراسة واحدة على 165 المرضى الذين يعانون من حمى القش، كان 3 دورات عيليت أكثر من 2 أشهر المواد المسببة للحساسية حبوب اللقاح مع الأعشاب فعالة على قدم المساواة مع العلاج التقليدي مع 54 حقنة تحت الجلد أكثر من 3 سنوات 15. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تخفض الجرعة إلى أكثر من 1،000 أضعاف. وبالمثل، في دراسة عن 20 مريضا يعانون من حساسية الفراء القط، 3 جلسات مع إدارة intralymphatically القط حساسية الفراء كان كافيا ليسبب تحسين التسامح لاحقا التعرض لمسببات الحساسية 14.
jove_content "> ويمكن توضيح أحد التفسيرات لتحسين فعالية التحصين داخل الوعاء اللمفي بالمقارنة مع التحصين تحت الجلد في الإنسان. باستخدام البروتين المسمى مع 99mTc المشعة وكما هو موضح في الشكل (4)، لوحظت الحقن تحت الجلد لتصريف سيئة إلى الغدد الليمفاوية في حين بطبيعة الحال التسليم المباشر الحقن داخل الوعاء اللمفي محتوى اللقاح بالكامل إلى الجهاز الليمفاوي، وبالتالي، مما يجعلها متاحة للخلايا المناعية والتحفيز للاستجابة المناعية 22. وتم الحصول على نتائج مماثلة في حقن الفئران مع البروتينات المشعة 9.
الشكل 1. شفاء الجروح بعد الحقن داخل الوعاء اللمفي. تم تحصين الفئران الإناث BALB / ج عن طريق الحقن داخل الوعاء اللمفي. وincis تم إغلاق أيون مع غرزة خياطة واحدة. بعد ذلك بيومين، تم تصويرها للإدارة التئام الجروح موقع الجراحة والحقن.
الشكل 2. التحصين داخل الوعاء اللمفي مع بروتين لتحفيز استجابات الأجسام المضادة. تم تحصين الفئران أنثى CBA في أيام 0، 14، و 28 مع جرعة المشار إليه من البروتين فسفوليباز A2 كثف على هيدروكسيد الألومنيوم. وتدار لقاح تحت الجلد (الشوري) عن طريق الحقن من 50 ميكرولتر في القفا من الرقبة أو 10 ميكرولتر في العقدة الليمفاوية الأربية: العقدة الليمفاوية غادر في الأيام 0 و 28 و العقدة الليمفاوية الحق في يوم 14.
"سرك =" / files/ftp_upload/51031/51031fig3.jpg "/>
الرقم 3. التحصين داخل الوعاء اللمفي مع الببتيد لتحفيز السامة للخلايا CD8 استجابات الخلايا التائية. (A) تم حقن الفئران أنثى TCR318 مع الببتيد gp33 في العقدة الليمفاوية الأربية (iln) أو تحت الجلد (الشوري) في قاطع الطريق الخلفيتين. بعد 24 ساعة، وكان حصاد الغدد الليمفاوية استنزاف وتحليلها لgp33 محددة النشاط في CTL على (E / T) نسبة الخلايا effector/target- من 30:1. (B) تم تحصين الإناث C57BL / 6 الفئران في أيام 0، 2، و 4 مع 10 ميكروغرام np52 بواسطة تحت الجلد (الشوري) أو داخل الوعاء اللمفي (iln) طرق الإدارة. ثم تم الطعن الفئران مع سرطان الغدد الليمفاوية الخلية مسانج (EL-4) معربا عن VSVnp52، وكان يتضح بقاء الفئران مع منحنيات كابلان ماير.
tp_upload/51031/51031fig4.jpg "/>
الشكل 4. إعطاء اللقاح داخل الوعاء اللمفي في البشر. يتم إعطاء اللقاح داخل الوعاء اللمفي في البشر من خلال تخصيص الغدد الليمفاوية تحت الجلد بمساعدة الموجات فوق الصوتية. يتم إدخال إبرة تحت الجلد في paracortex من العقدة الليمفاوية، ويمكن التحكم في حقن عن طريق الملاحظة من العقدة الليمفاوية تورم فوري في الصورة فوق الصوتية. (A) ويسترشد الحقن داخل الوعاء اللمفي بواسطة الموجات فوق الصوتية. (ب) الموجات فوق الصوتية صورة تظهر إبرة (خط مستقيم بيضاء) إدراجها في paracortex من العقدة الليمفاوية. (C) Biodistribution بعد حقن البروتين المسمى بالإشعاع إلى العقدة الليمفاوية الأربية ("Injekt ايم LK"؛ الأمامي يمين) وتحت الجلد ("Injekt subkutan"؛ الأمامي الأيسر). في الرجل اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ثبت أن التحصين داخل الوعاء اللمفي والعلاج المناعي ليكون مناسبا لتحفيز كل من استجابات الأجسام المضادة والاستجابات تي خلية. كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو، الإجراء داخل الوعاء اللمفي التطعيم هو وسيلة سريعة وسهلة لتحفيز استجابات مناعية قوية لدى الفئران. جراح المدربين يمكن تنفيذ الإجراء خلال 3-4 دقيقة. ويمكن أيضا أن تكون مشتركة بين اثنين من الدورة الجراحين واحد حيث يتم عادة القيام التخدير وخياطة الجراح والثاني هو القيام شق والحقن. كفاءة هذا الإجراء هو أكثر من الطريقة تعتمد على مشغل التطعيم الأخرى، وخاصة إذا لم يتم بعد تدريب الجراح أيضا. ومع ذلك، عامل من ذوي الخبرة وقادرة على التكاثر النتائج التجريبية أيضا كميا كما رصدتها التحليل المناعي للاستجابة. وهناك تعديل للطريقة هي حقن اللقاح في 1،2 الطحال. إعداد مماثلة لتلك التي للحقن داخل الوعاء اللمفي، ولكن الحجم (ه) من شق هو عادة أكبر حجما ومصنوعة اثنين من غرز لإغلاقه. أهم مزايا هذا التحصين داخل الطحال هي أن الطحال هو الأسهل العثور على وضرب من العقدة الليمفاوية، والحقن كميات أكبر والحقن أكثر تواترا يمكن تطبيقها، وعلى الرغم من أي ضرر من العقدة الليمفاوية الناجمة عن الإدراج إبرة أو حقنة سينطوي منطقة رئيسية من العقدة الليمفاوية، فإن الضرر في الطحال تنطوي على أقل نسبيا من الجهاز ويكون أكثر من الطابع المحلي.
إجراءات التحصين داخل الوعاء اللمفي في الفئران يمكن تكرار (مثل لقاح تعزيز الحقن) بعد وقت الانتعاش من 3-4 أسابيع قبل الحقنة الثانية في نفس العقدة الليمفاوية هو القيام به. إذا تم التخطيط الحقن أكثر تواترا، وينبغي أن تستخدم كل من الغدد الليمفاوية الأربية اليسار واليمين. اثنين على الأقل من الحقن في العقدة الليمفاوية يمكن أن يتم، ولكن يحتاج إلى مزيد من الدراسات لتحديد هذا القيد المحتملة على نحو أدق. قد يكون من الصعب حقن مزيد من درق إلى تشكيل ندبة سواء في العقدة الليمفاوية في الجلد و، فضلا عن تشكيل الحبيبي المحتملة الناجمة عن المواد المساعدة. من ناحية أخرى، سوف يسبب التحصين عابرة التهاب العقدة الليمفاوية، وسوف زيادة حجم العقدة الليمفاوية تبسيط التعريب والحقن اللاحقة. في الواقع، وتوطين العقدة الليمفاوية يشكل قيدا رئيسيا للأسلوب. بينما الفئران الشباب (أقل من 5 أسابيع) قد يكون العقد الليمفاوية صغيرة جدا، وكبار السن وخاصة الفئران الأكبر سنا من الذكور قد يكون الكثير من الدهون تحت الجلد، وهذا التوطين هو أمر صعب. ويتم الحصول على أفضل الظروف مع الفئران الإناث من 6-12 أسابيع. في الواقع، واحدة من الخطوات الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو الحقن في العقدة الليمفاوية في حد ذاته. سوف حقنة في المنطقة المتاخمة للعقدة يكون معادلا لحقن تحت الجلد مع اثار أضعف بكثير من الاستجابات المناعية من بعد الحقن المباشر داخل الوعاء اللمفي. والسبب هو أن الكبسولة الصلبة بدلا من أن يحيط العقدة ليست قابلة للاختراق إلى جزيئات كبيرة.للمستضد للوصول الى العقدة الليمفاوية، فقد لاستنزاف مع الليمفاوية. يبدأ هذه الرحلة عادة في الأوعية اللمفاوية الأولية في الجلد، لا يزال في القنوات الكبيرة في الطبقة العميقة من الجلد، والتي تستنزف الليمفاوية لجمع السفن في الأنسجة تحت الجلد، من حيث هو الدافع وراء الليمفاوية عن طريق التمعج نحو تجفيف المقبل الغدد الليمفاوية 23،24. يتم إيداع المزيد من المصب مستضد على طول هذا المسار، فإن أقل من ذلك الحصول على الليمفاوية وارد.
طريقة التحصين داخل الوعاء اللمفي المثير للاهتمام بشكل خاص لإدارة مولدات المضادات التي هي مناعة ضعيفة عندما تدار بالطرق التقليدية مثل مسارات العضلي أو تحت الجلد. وقد تم تنفيذ التطعيم داخل الوعاء اللمفي مع مرنا، الحمض النووي البلازميد، والببتيدات والبروتينات والفيروسات والبكتيريا 22،25-27. بينما الببتيدات والبروتينات ليس لديهم المواد المساعدة في بناء ومرنا البلازميد الحمض النووي الفيروسات والبكتيريا بذل الجوهرية مساعد EFFEسنت من خلال توفير إشارات الخطر (تكرار الفيروسات والبكتيريا) أو من خلال تحفيز مستقبلات تول مثل (TLRs) والتي يمكن الشعور الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) مثل الحمض النووي الريبي المفرد الذين تقطعت بهم السبل (TLR7 وTLR8)، انقر نقرا الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (TLR3)، السيتوزين ميثليته الامم المتحدة وجوانين قليل النوكليوتيد مجموعات (TLR9)، flaggelin البكتيرية (TLR5)، عديد السكاريد الشحمي (TLR2 و4) جزيئات فضلا عن غيرها من الفيروسية والبكتيرية 28. وبالتالي، لا سيما الببتيد وسوف اللقاحات البروتين على أساس الاستفادة من التقوية المناعي للحقن اللقاح مباشرة في العقدة الليمفاوية. في الواقع، فقد ثبت أن الاستجابات B-T والخلايا وزادت بعد التطعيم الببتيد داخل الوعاء اللمفي والبروتين في الفئران 1،8،9. وعلاوة على ذلك، واللقاحات الجينية، وخاصة اللقاحات استنادا مرنا، غير مستقرة للغاية ولهذا السبب فإنها سوف تستفيد بالتأكيد من أسلوب الإدارة الذي مكن مرات مرور قصيرة في الأنسجة خارج الخلية. في الواقع، والتطعيم داخل الوعاء اللمفي مع مستضد أونالترميز الحمض النووي الريبي أثارت قوية حصانة وقائية وعلاجية في نماذج ورم الماوس 4. وبالمثل، تمكين الإدارة داخل الوعاء اللمفي المواد المساعدة مثل الدليل السياسي الشامل والحد من السمية نظرا لأقل جرعة المطلوبة، ولوحظ زيادة تأثير المواد المساعدة بسبب التأثير المباشر وغير مخفف على الخلايا المناعية 13. أيضا أداء المواد المساعدة الأخرى أو أنظمة تسليم مستضد مثل النانو والبوليمرات المجهرية الدقيقة وكذلك الجسيمات الشحمية يمكن تحسينها من قبل الإدارة داخل الوعاء اللمفي 11. آخر ميزة كبيرة من داخل الوعاء اللمفي على طرق التطعيم التقليدية هو أن جرعات أقل بكثير من المطلوب عادة. للبروتينات وتحفيز استجابات الأجسام المضادة، يمكن أن تخفض الجرعة إلى 100-1،000 أضعاف 9، في حين أن جرعة من الحمض النووي لتحفيز السامة للخلايا CD8 استجابات الخلايا التائية يمكن تخفيض مع تقريبا. 10،000 أضعاف 2.
وعلى النقيض من المستضدات الوحيدات أو لقاحات ميتة، يعيش فيروعادة لا يتوقع أن تستفيد من الإدارات داخل الوعاء اللمفي القاعدة واللقاحات البكتيرية. السبب في ذلك هو في الجزء الذي نعيش استنزاف الميكروبات عادة جيدا إلى الغدد الليمفاوية دون أي مساعدة المساعد. علاوة على ذلك، يمكن أن الميكروبات المعدية مواجهة آثار التخفيف مستضد في الأنسجة الطرفية بواسطة النسخ المتماثل. وبالتالي، فإن جرعة المستضد الوصول إلى الجهاز اللمفاوي الثانوي تكون عادة كافية لتوليد المناعة. ومع ذلك، حيث اللقاحات الحية الموجودة على انتاج مناعة كافية، يمكن أن توفر الإدارة داخل الوعاء اللمفي التصحيح الضرورية لجعل قاح فعال. وقد تجلى مؤخرا أن الحصانة بعد التطعيم بلقاح السل الوحيدة المتاحة حاليا M. البقرية BCG يمكن أن تحسن بشكل كبير عن طريق الحقن المباشر للBCG في الغدد الليمفاوية الأربية من الفئران 12. كما سمحت الإدارة داخل الوعاء اللمفي الحد من كمية من تلقيح BCG من قبل 100-1،000 أضعاف مقارنة ادارية تحت الجلدالفلترة. هذا يمثل فائدة سلامة التطعيم داخل الوعاء اللمفي، وخاصة في الأشخاص للخطر المناعي.
وحتى الآن تم تطبيق التحصين داخل الوعاء اللمفي والعلاج المناعي في الإنسان لمرضى السرطان ومرضى الحساسية. الأسلوب في الإنسان هو موسع، ولكن أفضل النتائج ومراقبة الجودة والتي تم الحصول عليها باستخدام الموجات فوق الصوتية لتوجيه الحقن، والتي قد تحد من تطبيق إلى المستشفيات أو وحدات الرعاية أكبر. في دراسات السرطان، التطعيم رئيس-دفعة مع DNA البلازميد والببتيد لعلاج سرطان الجلد المنتشر كشف المناعية ودليل على مكافحة المرض في السكان المريض محددة 29. أيضا تطعيم ذاتي داخل الوعاء اللمفي مع الخلايا الجذعية قد أجريت في مرضى السرطان. في حين عززت بعض التجارب الاستجابات المناعية 30،31، فشل التجارب الأخرى للتدليل على فائدة الإدارات داخل الوعاء اللمفي 32،33. وقد أثبت هذا الإجراء من الإدارة داخل الوعاء اللمفي أن تكون ESPEcially مفيد في العلاج المناعي للمرضى الحساسية. عن طريق تغيير الأسلوب داخل الوعاء اللمفي، يمكن تخفيض عدد الحقن لعلاج مناعي كاملة وناجحة من حوالي 50 حقنة تحت الجلد أكثر من 3 سنوات إلى 3 فقط حقن أكثر من 2 أشهر 14،15. لأن كلا أرقام حقن جرعات يمكن تخفيض بقوة عن طريق القيام حساسية معينة المناعي داخل الوعاء اللمفي، ومنذ العقد اللمفاوية لا تحتوي على الخلايا البدينة بين الافراج عن الهستامين، وأساليب يمثل فائدة السلامة، ومع مدة العلاج قصيرة، تم تحسين الامتثال المريض. على مدى السنوات المقبلة، والحساسية وربما كان إشارة إلى أن سوف نرى فائدة الأكثر إلحاحا من هذه الطريقة الجديدة من التطعيم والعلاج المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يدعى TMK كما المخترع من براءات الاختراع التي تتعامل مع العلاج المناعي في الإنسان داخل الوعاء اللمفي. وقد TMK المستشار العلمي وتلقت نفقات السفر من ImVisioN محدودة، Cytos التكنولوجيا الحيوية، وشركة MannKind، وXBiotech الولايات المتحدة الأمريكية شركة PJ ليس لديها مصلحة الصراع في الكشف عنها.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون للمساعدة التجريبية في تطوير طريقة التحصين داخل الوعاء اللمفي في الفئران من إيريس اردمان، باربرا فون بوست، وجوليا ماريا مارتينيز، غوميز. وذلك أيضا بفضل ماجي أراس ونيكولا Cesarovic على السماح لنا استخدام المسرح بهم الجراحية لهذا إنتاج الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Ketasol-100) | Graeub AG, Switzerland | Anesthetics | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer, Germany | Anesthetics | |
| Viscotears Eye-Gel | Novartis, Switzerland | To keep eyes from drying out during anesthesia. | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml | BD Medical, France | 29 G Insulin syringes with permanently attached needles | |
| 6-0 Dermalon Monofilament Nylon | Covidien, MA, USA | For sutures (0.7 metric, 18 G, 45 cm, Blue) | |
| Curved forceps, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision and holding of lymph node | |
| Straight surgical scissors, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision | |
| Needle holder, 5.5 in | Polymed, Switzerland | To close incision with suture |
References
- Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
- Maloy, K. J., et al. Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).
- Smith, K. A., et al. Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides. Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).
- Kreiter, S., et al. Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity. Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).
- Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
- Smith, K. A., et al. Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors. Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).
- Johansen, P., et al. Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy. Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).
- Johansen, P., et al. Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens. Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).
- Martinez-Gomez, J. M., et al. Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy. Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).
- Martinez-Gomez, J. M., et al. Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy. Allergy. 64, 172-178 (2009).
- Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Control Release. 147, 342-349 (2010).
- Waeckerle-Men, Y., et al. Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis. Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).
- von Beust, B. R., et al. Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration. Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).
- Senti, G., et al. Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections. J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).
- Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
- Lesterhuis, W. J., et al. Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients. Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).
- Fadul, C. E., et al. Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy. J. Immunother. 34, 382-389 (2011).
- Eizenberg, P., et al. Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina. Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).
- Durando, P., et al. Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine. Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).
- Barth, R. J., et al. A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
- Schwaab, T., et al. Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients. Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).
- Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M.
- Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen. Immunity. 21, 341-347 (2004).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).
- Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B.
- Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. New routes for allergen immunotherapy. Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).
- Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).
- Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).
- Ribas, A., et al. Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
- Bedrosian, I., et al. Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients. J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).
- Lesimple, T., et al. Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects. Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).
- Brown, K., et al. Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys. J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).
- Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).
