In Vivo to-foton mikroskopi av Enkeltnerveender i hud

Summary

Protokollen for dynamisk lengde bildebehandling og selektiv laser lesjon av nerveender i reporter transgene mus er presentert.

Abstract

Nerveendene i huden er involvert i fysiologiske prosesser slik som å avføle ¹ samt i patologiske prosesser så som nevropatisk smerte ^2. Deres nær-til-overflate posisjonering forenkler mikroskopisk avbildning av huden nerveender i levende intakt dyr. Ved hjelp multiphoton mikroskopi, er det mulig å oppnå gode bilder overvinne problemet med sterk lysspredning av hudvev. Reporter transgene mus som uttrykker EYFP under kontroll av Thy-en promoter i nevroner (inkludert periferien sensoriske nevroner) er godt egnet for de langsgående studier av individuelle nerveender over lengre perioder opptil flere måneder eller til og med livslang. Videre, ved bruk av samme femtosekund laser som for avbildning, er det mulig å produsere meget selektive lesjoner av nervefibre for de studier av nervefiber omstilling. Her presenterer vi en enkel og pålitelig protokoll for langsgående multiphoton in vivo avbildning oglaser-baserte mikrokirurgi på mus huden nerveender.

Introduction

Kutane nerveender gjennomgå dynamiske endringene under forskjellige patofysiologiske tilstander. Nervefibre kan gå gjennom prosessen med degenerasjon og regenerasjon eller restrukturering i løpet av slike sykdommer som perifer neuropati ² eller Mortons neuroma ^tre. Etter traumatisk skade, en viktig del av nerve avslutninger dynamikk i huden er reinnervation av det skadede området. Imidlertid er det felles tilnærming for undersøkelse av nerveender ex vivo histologisk seksjonering som mangler sanntidsinformasjon om de pågående prosessene ^fire. Ved hjelp av genetisk kodede fluorescerende markører, er det mulig å spore de nerveender i huden til levende dyr, for således å oppnå rik og betydelig mer relevant informasjon om strukturendring. Etterforskningen av kutane nerveender er mulig ved hjelp av konvensjonelle fluorescerende mikroskopi, men undergraver den sterke lysspredning av huden vev sterkt kvalitetenav dataene ervervet ^fem. Multiphoton mikroskopi tillater kjøp av høyoppløselige bilder i sterkt spredning vev på grunn av den ikke-lineære summering av energien eksiteringslys fotoner som resulterer i utslipp av fluorescens bare fra det sentrale punktet i målet. Denne effekten fører til en sterk økning av inntrengningsdybde og forbedring av signal-til-støy-forholdet for måle i hudvevet ^6. Ved hjelp av den samme laser som for avbildning, er det mulig å produsere selektiv disseksjon av nervefibre ^7. I den følgende protokoll viser vi fremgangsmåte for langsgående avbildning av kutane nerveender in vivo i transgene mus reporter kombinert med selektiv laser lesjon ved hjelp av kommersielt tilgjengelig multiphoton mikroskopsystem.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyr fag er godkjent av forsøksdyr Experiment Board, Finland.

1. Animal Forberedelse til Imaging

1. Bedøve en mus ved intraperitional (IP) injeksjon av ketamin (0,08 mg pr kroppsvekt) og xylazin (0,01 mg pr kroppsvekt). Sjekk anestesi med den bakre tå klype refleks.
2. Fordyp dyrets øyne i øyedråper (Viscotears) for å beskytte øynene mot dehydrering.
3. Sett musen på en varmepute (Supertech) ved 37 ° C for å unngå nedkjøling.
4. Rengjør foten pad utpekt for bildebehandling med 70% etanol.
5. Tilsett en dråpe vann på huden på foten pad for nedsenking kopling mellom huden og dekkglass.
6. Sett plastemballasje materiale under bakpoten som er plassert under en metallring med lokk klasse.
7. Juster tykkelsen på plastpakningsmateriale for å flate huden.
8. Ta en dråpe vann på dekkglasss for nedsenking mellom dekkglass og målet.

2. Metal Fixator Ring Forberedelse

1. For stabilisering av huden utnytte metallet feste-midler. Vi bruker Community Design beskyttet to-fløyen fixator med en metallring (courtesy of Neurotar Ltd, Finland). Fyll sprøyten med superlim, sette liten dråpe superlim gjennom nålen på ringen og forsiktig spre lim for jevn dekning av ringen overflaten. Det er kritisk for å sette den minimale mengden av lim som er nødvendig kun for jevn dekning, fordi overdreven mengde lim kan redusere feltet over visningen og hindrer etterfølgende avbildning.
   MERK: Alternativt kan kombinasjonen av en metallstang (nedenfra) og standard mikroskop objektglass (som et dekke) kunne brukes til å flate ut på huden og for å sikre riktig optisk kopling av sammenstillingen ^14. To binderser kunne brukes til å feste labben mellom glass og metall bar overflate (Figur 4
2. Dekk ring med mikroskop deksel lysbilde (5 mm diameter, Elektronmikros Science).
3. Skru på ringen fixator til stiv metallstang som er montaged på motoriserte mikroskop scenen.

3. Imaging Prosedyre

1. I tilfelle du bruker thy1-YFP-H mus, velger den blå delen av fluorescens lampe spektra å visualisere nervefibre. Finn nerve av interesse i epifluorescence modus og fokusere på det.
2. Skriv ned koordinatene til et sted for langsgående bildebehandling. Bruk en carpal pad som et referansepunkt. I de følgende bilde økter, oppdage først carpal pad og deretter finne de samme oppstrøms store nervefibre og gå tilbake ved hjelp av lagrede koordinater. Det er viktig å plassere foten puten i samme retning vinkelrett på metallstangen for å holde det samme systemet for referanse.
3. Slå på to-foton-modus. For thy1-YFP-H mus, er det egnet til å bruke 950 nm bølgelengde av laserstrålingå visualisere nervefibrene.
4. Velg laser bølgelengde og utslipps kanaler (450-480 nm for andre harmoniske generasjon deteksjon, 520-550 nm for avbildning av YFP-merket nerver og 580-630 nm for påvisning av YFP fluorescens og autofluorescence av håret), start med lav lasereffekt (3-5%) for å hindre photodamage og bleking. Den typiske spenning på fotomultiplikatorrør er 600 til 700 V for denne type avbildning.
5. Still inn ønsket oppløsning (512 x 512 eller 640 x 640 for raske hendelser målinger, 800 x 800 eller 1024 x 1024 for morfologisk imaging), aksial trinn (1-3 mm), tykkelsen på prøven og tidsintervaller (1-10 min). Den eksponeringstiden er i størrelsesorden av en millisekunder pr en piksel.
6. Først markere de øvre og nedre grenser av avbildningsvolum i programvaren.
7. Erverve referansebildet stabelen for referanse før lesjonen. Ved behov er det mulig å ta opp grunnlinjen i løpet av flere minutter.
8. Etter bildebehandling ren puten med en vev og sette musen i en recovery-boksen ved 36 ° C til den er helt våken.
   MERK: Vanligvis er varigheten av en avbildningssesjon i kombinasjon med laser indusert lesjon (se nedenfor) ikke overstiger 1 time. Vi anbefaler å verifisere at dyret er dypt bedøvet hver 10-15 min; dette skal ikke forstyrre bildebehandling seg selv, men bør vurderes mens eksperimentell prosedyre er planlagt. Varigheten av effekten av en enkelt ketamin / xylazyne dose er rundt 30 til 40 min, derfor anbefaler vi å bruke ytterligere ¼ til ½ dose etter 25-30 min.
   MERK: Det bør vurderes som godt når eksperimentering planlegger at hyppigheten av bildebehandlings økter for en individuell dyr ikke skal overstige 1 økt per to dager for å unngå uheldige effekter av redyktig anestesi.

4. Laser lesjon

1. Etter å skaffe referansebildet stack, bruker bleking protokollen til å lage en mikro lesjon.
2. Øke lasereffekten til 100%.
3. Øke eksponeringstiden til 100-1,000 msek pr region av interesse (100-1,000x mer enn i tilfelle av standard imaging).
4. Skissere området for lesjonen.
5. Gjør lesjonen ved å slå på bleking.
6. Bytt tilbake til den vanlige bildemodus og fortsette med intervallopptak.

5. databehandling og analyse

1. Fortsett med unmixing bruker Spectral Unmixing plugin i ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Åpne bildestakk og splitte kanalene.
3. Finn området fritt for nerver eller hår for bakgrunnen målinger. Sett en region of interesse for dette området.
4. Outline nøye den delen av håret hvor det er lett å skille fra nervene.
5. Outline nerve i den delen av bildet, der den er adskilt fra håret.
6. Lagre unmixing matrise.
7. Påfør målte unmixing matrise for hele stabelen.
8. Lagre de nye behandlet bildestakker i * TIF format.

Representative Results

Ved hjelp av den beskrevne teknikk er det mulig å spore den samme fiber etter lesjonen, og for å studere nedbrytning av de skadede nerveender (figur 1). Kjøp av stabelen med tykkelse på 120-150 mikrometer er vanligvis passende for den repeterende avbildning i flere dager for å holde hele fiber i synsfeltet.

Lesjonen kan vanligvis bli produsert konsist når plastinnpakningsmateriale er justert for å flate ut huden, slik at kollagen lagene virker med ensartet intensitet på bildet (figur 2). De nerveender ovenfor kollagen sjikt er mest egnet for å produsere den nøyaktige lesjonen.

I tilfelle huden ikke er flat, kan bildet oppstå å bli uskarp (figur 3). Intensiteten i denne situasjonen kan fremdeles være egnet for morfologiske undersøkelser av nervetrådene, men lasers lesjon prosedyren ville bli hindret.

Figur 1. Tids spor av effekten av laser lesjon på nervefiber fremstilt som maksimal projeksjon av bilder. Øvre bildene viser fiberen før og direkte etter lesjonen, viser det nedre panel samme fiber etter 30 min og 10 dager (til venstre og høyre panel, på tilsvarende måte). Det er noen YFP uttrykker strukturer av ikke-nevronale natur som vises 10 dager etter lesjon. Disse strukturene er sannsynlig å være keratinocytter som er kjent for å uttrykke Thy1 genet forbigående etter traumatiske forhold. YFP fluorescens av nervefibre er vist i gult. En pil markerer det område av lesjonen. Scale bar 30 mikrometer.

/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "src =" / filer / Ftp_upload / 51045 / 51045fig2.jpg "/>
Figur 2. Maksimum projeksjon bildet for nerveender i flat hudområdet. YFP fluorescens av nervefibre er vist i gult, er den andre harmoniske generasjon av kollagen vist i blått. Scale bar 50 mikrometer.

Figur 3. Den nerveender i det buede området av huden erholdt som en maksimal z-anslag for flere optiske seksjoner. YFP fluorescensen av nervefibre og autofluorescens av hår er vist i gult, er den andre harmoniske generering av kollagen er vist i blått. Scale bar 50 mikrometer.

Ftp_upload / 51045 / 51045fig4highres.jpg "src =" / filer / Ftp_upload / 51045 / 51045fig4.jpg "/>
Figur 4. pote fiksering prosedyren ved hjelp av mikroskop objektglass som et dekke. Sleiden er festet til metallstangen ved hjelp av standard binders.

Discussion

I dette video protokollen demonstrerer vi fremgangsmåten for ikke-invasiv langsgående to-foton avbildning av enkelt-nerveender.

Dynamikken i hud innervations påvirkes i slike sykdommer som psoriasis og perifer neuropati ^2, og i traumatiske skader ^ni. To-foton avbildning tillater detaljert analyse av nervefibrene strukturer i kollagenmatriksen. Bruken av transgene rapportør mus bidrar til å unngå de problemene som angår farging av nervefibrene. Thy1-YFP-H belastning synes å være tilstrekkelig robust for morfologisk dataanalyse ¹⁰ mens Thy1-mitoCFP mus kan gi en mulighet for funksjonelle studier av mitokondrie dynamikk i nervefibrene ^11. Den YFP-16 / ICR linjen kan brukes til observasjon av Meissner legemer ^12. Den alternativ tilnærming kan være viral injeksjon i rygg rotganglion for selektiv sporing av spesifikke nevronale populasjoner13.

Det er verdt å merke seg at produksjonen av selektiv lesjon innenfor kollagen matrise er sterkt hindret i forhold til de øvre lag av huden. Det er derfor noen ganger eksponeringstider for disseksjon av nervefibre kan avvike så mye som ti ganger mens intensiteten av fluorescensen for avbildnings forskjellig på størrelsesorden 10-20%. For å opprettholde god kvalitet av bildet konstant el-koblingen må holdes.

Oppløsningen på bildet avhenger vanligvis på ønskelig hastighet på kjøpet. Typisk tid for fremstilling av en 30 frames- stabel med oppløsning 800 x 800 piksler er 1 minutt, slik at man kan senke oppløsningen eller tykkelsen av bildepåførte området for å detektere raske endringer eller øke oppløsningen for fine morfologiske egenskaper studier.

Fiksering av fotpute skal være tett nok til ikke å tillate drift av bildet, men på samme tid bør det ikke påvirker blodsirkulasjonen i than huden. For optimalisering av fremgangsmåten, injeksjoner av blodkar sporstoff (for eksempel TexasRed merket 70 kDa dekstran) er mulig, slik at en for å justere plastemballasje materialtrykket via overvåkning av blodstrømmen. Bevegelsesartefakter ved fremstillingen er beskrevet i denne protokollen er usannsynlig fordi dyret er dypt bedøvet, er poten seg fast festet til festeenheten, og fordi hjerteslag og åndedrett bevegelse ikke blir overført direkte til labben. Imidlertid, små bevegelser er mulig, spesielt dersom høy forstørrelse avbildning utføres. I dette tilfellet kan vi anbefale å bruke ImageJ plugins utviklet for å kompensere bevegelsesartefakter.

Den repeterende avbildning av det samme område kan oppnås ved anvendelse av slike referansepunkter som carpal puten ^14, og i tilfelle av injeksjon av enkelte stoffer i fotpute stedet for injeksjon kan tjene som et fjell ^6.. Den andre muligheten er tatovering av huden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782