ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
يتم تقديم بروتوكول للتصوير الطولي دينامية وآفة الليزر الانتقائي من النهايات العصبية في الفئران المعدلة وراثيا مراسل.
Abstract
وتشارك النهايات العصبية في الجلد في العمليات الفسيولوجية مثل الاستشعار 1 وكذلك في العمليات المرضية مثل آلام الأعصاب 2. على المواقع قريبة إلى سطح يسهل التصوير المجهري من النهايات العصبية في الجلد الحية الحيوانية سليمة. باستخدام المجهر multiphoton، فمن الممكن الحصول على الصور الجميلة التغلب على مشكلة تشتت الضوء القوي من أنسجة الجلد. مراسل الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن EYFP تحت سيطرة خاصتك-1 المروج في الخلايا العصبية (بما في ذلك محيط الخلايا العصبية الحسية) مناسبة تماما للدراسات طولية من النهايات العصبية الفردية على مدى فترات طويلة من الزمن تصل إلى عدة أشهر أو حتى مدى الحياة. وعلاوة على ذلك، باستخدام نفس يزر الفيمتو ثانية بالنسبة للتصوير، فمن الممكن أن ينتج آفات انتقائية للغاية من الألياف العصبية للدراسات إعادة الهيكلة الألياف العصبية. هنا، نقدم بروتوكول بسيطة وموثوق بها لmultiphoton طولية في الجسم الحي والتصويرالمجهرية القائم على الليزر على الماوس النهايات العصبية الجلد.
Introduction
النهايات العصبية الجلدية تخضع التغيرات الديناميكية في إطار الدول المرضية المختلفة. يمكن أن الألياف العصبية تذهب من خلال عملية انحطاط وتجديد أو إعادة الهيكلة في سياق أمراض مثل اعتلال الأعصاب المحيطية 2 أو مورتون العصب 3. بعد الإصابات، جزءا هاما من النهايات العصبية المحركة في الجلد هو عودة التعصيب من المنطقة المتضررة. ومع ذلك، فإن نهج مشترك للتحقيق في النهايات العصبية هو خارج الحي النسيجية باجتزاء تفتقر إلى المعلومات في الوقت الحقيقي على العمليات الجارية 4. استخدام علامات الفلورسنت المشفرة وراثيا، فمن الممكن لتتبع النهايات العصبية في الجلد من الحيوانات الحية، وبالتالي الحصول على معلومات غنية وبشكل ملحوظ أكثر ملاءمة على التغييرات الهيكلية. التحقيق في النهايات العصبية الجلدية من الممكن استخدام المجهر الفلورسنت التقليدية، ومع ذلك، تناثر الضوء القوي من أنسجة الجلد تقوض بشدة الجودةمن البيانات المستقاة 5. Multiphoton المجهري يسمح اقتناء صور عالية الدقة في الأنسجة نثر بشدة بسبب الجمع غير الخطية للطاقة فوتونات الضوء الإثارة مما أدى إلى انبعاث مضان فقط من النقطة المحورية لهذا الهدف. هذا التأثير يؤدي إلى زيادة قوية في عمق الاختراق وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لقياس في أنسجة الجلد 6. باستخدام نفس الليزر والتصوير، وأنه من الممكن لإنتاج تشريح انتقائية من الألياف العصبية 7. في البروتوكول التالي نقدم لك طريقة التصوير الطولي من النهايات العصبية الجلدية في الجسم الحي في الفئران المعدلة وراثيا مراسل جنبا إلى جنب مع انتقائية الآفة باستخدام الليزر المتاحة تجاريا نظام المجهر multiphoton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل المجلس الوطني تجربة الحيوانية وفنلندا.
1. إعداد الحيوان للتصوير
- تخدير الماوس بواسطة intraperitional (IP) حقن الكيتامين (0.08 ملغ من وزن الجسم) وزيلازين (0.01 ملغ من وزن الجسم). تحقق التخدير مع الخلفية العاكسة قرصة أخمص قدميه.
- تزج عيون الحيوان في قطرات العين (Viscotears) لحماية العينين من الجفاف.
- ضع الماوس على وسادة التدفئة (سوبر تك) عند 37 درجة مئوية لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- تنظيف لوحة القدم المعين للتصوير مع الايثانول 70٪.
- إضافة قطرة من الماء على الجلد من لوحة القدم للاقتران الغمر بين الجلد والزجاج غطاء.
- وضع مواد التعبئة والتغليف البلاستيكية تحت مخلب هند أن يتم وضع إطار حلقة معدنية مع طبقة الغطاء.
- ضبط سمك مواد التعبئة والتغليف البلاستيكية لشد الجلد.
- وضع قطرة من الماء على الزجاج غطاءق للالغمر بين الزجاج غطاء والهدف.
2. المعادن التبعي إعداد الدائري
- لتحقيق الاستقرار في الجلد الاستفادة من المعادن التبعي. نستخدم المجتمع تصميم المحمية التبعي الجناحين اثنين مع حلقة معدنية (تقدمة من Neurotar المحدودة، فنلندا). ملء المحاقن مع superglue، وضع قطرة صغيرة من superglue من خلال الإبرة على الحلبة ونشر برفق الغراء لتغطية موحدة من سطح الحلبة. فمن الأهمية بمكان لوضع الحد الأدنى من الغراء ما هو مطلوب فقط لتغطية موحدة، لأن كمية مفرطة من الغراء قد يقلل من مجال النظر وعرقلة التصوير لاحقة.
ملاحظة: بدلا من مزيج من قضيب معدني (من تحت) وشريحة زجاجية قياسية المجهر (كغطاء) يمكن أن تستخدم لشد البشرة وضمان اقتران البصرية السليم للجمعية 14. ويمكن استخدام اثنين من ورقة مقاطع لإصلاح مخلب بين الزجاج والمعدن شريط السطحية (الشكل 4 - تغطية حلقة مع غطاء المجهر الشريحة (5 مم، الميكروسكوب الالكتروني العلوم).
- المسمار على عصابة التبعي للقضيب معدني جامد التي montaged على المسرح المجهر الآلية.
3. التصوير الداخلي
- في حالة استخدام thy1-YFP-H الفئران، واختيار الجزء الأزرق من مضان مصباح الأطياف لتصور الألياف العصبية. العثور على الأعصاب من الاهتمام في وضع epifluorescence والتركيز على ذلك.
- أكتب إحداثيات مكان للتصوير الطولي. استخدام وسادة الرسغ كنقطة مرجعية. خلال جلسات التصوير التالي، كشف أول لوحة الرسغي ثم تجد نفس المنبع الألياف العصبية الكبيرة والعودة باستخدام الإحداثيات المحفوظة. من الضروري وضع وسادة القدم في نفس اتجاه عمودي على قضيب معدني للحفاظ على نفس النظام المرجعي.
- بدوره على وضع اثنين من الفوتون. للفئران thy1-YFP-H، وهي مناسبة لاستخدام الطول الموجي 950 نانومتر من أشعة الليزرلتصور الألياف العصبية.
- تحديد طول الموجة الليزر والانبعاثات قنوات (450-480 نانومتر للكشف عن الجيل الثاني التوافقي، 520-550 نانومتر لتصوير الأعصاب YFP المسمى و580-630 نانومتر للكشف عن مضان YFP وتألق ذاتي من الشعر)، وتبدأ مع منخفضة الطاقة ليزر (3-5٪) لمنع photodamage والتبييض. الجهد نموذجي على أنابيب مضخم هو 600-700 V لهذا النوع من التصوير.
- تعيين دقة المطلوبة (512 X 512 أو 640 × 640 للمناسبات قياسات سريعة، 800 × 800 أو 1،024 X 1،024 للتصوير الصرفي)، خطوة محورية (1-3 ميكرون)، وسمك من العينة وفترات زمنية (1-10 دقيقة). الوقت هو التعرض بالترتيب من 1 ميللي ثانية لكل بكسل واحد.
- بمناسبة أول الحدود العليا والسفلى من حجم التصوير في البرنامج.
- الحصول على كومة صورة مرجعية للمرجع قبل الآفة. عند الحاجة، فمن الممكن لتسجيل خط الأساس خلال عدة دقائق.
- بعد التصوير نظيفة لوحة بمنديل ووضع الماوس في مربع الانتعاش في 36 درجة مئوية حتى يصبح مستيقظا تماما.
ملاحظة: عادة، ومدة دورة التصوير واحد جنبا إلى جنب مع الليزر التي يسببها الآفة (انظر أدناه) لا يتجاوز 1 ساعة. نوصي التحقق من أن الحيوان هو إفقاد إحساس عميق كل 10-15 دقيقة. هذا لا ينبغي أن تتداخل مع التصوير في حد ذاته ولكن ينبغي النظر في حين من المقرر إجراء التجارب. مدة تأثير جرعة الكيتامين / xylazyne واحدة حوالي 30 إلى 40 دقيقة، وبالتالي فإننا نوصي لتطبيق إضافي ¼ إلى ½ الجرعة بعد 25-30 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن يعتبر كذلك عندما التجريب تخطط أن وتيرة جلسات التصوير للحيوان الفردية يجب أن لا تتجاوز 1 في جلسة 2 أيام لتجنب الآثار السلبية لإعادةpetitive التخدير.
4. الآفة الليزر
- بعد الحصول على إشارة الصورة المكدس، استخدام بروتوكول تبيض لجعل آفة الصغيرة.
- زيادة قوة الليزر إلى 100٪.
- زيادة وقت التعرض ل100-1،000 ميللي ثانية في المنطقة ذات الاهتمام (100-1،000x أكثر من في حالة التصوير قياسي).
- مخطط المنطقة لالآفة.
- جعل الآفة عن طريق التحول على التبييض.
- التبديل إلى وضع التصوير العادي وتواصل مع تسجيلات مرور الزمن.
5. تجهيز وتحليل البيانات
- المضي قدما unmixing الطيفي باستخدام Unmixing المساعد في ImageJ 8 (يواكيم والتر، http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
- فتح الصورة المكدس وتقسيم القنوات.
- العثور على منطقة خالية من الأعصاب أو الشعر لقياسات الخلفية. وضع المنطقة سو الفائدة في هذا المجال.
- مخطط بعناية من جانب الشعر حيث هو التمييز بوضوح بين الأعصاب.
- الخطوط العريضة للالعصبية في جزء من الصورة حيث هو منفصل عن الشعر.
- حفظ unmixing المصفوفة.
- تطبيق قياس مصفوفة unmixing لكومة كله.
- حفظ مداخن صورة جديدة معالجتها في شكل *. TIF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام تقنية الموضحة فمن الممكن أن تتبع نفس الألياف بعد الآفة ودراسة تدهور النهايات العصبية التالفة (الشكل 1). الاستحواذ على كومة مع سمك 120-150 ميكرون هو عادة المناسبة للتصوير متكرر خلال عدة أيام وذلك للحفاظ على الألياف كله في مجال الرؤية.
الآفة عادة يمكن أن تنتج بإيجاز عندما يتم ضبط مواد التعبئة والتغليف البلاستيكية لشد الجلد، لذلك تظهر طبقات الكولاجين مع كثافة موحدة على الصورة (الشكل 2). النهايات العصبية فوق طبقة الكولاجين هي الأكثر ملاءمة لإنتاج الآفة دقيقة.
في حالة عدم بالارض الجلد، قد تحدث الصورة لتكون واضحة (الشكل 3). كثافة في هذا الوضع يمكن أن يكون لا يزال مناسبة للتحقيقات المورفولوجية للألياف العصبية ولكن هذا الإجراء من شأنه الآفة الليزر يتم عرقلة.
الرقم المسار 1. الوقت من تأثير الآفة الليزر على الألياف العصبية كما عرضت القصوى الصور الإسقاط. وتظهر الصور العلوية الألياف قبل ومباشرة بعد الآفة، تظهر اللوحة السفلى نفس الألياف بعد 30 دقيقة و 10 أيام (من اليسار و لوحات اليمين، في المقابل). هناك بعض الهياكل YFP التعبير عن الطبيعة غير العصبية التي تظهر بعد 10 أيام الآفة. ومن المرجح أن تكون الخلايا الكيراتينية التي هي معروفة للتعبير عن الجينات Thy1 عابر في ظل ظروف مؤلمة هذه الهياكل. يظهر مضان YFP من الألياف العصبية باللون الأصفر. سهم يمثل منطقة الآفة. مقياس شريط 30 ميكرون.
/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51045 / 51045fig2.jpg "/>
الشكل 2. القصوى صورة الإسقاط لالنهايات العصبية في منطقة الجلد بالارض. يظهر مضان YFP من الألياف العصبية باللون الأصفر، يظهر جيل التوافقي الثاني من الكولاجين في الزرقاء. شريط النطاق 50 ميكرون.
ويظهر الشكل 3. النهايات العصبية في المنطقة المنحنية من الجلد التي يتم الحصول عليها أقصى ض الإسقاط الضوئية لأقسام متعددة. ومضان YFP من الألياف العصبية وتألق ذاتي من الشعر باللون الأصفر، يظهر جيل التوافقي الثاني من الكولاجين في الزرقاء. شريط النطاق 50 ميكرون.
ftp_upload / 51045 / 51045fig4highres.jpg "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51045 / 51045fig4.jpg "/>
الرقم 4. الإجراء مخلب التثبيت باستخدام شريحة زجاجية المجهر كغطاء. ويرد الشريحة إلى قضيب معدني باستخدام مشابك الورق القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول الفيديو نظهر أسلوب غير الغازية طولية التصوير ثنائي الفوتون من النهايات العصبية واحدة.
يتأثر ديناميات innervations الجلد في أمراض مثل الصدفية والاعتلال العصبي المحيطي 2، والإصابات 9. التصوير ثنائي الفوتون يسمح تحليلا مفصلا لهياكل الألياف العصبية في مصفوفة الكولاجين. استخدام الفئران المعدلة وراثيا مراسل يساعد على تجنب المشاكل المتعلقة تلطيخ من الألياف العصبية. يبدو Thy1-YFP-H السلالة أن تكون قوية بما فيه الكفاية لتحليل البيانات المورفولوجية 10 في حين قد توفر الفئران Thy1-mitoCFP فرصة وظيفية للدراسات ديناميات الميتوكوندريا في الألياف العصبية 11. خط YFP 16 / ICR يمكن استخدامها لمراقبة الهيئات ميسنر 12. قد يكون نهج بديل الحقن الفيروسية في عقدة الجذر الظهري لتتبع انتقائية من السكان العصبية محددة13.
يجدر بالذكر أن إنتاج الآفة انتقائية داخل المصفوفة الكولاجين وأعاقت بشدة بالمقارنة مع الطبقات العليا من الجلد. هذا هو السبب في بعض الأحيان مرات التعرض للتشريح الألياف العصبية يمكن أن تختلف بقدر عشرة أضعاف في حين أن كثافة مضان للتصوير تختلف على نطاق 10-20٪. للحفاظ على نوعية جيدة من الصورة الغمر اقتران ثابت لابد من الاحتفاظ بها.
القرار من الصورة تعتمد عادة على سرعة مرغوبة الشراء. الوقت النموذجي لإنتاج 30 كومة frames- مع القرار 800 × 800 بكسل هو 1 دقيقة، لذلك يمكن للمرء أن يقلل من قرار أو سمك منطقة المصورة للكشف عن التغيرات السريعة أو زيادة دقة لميزات المورفولوجية غرامة الدراسات.
وينبغي أن يكون التثبيت من قاطع الطريق ضيق لا يكفي للسماح للانجراف من الصورة، ولكن في نفس الوقت يجب أن لا تؤثر على الدورة الدموية في رانه الجلد. لتعظيم الاستفادة من هذا الإجراء، حقن الأوعية الدموية استشفاف (على سبيل المثال، وصفت TexasRed 70 كيلو دالتون ديكستران) ممكنة، مما يسمح احد لضبط المواد البلاستيكية التعبئة والتغليف الضغط عبر مراقبة تدفق الدم. من غير المرجح الحركة الفنية في إعداد وصفها في هذا البروتوكول لأن الحيوان مخدرة بعمق، ويرد مخلب نفسها بقوة على الجمعية التثبيت، ولأن ضربات القلب وحركة التنفس لا تنتقل مباشرة إلى مخلب. ومع ذلك، تحركات طفيفة ممكنة خصوصا إذا تم إجراء التصوير تضخم عالية. في هذه الحالة يمكن أن نوصي باستخدام الإضافات يماغيج تهدف إلى تعويض الحركة الفنية.
ويمكن تحقيق التصوير المتكرر لنفس المنطقة باستخدام هذه النقاط المرجعية وسادة الرسغي 14، أو في حالة حقن بعض المواد في قاطع الطريق بقعة من الحقن يمكن أن تكون معلما 6. والاحتمال الاخر هو الوشم من الجلد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر Neurotar المحدودة للمساعدة التقنية، ومؤسسة CIMO وFGSN للحصول على الدعم المالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2 mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight) | |
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1 ml | BD | 300013 | |
| 30 G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchased from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water immersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2 W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J.
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton's interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O'Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Rasband, W.S., ImageJ. , US National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
Tags
علم الأعصاب، العدد 90، multiphoton المجهري، النهايات العصبية، الآفة، خاصتك-1 المروج،Erratum
Formal Correction: Erratum: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014.
Citeable Link.
A correction was made to In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin.
Leonard Khiroug was removed as an author.
