In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid

Summary

Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.

Abstract

Zenuwuiteinden in de huid zijn betrokken bij fysiologische processen zoals sensing ¹ als in pathologische processen zoals neuropathische pijn ^2. Hun dicht-bij-oppervlak positionering vergemakkelijkt microscopische beeldvorming van de huid zenuwuiteinden in levende intacte dier. Met multifoton microscopie, is het mogelijk om fijne beelden overwinnen het probleem van sterke lichtverstrooiing van het huidweefsel te verkrijgen. Reporter transgene muizen die EYFP expressie onder de controle van Thy-1 promoter in neuronen (inclusief omtrek sensorische neuronen) zijn zeer geschikt voor de longitudinale studies van afzonderlijke zenuwuiteinden gedurende langere tijd tot enkele maanden of zelfs levenslang. Bovendien, met dezelfde femtoseconde laser als voor de beeldvorming, is het mogelijk een selectieve laesies van zenuwvezels te produceren voor de studies van de herstructurering zenuwvezel. Hier presenteren we een eenvoudige en betrouwbare protocol lengterichting multifoton in vivo beeldvorming enlaser gebaseerde microchirurgie op de huid van muizen zenuwuiteinden.

Introduction

Cutane zenuwuiteinden ondergaan dynamische veranderingen onder verschillende pathofysiologische toestanden. Zenuwvezels kan gaan door het proces van degeneratie en regeneratie of herstructurering in de loop van ziektes zoals perifere neuropathie ² of Morton's neuroom ^3. Na traumatisch letsel, een belangrijk onderdeel van zenuwuiteinden dynamiek huid reinnervation van het beschadigde gebied. Echter, de gemeenschappelijke aanpak voor het onderzoek van de zenuwuiteinden is ex vivo histologische coupes die real-time informatie over de lopende processen ⁴ ontbreekt. Gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente markers, is het mogelijk om de zenuwuiteinden te volgen in de huid van levende dieren, waardoor rijke en significant meer relevante informatie over de structurele veranderingen verkrijgen. Het onderzoek van cutane zenuwuiteinden kan via conventionele fluorescentiemicroscopie echter sterke lichtverstrooiing van het huidweefsel sterk ondermijnd de kwaliteitvan de verkregen gegevens ^5. Multifoton microscopie maakt acquisitie van beelden met hoge resolutie in de sterk verstrooiende weefsel als gevolg van de niet-lineaire som van de energie van fotonen excitatie resulteert in emissie van fluorescentie alleen het brandpunt van het objectief. Dit effect leidt tot een sterke toename van de penetratiediepte en de verbetering van de signaal-ruisverhouding van de meting huidweefsels ^6. Met dezelfde laser als voor beeldvorming, is het mogelijk om selectieve ontleding van de zenuwvezels ⁷ produceren. In het volgende protocol tonen we de werkwijze longitudinale beeldvorming van cutane zenuwuiteinden in vivo in reporter transgene muizen gecombineerd met selectieve laser laesie in de handel verkrijgbare multifoton microscoop systeem.

Protocol

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de National Animal Experiment Board, Finland.

1 Animal Voorbereiding voor Imaging

1. Verdoven een muis door intraperitional (IP) injectie van ketamine (0.08 mg per kg lichaamsgewicht) en xylazine (0,01 mg per kg lichaamsgewicht). Controleer de anesthesie met de achterste teen knijpen reflex.
2. Dompel de ogen dier in oogdruppels (Viscotears) om de ogen te beschermen tegen uitdroging.
3. Plaats de muis op een verwarmingselement (Supertech) bij 37 ° C om onderkoeling te voorkomen.
4. Reinig de aangewezen voor beeldvorming met 70% ethanol voetzool.
5. Voeg een druppel water op de huid van de voet pad voor het elektrisch koppelen tussen de huid en dekglas.
6. Leg plastic verpakkingsmateriaal onder de achterpoot die is gepositioneerd onder een metalen ring met deksel klasse.
7. Pas de dikte van de kunststof verpakkingsmateriaal de huid plat.
8. Doe een druppel water op de cover glass voor onderdompeling tussen dekking van glas en de doelstelling.

2 Metal Fixator Ring Voorbereiding

1. Voor de stabilisatie van de huid gebruik de metalen fixator. Wij gebruiken Gemeenschapsmodel beschermd tweevleugelige fixator met een metalen ring (met dank aan Neurotar Ltd, Finland). Vul de spuit met superlijm, zet de kleine druppel superlijm door de naald op de ring en zachtjes verspreid de lijm voor een uniforme dekking van de ring oppervlak. Het is cruciaal om de minimale hoeveelheid lijm die nodig is alleen uniforme dekking gebracht, vanwege overmatige hoeveelheid lijm het gebied van het zicht kan verminderen of belemmeren latere beeldvorming.
   Opmerking: Als alternatief kan de combinatie van een metalen staaf (van onder) en standaard microscoop glaasje (als cover) kunnen worden gebruikt om de huid plat en goede optische koppeling van het samenstel ¹⁴ te waarborgen. Twee paperclips kunnen worden gebruikt om de poot tussen glas en metaal staaf vast oppervlak (figuur 4
2. Bedek de ring met microscoop cover slide (5 mm diameter, Electron Microscopy Science).
3. Schroef de ring fixator aan de stijve metalen staaf die wordt montaged op de gemotoriseerde microscoop podium.

3 Imaging Procedure

1. In het geval van het gebruik van thy1-YFP-H muizen, kiest het blauwe deel van fluorescentie lamp spectra om zenuwvezels te visualiseren. Vind de zenuw van belang in epifluorescentie- modus en de focus op het.
2. Noteer de coördinaten van een plek voor longitudinale beeldvorming. Gebruik een carpaal pad als een referentiepunt. Tijdens de volgende beeldvormende sessies, detecteren eerst de carpale pad en vinden dan dezelfde upstream grote zenuwvezels en terug te gaan met behulp van de opgeslagen coördinaten. Het is essentieel om de voet pad in dezelfde richting positioneren loodrecht op de metalen staaf hetzelfde referentiesysteem houden.
3. Zet de twee-foton mode. Voor de thy1-YFP-H muizen, is het geschikt om de 950 nm golflengte van laserstraling gebruikende zenuwvezels visualiseren.
4. Selecteer laser golflengte en emissie-kanalen (450-480 nm voor de tweede harmonische generatie detectie, 520-550 nm voor de beeldvorming van YFP-gelabeld zenuwen en 580-630 nm voor de detectie van YFP fluorescentie en autofluorescentie van het haar), te beginnen met laag laservermogen (3-5%) om photodamage en bleken voorkomen. De typische spanning op de fotovermenigvuldigingsbuizen is 600-700 V voor dergelijke beeldvorming.
5. Stel de gewenste resolutie (512 x 512 of 640 x 640 voor een snelle gebeurtenissen metingen, 800 x 800 of 1.024 x 1.024 voor morfologische beeldvorming), axiale stap (1-3 micrometer), dikte van het monster en de tijdsintervallen (1-10 min). De belichtingstijd in de orde van 1 msec per een pixel.
6. Markeer eerst de bovenste en onderste grenzen van het beeldvolume in de software.
7. Het verwerven van de afbeelding verwijzing stapel voor de verwijzing vóór de laesie. Indien nodig is het mogelijk de basislijn te nemen gedurende enkele minuten.
8. Na de beeldvorming van de pad schoon met een tissue en zet de muis in een doos herstel bij 36 ° C totdat het helemaal wakker.
   OPMERKING: Meestal de duur van een opnamesessie gecombineerd met laser geïnduceerde laesies (zie hieronder) niet meer dan 1 uur. We raden te gaan of het dier is diep verdoofd elke 10-15 min; dit moet niet bemoeien met zichzelf afbeelden, maar moeten worden beschouwd, terwijl de experimentele ingreep gepland. De duur van het effect van een ketamine / xylazyne dosis ongeveer 30 tot 40 minuten, dus raadzaam toepassen extra ¼ dosis ½ na 25-30 min.
   OPMERKING: Het moet ook worden overwogen wanneer de experimenten is van plan dat de frequentie van imaging-sessies voor een bepaald dier niet meer dan 1 sessie per 2 dagen om schadelijke effecten van re voorkomencompetitieve anesthesie.

4 Laser laesie

1. Na het verwerven van de referentie-afbeelding stapel, gebruikt u het bleken protocol om een ​​micro-laesie te maken.
2. Verhoog de laservermogen tot 100%.
3. Verhoog de belichtingstijd tot 100-1000 msec per regio van belang (100-1,000x meer dan in het geval van standaard imaging).
4. Een overzicht van de omgeving voor de laesie.
5. Voeg de laesie door het inschakelen van het bleken.
6. Ga terug naar de normale weergave modus en ga verder met time-lapse-opnamen.

5 Data Processing and Analysis

1. Doorgaan met unmixing met Spectral componenten voor elke pixel plugin in ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Open de afbeelding stack en splitsing van de kanalen.
3. Zoek het gebied vrij is van de zenuwen of haar voor de achtergrond metingen. Zet een gebied of interesse in dat gebied.
4. Schets voorzichtig het gedeelte van het haar wanneer het duidelijk van de zenuwen.
5. Overzicht van de zenuw in het deel van het beeld waar het gescheiden van het haar.
6. Spaar ontmenging matrix.
7. Solliciteer gemeten unmixing matrix voor de hele stapel.
8. Sla de nieuwe bewerkte beeld stapels in * tif-formaat.

Representative Results

Met de beschreven techniek is het mogelijk om dezelfde vezel na de laesie te volgen en om de afbraak van de beschadigde zenuwuiteinden (figuur 1) te bestuderen. Verwerving van de stapel met de dikte van 120-150 urn gewoonlijk juist voor de repetitieve beeldvorming gedurende verscheidene dagen om de gehele vezel in het gezichtsveld behouden.

De laesie kan typisch beknopt worden geproduceerd wanneer de kunststof verpakkingsmateriaal wordt aangepast aan de huid plat, zodat de collageenlagen weergegeven uniforme intensiteit van het beeld (figuur 2). De zenuwuiteinden boven de collageenlaag het meest geschikt zijn om de precieze laesie te produceren.

In het geval dat de huid niet afgeplat, kan het beeld ontstaan ​​aan wazig (figuur 3). De intensiteit in deze situatie kan nog steeds geschikt voor morfologische onderzoek van de zenuwvezels, maar de laser laesie procedure zou zijn worden belemmerd.

Figuur 1 Time spoor van het effect van laser laesie op de zenuwvezel gepresenteerd als maximale projectie beelden. De bovenste beelden tonen de vezel vóór en direct na het letsel, het onderste paneel toont dezelfde vezel na 30 min en 10 dagen (links en rechts panelen, navenant). Er zijn enkele YFP expressie structuren van niet-neuronale aard die worden weergegeven 10 dagen na de laesie. Deze structuren zullen waarschijnlijk keratinocyten waarvan bekend is dat Thy1 gen transiënt tot expressie onder traumatische omstandigheden. De YFP fluorescentie van zenuwvezels wordt getoond in het geel. Een pijl markeert het gebied van de laesie. Schaalbalk 30 micrometer.

/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "src =" / files / ftp_upload / 51045 / 51045fig2.jpg "/>
Image Figuur 2 Maximale projectie voor zenuwuiteinden in afgeplatte huid. De YFP fluorescentie van zenuwvezels wordt getoond in het geel, is de tweede harmonische generatie van het collageen in blauw weergegeven. Schaalbalk 50 micrometer.

Figuur 3 De zenuwuiteinden in het gebogen gebied van het verkregen ten hoogste z-projectie op meerdere optische secties huid. Het YFP fluorescentie van zenuwvezels en autofluorescentie van het haar wordt getoond in geel, is de tweede harmonische generatie van het collageen weergegeven in het blauw. Schaalbalk 50 micrometer.

ftp_upload / 51045 / 51045fig4highres.jpg "src =" / files / ftp_upload / 51045 / 51045fig4.jpg "/>
Figuur 4 De poot fixatie procedure met behulp van de microscoop glasplaatje als dekmantel. De glijbaan aan de metalen staaf met behulp van standaard paperclips is bevestigd.

Discussion

In deze video protocol tonen we de werkwijze voor niet-invasieve longitudinale twee-foton beeldvorming van enkele zenuwuiteinden.

De dynamiek van de huid innervaties wordt beïnvloed in dergelijke ziekten als psoriasis en perifere neuropathie ^2, en in traumatische verwondingen ^9. Twee-foton beeldvorming maakt een gedetailleerde analyse van de zenuwvezels structuren in collageen matrix. Het gebruik van transgene reporter muizen helpt om de problemen met de kleuring van de zenuwvezels voorkomen. Thy1-YFP-H stam lijkt robuust genoeg voor morfologische data-analyse ¹⁰ te zijn terwijl de Thy1-mitoCFP muizen een kans van functionele studies van mitochondriale dynamiek in de zenuwvezels ¹¹ kunnen voorzien. De YFP-16 / ICR lijn kan worden gebruikt voor de waarneming van Meissner organen ^12. De alternatieve benadering kan de virale injectie in de dorsale wortel ganglion voor de selectieve volgen van specifieke neuronale populaties13.

Zij er op gewezen dat de productie van selectieve laesie binnen het collageen matrix sterk gehinderd in relatie tot de bovenste lagen van de huid. Daarom soms blootstellingstijden voor de dissectie van zenuwvezels kunnen verschillen zoveel tienvoudige terwijl de intensiteit van de fluorescentie voor de beeldvorming afwijkt van het bereik van 10-20%. Om een ​​goede kwaliteit van het beeld de constante onderdompeling koppeling voorzien wordt bewaard.

De resolutie van het beeld hangt meestal af van de gewenste snelheid van de overname. Typische tijd voor de productie van een 30 frames- stack met een resolutie van 800 x 800 pixels is 1 min, zodat men de resolutie of de dikte van het belichte gebied om snel veranderingen te detecteren of te verhogen resolutie voor fijne morfologische kenmerken onderzoeken kunnen afnemen.

Fixatie van de voetzool moet strak genoeg de drift van het beeld niet toe te staan, maar tegelijkertijd het niet ten koste mag gaan van de bloedcirculatie in thij skin. Voor optimalisatie van de procedure injecties bloedvaten tracers (bijvoorbeeld TexasRed gemerkte 70 kDa dextran) mogelijk, zodat men de kunststof verpakkingsmateriaal af te stellen via controle van de bloedstroom. Bewegingsartefacten in de in dit protocol beschreven preparaat zijn onwaarschijnlijk omdat het dier is diep verdoofd, wordt de poot zelf stevig aan de fixatie assemblage, en omdat de hartslag en de ademhaling beweging zijn niet direct aan de poot doorgegeven. Echter, kleine bewegingen mogelijk vooral als hoge vergroting beeldvorming wordt uitgevoerd. In dit geval kunnen we raden het gebruik van ImageJ plugins ontwikkeld om bewegingsartefacten te compenseren.

Het repetitieve beeldvorming van hetzelfde gebied kan worden bereikt door bijvoorbeeld referentiepunten carpaal pad ^14, of bij injectie van bepaalde stoffen in de voetzool de plaats van injectie kan dienen als landmark ^6. De andere mogelijkheid is tatoeëren van de huid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782