Summary
病毒诱导的基因沉默是一个有用的工具，用于识别植物非寄主抗性基因参与。我们演示了如何使用中表达GFPuv的识别基因沉默植株易受非寄主病原体的细菌病原体。这种做法是方便，快捷，有利于大规模筛选和类似协议可以应用到其他各种植物与微生物相互作用研究。
Abstract
非寄主植物对细菌病原体的抗病能力控制复杂的防御途径。了解这一机制是非常重要开发耐用的抗病植物对病原体的广泛。病毒诱导的基因沉默（VIGS）基于正向遗传学筛选是用于识别赋予非寄主抗性植物防卫基因的一个有用的方法。 烟草脆裂病毒 （TRV）的沉默载体是最有效的VIGS载体和有效地使用已内源性靶基因沉默在烟草 。
在这篇稿件中，我们展示了一个正向遗传学筛选方法沉默单个克隆cDNA文库在N本生和评估对非寄主病原体损害非寄主抗性基因沉默植株的响应， 野火病菌番茄T1，P.丁香甘油 PV。成人教育学院，和X油菜叶斑病病菌。这些细菌病原体设计到快递GFPuv蛋白质和绿色荧光的菌落肉眼可以看出，如果在非寄主植物病原体接种在紫外光下沉默目标基因参与传授非寄主抗性。这有利于可靠和更快的识别基因沉默植株易受非寄主病原体。此外，有希望的候选基因的信息可以被称为TRV载体序列的植物基因插入。在这里，我们展示了VIGS介导的正向遗传学的高吞吐能力，以确定基因参与非寄主抗性。大约100个cDNA可以在约2至3周，对一些非寄主细菌病原体的非寄主抗性的相关个别沉默可以研究在其后的一个星期。在这篇稿件中，我们列举参与筛查的具体步骤。 VIGS介导的正向遗传学甄选NG方法不仅可以延长参与非寄主抗性基因鉴定，但也研究基因传授各种植物物种的一些生物和非生物胁迫公差。
Introduction
非寄主抗性是对一个特定的病原体1,2种族的所有植物物种的阻力。这赋予广谱和持久抗病植物中2,3。然而，其作用机制，尤其是对细菌病原体，没有得到很好的理解。妥协非寄主抗性，高通量转录分析识别差异表达的基因在非寄主抗性5-9有两种主要方法，以前用于解剖细菌非寄主抗性的突变体或沉默植株的筛选。因为非寄主抗性是由一个复杂的机制（S）4与许多基因的参与，高通量功能基因组学方法进行基因识别控制，是为更好地理解非寄主抗性机制（S）的关键。
病毒诱导的基因沉默（VIGS）已成功地用于植物内源沉默基因在许多植物物种10,11。 烟草（Nicotiana benthamiana）是最适合的植物病毒诱导的基因沉默10,12和它的基因组序列草图，现已13。 烟草脆裂病毒 （TRV）基于VIGS技术已被广泛用作反向遗传学工具表征基因参与非寄主抗性2,4,14。这VIGS载体及衍生产品现已通过拟南芥生物资源中心（ABRC， http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ）。 VIGS也被用来确定参与植物免疫力15-17，特别是6,18非寄主抗性基因作为一个正向遗传学工具。评估过敏性反应（HR）介导的细胞死亡由一个特定的非寄主植物对病原体引起和评估疾病诱导的细胞死亡，是两个主要检测主要用于identifyin的克易感基因沉默植株。然而，HR细胞死亡不仅对II型非寄主病原体引起的，而不是针对I型非寄主病原体2。因此，人力资源分析不能被普遍用来识别非寄主抗性被植物所利用的策略，特别是针对广泛的I型非寄主病原体。此外，在基因沉默的植物非寄主抗性的部分损失并不总是导致疾病的症状，因此不能用来确定损害非寄主抗性的植物疾病的得分。相反，评估非寄主病原体的基因沉默植株的增长是一个更好的方法研究非寄主抗性基因沉默植株的损失。
以往的生长测定6,19，更快速的方法，以评估非寄 主细菌生长的基因沉默的植物相比，可以缩短在正向遗传学筛选所需的时间。我们此前报道的方法观察细菌升病原体生长在紫外线（UV）光叶肉眼使用细菌表达绿色荧光蛋白（GFP）19。在这篇稿件中，我们表现出的实用性表达GFPuv的非寄主细菌病原体受到损害非寄主抗性基因沉默植株易于识别。这种方法是准确识别敏感的植物，适合高通量筛选。
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Protocol
1。植物生长与靶基因沉默
- 植物生长的条件：
- 母猪N.本生种子无土盆栽混合物，地铁混合350和发芽的种子在生长室。任何其它也可用于土壤或土壤的介质，而不是对新城混合。
- 移植三周龄的苗成单个盆种植在温室中保持在21±2℃以及与其他的生长条件，详细的在以前的文献12。移栽后的两到三天，植物可以用来为TRV接种。
- 成长TRV2克隆：
TRV是一个双向的病毒，其基因组由RNA1和RNA2。 RNA1编码的RNA依赖性RNA聚合酶的运动蛋白20,21。 RNA2编码外壳蛋白（CP）和两个非结构蛋白的亚基因组RNA 21。双方RNA1和RNA2需要形成成熟VIR我们粒子及其传播20,21。构建cDNA文库在TRV2载体在以前的文献22,23。简单地说，在本研究中使用的VIGS库构建从从暴露于各种生物和非生物诱导子的叶组织中提取的RNA。- 取出根癌农杆菌 GV2260菌株含有的cDNA克隆（96孔板），从冷冻库在TRV2矢量。逐渐解冻后，培养物达到室温，接种个体的根癌农杆菌培养利福平（10微克/毫升）和卡那霉素（50微克/毫升）的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，用96针复制器。
- 在28°C孵育板两天。我们通常生长四个复制殖民地每个克隆，以便有足够的农杆菌接种接种两种植物刺。无菌条件下执行所有步骤。
- VIGS：
- 增长农杆菌 （GV2260）携带TRV1在28°C与上述抗生素的LB液体培养基中。从过夜生长的培养物通过离心收获细胞，重新悬浮在接种缓冲液（pH为5.5的10mM MES，200μM的乙酰丁香酮），在振荡器上以50rpm在室温下孵育3小时。
- 通过离心收集细胞，并重新悬浮在5mM的MES缓冲液（pH值5.5），接种量（OD 600 = 0.3）到3-4 N.背面的边叶本生使用无针注射器。详细的接种程序是体现在以前的文献24。后来，在现场的TRV1接种，接种各自TRV2菌落用牙签刺的叶子。
- 保持足够的营养生长旺盛的植物是非常重要的高效沉默12。大约两个星期后接种靶基因的转录将开始减少，植物病原体接种到准备ulation TRV接种后三个星期。
2。非寄主病原文化的准备和植物接种
- 在本研究中所用的病原体的详情：
野火病菌粉虱，P.番茄斑点病菌。T1，P.斑点病菌glycinea和野油菜黄单胞菌叶斑病病菌。用于此项研究。成长P.丁香株在King的B（KB）与利福平（10微克/毫升），卡那霉素（50微克/毫升）的液体培养基，在28℃12小时。成长十油菜叶斑病病菌。在LB液体培养基中16小时。所有病原体怀有质粒可以表达GFPuv的在以前的文献19。 - 制备植物接种病原体培养：
- 通过离心收获细菌细胞，并确认绿色荧光的存在下，使用长娃velength紫外灯在黑暗中。两次用无菌水清洗细胞，重新悬浮，用无菌水稀释至所需浓度。
- 接种相应的病原体（次）目标基因沉默点（约1.5厘米直径）叶（5 日至8 日 ），背面的边。几个非寄主病原体可以同时测试它们的生长中的靶基因沉默的植物。同时接种宿主病原体，因为这可以用来作为阳性对照，用于查看在植物中的细菌生长。接种矢量控制（TRV :: 00）植物。
3。 在植物生长的细菌病原体的观察
- 公开接种叶长波长的紫外线灯在黑暗中。可以被看作是在背景中的表面发出的红色荧光叶叶子的背面的边的绿色荧光点的细菌菌落。
- 观察病原体生长后2天接种（dpi）的5 dpi的。在这个时间间隔期间的日常生活观察是必要的。
- 后的第一个画面，短名单的克隆其沉默的一个或多个非寄主病原体的生长结果。
- 重复VIGS所选克隆和再次测试非寄主病原体的基因沉默植株的响应。这种二级筛选做是为了消除过程中获得的第一个画面的误报。
4。确认入围植物非寄主抗性受损的
- 沉默如上所述的从屏幕上选择的cDNA克隆。接种的整个非寄主植物与病原体的浸没与相应的病原体培养的植物，具有0.01％（体积/体积）的Silwet L-77和水中植物经受真空为3 - 5分钟。通过常规的生长测定6,18,19量化细菌的生长（如下文所述）。
- 在0小时接种后（HPI），3 dpi和5 dpi的两个叶片样品，收集五生物复制为每个非寄主病原体（次）接种叶用叶冲（0.5厘米2）。研磨叶样品，串行稀板块SAP KB琼脂培养基上辅以适当的抗生素和孵化，在28°C，2天。用菌落计数器计数的细菌菌落，并计算以前的文献6中所描述的叶片中的细菌的生长。
- 植物易受非寄主病原体（次），应该表现出较高的数目相比，矢量控制病原体的生长。
5。靶基因序列的插入和鉴定
- 选定的克隆经重组和attB2引物的使用或使用的引物侧翼克隆网站在TRV2载体，进行菌落PCR。运行PCR产物在凝胶上，并检查是否为单一的条带的扩增。
- 植物基因插入可测序在TRV2载体的使用attB位侧翼克隆位点的引物或引物。
- 使用序列进行BLAST和识别基因详情。
- 随着非翻译区（非编码区）获取全长基因序列。
- 优先选择300-400 bp的片段，来自三个不同区域的序列和克隆到TRV2载体。独立执行VIGS使用所有三个VIGS结构和确认在所有三个基因沉默植物非寄主抗性的妥协。
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Representative Results
这项研究的主要目的是要证明的方法，方便，准确识别基因沉默N. benthamiana植物非寄主抗性受到损害。这种方法有四个主要步骤。第一个步骤是个别地大量使用TRV-VIGS基因沉默。我们已经沉默了大约5000个基因6,18过了一段约1.5年的使用协议， 如图1所示。部分的基因沉默的植物表现出各种表型的改变，包括生长发育迟缓，泛黄和光漂白的表型（ 图2）。
第二步是识别基因沉默植物非寄主病原体（次）的易感性。我们使用表达GFPuv的细菌在植物 （ 图3A-3C）和跟踪他们的成长。为了证明的过程中识别的基因沉默植物易受到非寄主pathogen（次），我们使用了三个非寄主病原体，P.番茄斑点病菌。T1，P.斑点病菌glycinea和X油菜叶斑病病菌。正如预期的那样，非沉默（矢量控制）N.这些病原体接种benthamiana植物没有增长，因为他们无法克服植物免疫力。然而，P.丁香 PV。 番茄 T1形成绿色荧光菌落NbSGT1基因（基因牵连非寄主抗性25）沉默的植物（ 图3D）。这些数据表明识别基因沉默植物非寄主抗性的妥协的过程。这个协议可以直接应用到正向遗传学筛选。例如，代表性的结果之一，从我们以前的，正向遗传学屏（ 图4）显示了两个独立的基因沉默植株不同程度的P.斑点病菌 。 番茄的 T1增长（ 图5
第三步是确认细菌生长的基因沉默植株从屏幕上确定量化细菌生长。 如图3E所示，例如， 在植物中的细菌生长的NbSGT1基因沉默植株估计。结果表明， 在植物生长的P斑点病菌番茄 T1高得多的NbSGT1沉默植株相比，非沉默对照植株（TRV :: 00）（ 图3E）。由于一个特定的基因沉默的非寄主抗性的亏损可能是部分或完整。根据此，非寄主上的基因沉默的植物病原体生长的程度可以有所不同。
第四步，测序中的插入TRV2载体。 BLAST进行使用该序列，以确定基因和它的细节。
图1。卡通来表示沉默大量使用基于TRV-VIGS基因所涉及的步骤。三周龄N.本生植物移植到个体的盆和增长了几天。搭载TRV1构建体的根癌农杆菌渗透到三到四叶使用不必要的注射器。后来，LB琼脂平板上生长的96个cDNA克隆单独采取用牙签，扎在各自的植物接种点TRV1。接种后3周左右，靶基因沉默发生在顶部未接种的新生长的树叶。这些叶子（5 日至8 日 ）被用于测试非寄主病原体的生长（次）。
图2。 VIGS介导的正向遗传学筛查本生烟示出在植物表型的各种改变。三周龄的N。 benthamiana植物TRV各自独立地接种结构descried在图1中示出为正向遗传学屏的一部分。照片拍摄TRV接种后第21天。
图3。绿色荧光从GFPuv表达细菌病原体和参与非寄主抗性基因鉴定其使用。 野火病菌粉虱 ，主机病原体，携带GFPuv构造上划线KB中小板在长波紫外线灯在黑暗中显示出绿色荧光（ A）。这些细菌在KB培养基上生长，并再悬浮于水（B），并接种到N。本生 4 CFU /毫升）。接种后3天（dpi）的细菌菌落被视为绿色荧光斑点，肉眼从背面的边叶表皮细胞（C，左）。正常光线下（可视范围）合照相同的叶子也显示（C，右）。表达GFPuv的P.丁香 PV。 粉虱（PSTAB，1×10 4 CFU /毫升）和三个非寄主病原体，P.斑点病菌番茄T1（PstT1，1×10 4 CFU /毫升），P.斑点病菌。glycinea（PSG，3×10 5 CFU /毫升）和野油菜黄单胞菌叶斑病病菌。（XCV，3×10 4 CFU /毫升）接种于背面的边叶矢量控制（TRV :: 00; D，左）和分NbSGT1基因沉默植株（D，右）。细菌菌落PSTAB看到的叶和那些仅在N能够被看见PstT1的的bSGT1基因沉默的叶子。PstT1增长NbSGT1基因沉默叶量化在24日，24日和72小时后接种（HPI，E）在图中所示。 点击此处查看大图 。
图4。协议概述VIGS介导的正向遗传学筛选鉴定参与非寄主抗性基因 cDNA文库构建TRV2载体使用RNA的非寄主病原体（次）接种N.本生烟叶可用于筛选。在N个人从cDNA文库中克隆沉默本生 TRV-VIGS。各自GFPuv表达非寄主细菌病原体（次）接种基因沉默植物的叶子。 2至使用UV灯在黑暗中4 dpi以接种点观察，确定和表示非寄主病原体生长的植物。这个初步筛选后，选定的克隆再次沉默，非寄主病原体增长再次确认。第二级别的屏幕做是为了消除误报。购买，证实克隆是第三次沉默，估计各自的细菌生长。插入在TRV2向量的各克隆进行测序，确定基因信息。同时，人力资源检测也可以进行基因沉默植株，以确定基因导致HR对II型非寄主病原体诱导。
图5。非寄主细菌病原体的生长基因沉默的植物被确定为的正向遗传学屏的一部分。从forwar图片ð遗传学筛查发现的基因参与非寄主抗性N.本生的植物对PstT1，PSG和XCV。两个有代表性的基因沉默植株接种后在3 dpi拍摄的照片都在这里显示。 图3中描述的用于接种的细菌浓度。 43D4 94C1表示的96孔板号码，随后由井数。
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Discussion
植物免疫力限制非寄主病原体的生长，因此，很少或根本没有发出绿色荧光矢量控制植物的叶子接种非寄主病原体在长波长紫外光灯（ 图3D）。然而，当在非寄主抗性有关的基因沉默，基因沉默的植物有利于生长的非寄主的病原体和绿色荧光出现（ 图3E）。这是这个手稿中所描述的方法中所涉及的基本原理。这种方法有两个主要的优点，在人力资源为基础的检测。 在植物生长，可以被看作一个沉默植株易受非寄主病原由基于GFPuv的检测，鉴定的准确性增加。其次，这种方法允许参与I型非寄主抗性2,26（不会导致可见的细胞死亡）和II型非寄主抗性2,26（导致过敏性反应性细胞死亡）的基因鉴定。例如，我们先前发现的克隆叫6C8和沉默植株易受双方1型和2型病原体18。
此外，它是可能的，两个或更多个独立的克隆，用于VIGS导致相似的表型，因为它们发生沉默特定基因的基因沉默植物。这种冗余是有用的，因为它确认的沉默表型。这种重复的发生取决于用于筛查和基因类型（如某些基因高表达，并因此多次发生在图书馆）图书馆。此外，几乎所有的克隆基因编码由N.本生基因组进一个基因沉默库和独立沉默是可能的。
为了有效地实施正向遗传学筛选非寄主抗性使用荧光法GFPuv VIGS涉及的基因鉴定，以下技巧是有用的。
为了为成功的VIGS技术，（1）使用3 - TRV接种4叶期的植物，（2）最佳TRV1和TRV2滴定度是很重要的。可以由于TRV2滴度VIGS技术开始的一个限制因素，接种农杆菌窝藏TRV2至少4充分生长的菌落，及（3）保持最佳的环境条件12。环境温度最佳VIGS诱导起着重要的作用。
为高效绿色荧光病原体检测的关键步骤包括：（1）总是用新鲜病原体培养，收获指数生长期，不要将它们存储在接种前;及（2）应避免HR细胞死亡，因为他们可以自动发出荧光，紫外光下光产生负面影响的观察。用于研究II型非寄主病原体（例如丁香假单胞菌番茄 T1病菌。）时，这一点尤其重要。使用低浓度非寄主病原体，如果微观HR怀疑或EVidenced。
故障排除：
（1）在基因沉默和变量之间的沉默型发生不一致复制：
改变TRV接种过程中的每一个克隆手套。此外，请确保该TRV2 农杆菌菌落不包含多个菌落PCR克隆。如果菌落PCR揭示了一个以上的频带，它是可能的多个克隆的菌落中存在。为了分离克隆，条痕的LB琼脂平板和屏幕的克隆进行菌落PCR，。单个克隆鉴定后，进行独立VIGS为他们每个人识别的基因沉默植物影响非寄主抗性。
（2）严重的生长缺陷沉默的植物：
如果沉默靶基因（s）是参与植物的基础代谢，生长缺陷预期。然而，一些基因沉默计划日ts可能会表现出较高的TRV乘法相比，矢量控制的植物，这可能会导致严重的表型上的加性效应。可以进行局部病变检测12 苋色藜植物，以找出是否沉默的植物具有较高的TRV滴度相比，矢量控制植物。在这些情况下，对4周龄的植物可以用于VIGS技术，以减少严重的表型。
（2）脱靶基因沉默：
VIGS过程中可能发生非特异性的基因沉默，通常被称为脱靶沉默。发生这种情况的部分序列同源性允许的siRNA产生预期的目标基因降解mRNA的基因是沉默目标不是预期的27。使用非编码区序列的如插入在TRV2载体。研究所有预期的脱靶基因的内源性基因表达下调，并确保构建一个单一的基因沉默的利益。 Ťo促进以最小的或没有脱靶基因片段的识别，生物信息学工具可以使用（例如， http://plantgrn.noble.org/pssRNAit/ ）。
（3）无绿色荧光在植物中的细菌菌落：
会出现这种情况最有可能通过使用以上的生长培养。另一个原因可能是较小的细菌接种。虽然细菌浓度可以间接测量，通过测量光密度OD 600，死细菌细胞可以弥补较高的外径。可取的做法是通过活细胞计数KB琼脂培养基平板上的菌落形成单位（CFU）计算最佳的细菌浓度。 OD值可以调整的基础上的菌落。此外，连胜的病原体尽可能经常从甘油股票，成长的KB琼脂平板上，并准备文化接种，接种单新鲜的殖民地。
一个经常发生的与在TRV2向量进行菌落PCR，测序插入的困难的原因是多个菌落的存在。为了克服这一点，窝藏个人TRV2构建的克隆进行分离，如上面提到的（＃1）。
GFPuv方法以及如何克服的局限性：
病原体的可能会失去GFPuv的携带质粒在乘法，因此，产生不利影响的观察。此外，一些基因沉默的植物显示泛黄和光漂白的叶子和这些叶子发出不同的荧光（比红）。这使得绿色荧光很难看到。自动荧光黄色或白色的叶子，以减少影响的方法之一是捕捉到图片的绿色荧光细菌，使用一个摄像头，配有过滤器，可以消除或减少的背景EFFE克拉。可以用来推断细菌是否已经长大或图片。可用于某些软件（例如，Adobe Photoshop中），以减少在分析过程中，这样的图像的背景效果。
在实验过程中，需要遵循生物安全防范措施，如适当的处置转基因细菌病原体。此外，适当的皮肤和眼睛的防护处理时，应使用紫外线灯。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这个项目是由塞缪尔·罗伯茨诺贝尔基金会。作者感谢MSS。珍妮Gallaway和科琳埃尔斯优良的植物护理和凯蒂·布朗女士艺术品。我们也想感谢MSS。天合光能科特雷尔，普加Uppalapati，萨哈Moumita，Swetha Vinukonda，此协议在建立技术帮助的艾萨克Greenhut先生。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well U-bottom plates | Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA) | 35-3077 | |
| 96-pin replicator stainless steel | Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA) | 250520 | |
| High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap | Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA) | 6283K50 | Manufacturer ID 95-0127-01 |
| Stuart SC6 colony counter | Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK | SC6PLUS | |
| Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350 | SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA) | ||
| Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) |
Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA) | Custom synthesized | |
| MES, Monohydrate | VWR international (Radnor, PA, USA) | CAS No. 145224-94-8 | |
| Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D134406 | |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) | Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA) | VIS-30 |
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