In Vivo to-foton mikroskopi af Single nerveender i hud

Summary

Protokollen til dynamisk langsgående billeddannelse og selektiv laser læsion af nerveender i reporter transgene mus præsenteres.

Abstract

Nerveender i huden er involveret i fysiologiske processer, såsom sensing ^1, samt i patologiske processer såsom neuropatisk smerte ^2. Deres tæt på overfladen positionering letter mikroskopisk billeddannelse af hudens nerveender i levende intakt dyr. Brug multifoton mikroskopi, er det muligt at opnå fine billeder overvinde problemet med stærk lysspredning af hudvævet. Reporter transgene mus, der udtrykker EYFP under kontrol af Thy-1-promotoren i neuroner (herunder periferien sensoriske neuroner) er velegnede til de langsgående undersøgelser af individuelle nerveender over længere perioder på op til flere måneder eller endda livslang. Desuden, ved hjælp af den samme femtosecond laser som til billeddannelse, er det muligt at fremstille yderst selektive læsioner af nervefibre for undersøgelser af omstrukturering nervefibrene. Her præsenterer vi en enkel og pålidelig protokol for langsgående multiphoton in vivo billeddannelse oglaserbaseret mikrokirurgi på musen hud nerveender.

Introduction

Kutane nerveender gennemgår dynamiske forandringer under forskellige patofysiologiske tilstande. Nervefibre kan gå gennem processen med degeneration og regeneration eller omstrukturering i løbet af sådanne sygdomme som perifer neuropati ² eller Mortons neuroma ^3. Efter traumatisk skade, en vigtig del af nerveender dynamik i huden er reinnervation af det beskadigede område. Men den fælles tilgang til undersøgelse af nerveender er ex vivo histologiske sektionering, der mangler oplysninger i realtid om de igangværende processer ^4. Brug genetisk indkodede fluorescerende markører, er det muligt at spore de nerveender i huden på levende dyr, og dermed opnå rig og betydeligt mere relevante oplysninger om de strukturelle ændringer. Undersøgelsen af ​​kutane nerveender er muligt under anvendelse af konventionel fluorescensmikroskopi imidlertid stærk lysspredning af hudvævet kraftigt underminerer kvalitetenaf de data, der er erhvervet ^5. Multiphoton mikroskopi tillader erhvervelse af billeder i høj opløsning i stærkt spredende væv på grund af den ikke-lineære opsummering af energi excitationslyset fotoner resulterer i emission af fluorescens kun fra brændpunktet af målet. Denne effekt fører til en solid stigning i indtrængningsdybden og forbedring af signal-støj-forholdet for måling i hudvævet ^6. Anvendelse af den samme laser som til billeddannelse, er det muligt at fremstille selektiv dissektion af nervefibre ^7. I den følgende protokol viser vi metode langsgående afbildning af kutane nerveender i vivo i reporter transgene mus kombineret med selektiv laser læsion under anvendelse af kommercielt tilgængelige multifoton mikroskopsystem.

Protocol

Procedurer, der involverer dyreindivider er blevet godkendt af den nationale dyreforsøg Board, Finland.

1. Animalske Forberedelse til Imaging

1. Bedøver en mus ved intraperitional (IP) injektion af ketamin (0,08 mg pr legemsvægt) og xylazin (0,01 mg pr legemsvægt). Kontroller anæstesi med den bageste tå knivspids refleks.
2. Fordyb dyrets øjne i øjendråber (Viscotears) for at beskytte øjnene mod dehydrering.
3. Sæt musen på en varmepude (Supertech) ved 37 ° C for at forhindre hypotermi.
4. Rengør trædepuden udpeget til billeddannelse med 70% ethanol.
5. Tilføj en dråbe vand på huden af ​​trædepuden for nedsænkning kobling mellem hud og dækglas.
6. Put plastemballage materiale under bagpoten, der er placeret under en metalring med låg klasse.
7. Juster tykkelsen af ​​plastemballage materiale flade huden.
8. Put en dråbe vand på dækslet glass for fordybelse mellem dækglas og målsætningen.

2. Metal fixator Ring Forberedelse

1. Til stabilisering af huden udnytte metal fiksator. Vi bruger EF-design-beskyttede to-fløj fiksator med en metalring (høflighed af Neurotar Ltd, Finland). Fyld sprøjten med superlim, satte lille dråbe superlim gennem nålen på ringen og forsigtigt sprede lim til ensartet dækning af ringen overflade. Det er afgørende at sætte minimal mængde lim, der kun er brug for en ensartet dækning, fordi overdreven mængde lim kan reducere området for visningen og hindrer efterfølgende billedbehandling.
   BEMÆRK: Alternativt kombinationen af en metalstang (fra neden) og standard mikroskop objektglas (som et dæksel) kan anvendes til at flade huden og til at sikre en korrekt optisk kobling af samlingen ^14. To clips kan anvendes til at fastsætte pote mellem glas og metal bar overflade (figur 4
2. Dæk ring med mikroskop dækglas (5 mm i diameter, Electron Microscopy Science).
3. Skru ringen fiksator til den stive metalstang, der er montagetekst på den motoriserede mikroskop scenen.

3. imagografiproceduren

1. I tilfælde af at bruge Thy1-YFP-H-mus, skal du vælge den blå del af fluorescens lampe spektre at visualisere nervefibre. Find nerven interesse i epifluorescens mode og fokusere på det.
2. Skriv ned koordinaterne for en stedet for langsgående billeddannelse. Brug en carpal pad som referencepunkt. I de følgende billeddiagnostiske sessioner, opdage først carpal pad og derefter finde de samme opstrøms store nervefibre og gå tilbage ved hjælp af de gemte koordinater. Det er vigtigt at placere foden puden i samme retning vinkelret på metalstangen at holde den samme referencesystem.
3. Tænd for to-foton-tilstand. For Thy1-YFP-H-mus, er det passende at anvende 950 nm laserstrålingat visualisere de nervetråde.
4. Vælg laserbølgelængde og emission kanaler (450-480 nm for anden harmonisk generering afsløring, 520-550 nm for billeddannelse af YFP-mærkede nerver og 580-630 nm til påvisning af YFP fluorescens og autofluorescens af hår), start med lav laser effekt (3-5%) for at forhindre solskader og blegning. Den typiske spænding på fotomultiplikatorrørene er 600-700 V for denne form for billeddannelse.
5. Indstil den ønskede opløsning (512 x 512 eller 640 x 640 for hurtige begivenheder målinger på 800 x 800 eller 1.024 x 1.024 til morfologisk billeddannelse), aksial trin (1-3 um), tykkelsen af ​​prøven og de tidsintervaller (1-10 min). Eksponeringstiden er i størrelsesordenen 1 millisekund per én pixel.
6. Først markere de øvre og nedre grænser for den billeddannende mængde i softwaren.
7. Anskaf reference billedstak for referencen før læsionen. Når det er nødvendigt, er det muligt at registrere grundlinjen i flere minutter.
8. Efter billeddannelse ren puden med en serviet og sætte musen i et opsving kasse ved 36 ° C, indtil det er helt vågen.
   BEMÆRK: Normalt varigheden af en imaging session kombineret med laser induceret læsion (se nedenfor), ikke overstiger 1 time. Vi anbefaler at kontrollere, at dyret er dybt bedøvet hver 10-15 min; dette bør ikke gribe ind billeddannelse sig selv, men bør overvejes, mens eksperimentelle procedure er planlagt. Varigheden af ​​effekten af ​​en enkelt ketamin / xylazyne dosis er omkring 30 og 40 minutter, og dermed anbefaler vi at anvende yderligere ¼ til ½ dosis efter 25-30 min.
   BEMÆRK: Det bør betragtes som godt, når eksperimenter planlægger at hyppigheden af imaging-sessioner til et bestemt dyr ikke bør overstige 1 session pr 2 dage til at undgå skadelige virkninger af rekonkurrencedygtig anæstesi.

4. Laser Læsion

1. Efter at erhverve reference billedstak bruge blegning protokollen til at lave en mikro læsion.
2. Øg laser magt til 100%.
3. Øge eksponeringen tid til 100-1000 ms per region af interesse (100-1,000x mere end i tilfælde af standard billeddannelse).
4. Outline området for læsionen.
5. Gør læsion ved at tænde for blegning.
6. Skift tilbage til den almindelige billedbehandlingstype og fortsætte med tidsforskudte optagelser.

5. Databehandling og analyse

1. Fortsæt med unmixing hjælp Spectral Unmixing plugin i ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Åbn billedstak og opdele kanalerne.
3. Find det område fri af nerver eller hår til baggrunden målinger. Put en region of interesse i dette område.
4. Outline omhyggeligt den del af håret, når det er klart adskiller sig fra nerverne.
5. Outline nerven i den del af billedet, hvor det er adskilt fra håret.
6. Gem unmixing matrix.
7. Anvend målte unmixing matrix for hele stakken.
8. Gemme de nye forarbejdede billedstakke i * .tif format.

Representative Results

Brug af den beskrevne teknik er det muligt at spore den samme fiber, efter læsionen, og at undersøge nedbrydningen af beskadigede nerveender (figur 1). Erhvervelse af stakken med en tykkelse på 120-150 um er sædvanligvis passende for den gentagne billeddannelse i adskillige dage for at holde hele fiber i synsfeltet.

Læsionen kan typisk fremstilles præcist når plastemballage materiale justeres til flade huden, så kollagen lag vises med ensartet intensitet på billedet (figur 2). Nerveender over kollagen lag er mest velegnet til at fremstille den præcise læsion.

I tilfælde af hud ikke er fladtrykt, kan forekomme, at billedet bliver sløret (figur 3). Intensiteten i denne situation kan stadig være egnet til morfologiske undersøgelser af nervefibre, men laser læsion proceduren ville blive hindret.

Figur 1. Tid spor af effekten af laser-læsion på nervefiber præsenteret som maksimale projektion billeder. De øverste billeder viser fiberen før og umiddelbart efter læsion, det nederste panel viser det samme fiber efter 30 min og 10 døgn (venstre og højre paneler, tilsvarende). Der er nogle YFP udtrykker strukturer i ikke-neuronal karakter, der vises 10 dage efter læsion. Disse strukturer vil sandsynligvis være keratinocytter, der vides at udtrykke Thy1 gen transient under traumatiske forhold. YFP fluorescens af nervefibre er vist i gul. En pil markerer det område af læsionen. Målestok 30 um.

/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "src =" / filer / ftp_upload / 51045 / 51045fig2.jpg "/>
Figur 2. Maksimal projektion billede til nerveender i fladtrykt hudområde. YFP fluorescens af nervefibre vises med gult, er den anden harmoniske generation af kollagen vist i blåt. Scale bar 50 pm.

Figur 3. nerveender i buede område af huden opnås som et maksimum z-projektion til flere optiske sektioner. YFP fluorescens af nervefibre og autofluorescens af håret er vist i gul, er den anden harmoniske generation af kollagen vist i blåt. Scale bar 50 pm.

ftp_upload / 51045 / 51045fig4highres.jpg "src =" / filer / ftp_upload / 51045 / 51045fig4.jpg "/>
Figur 4. pote fiksering procedure ved hjælp af mikroskop objektglas som et dække. Slæden er fastgjort til metalstangen anvendelse af standard papirclips.

Discussion

I denne video protokol vi demonstrere fremgangsmåden til ikke-invasiv langsgående to-foton-billeddannelse af enkelt nerveender.

Dynamikken i huden innervationer påvirkes ved sådanne sygdomme som psoriasis og perifer neuropati ^2, og i traumatiske skader ^9. To-foton billedbehandling giver mulighed for en detaljeret analyse af nervefibre strukturer i collagen matrix. Anvendelsen af ​​transgene reporter mus hjælper med at undgå de problemer vedrørende farvning af nervefibre. Thy1-YFP-H-stammen synes at være tilstrækkelig robust til morfologisk dataanalyse ¹⁰ mens de Thy1-mitoCFP mus kan give mulighed for funktionelle studier af mitokondrie dynamik i nervefibre ^11. YFP-16 / ICR linje kan anvendes til observation af Meissner organer ^12. Den alternative fremgangsmåde kan være den virale injektion i dorsale rodganglie til selektiv sporing af specifikke neuronale populationer13.

Det er værd at bemærke, at produktion af selektiv læsion i collagenmatrix stærkt hæmmet i forhold til de øverste lag af huden. Det er derfor undertiden eksponeringstider ved dissektion af nervefibre kan variere så meget som ti gange, mens intensiteten af ​​fluorescensen af ​​det billeddannende afviger på intervallet 10-20%. For at opretholde en god kvalitet af billedet konstant nedsænkning koblingen skal holdes.

Resolutionen af ​​billedet normalt afhænger af den ønskelige hastighed på overtagelsestidspunktet. Typisk tid til fremstilling af en 30 frames- stak med opløsning 800 x 800 pixel er 1 min, så man kan reducere opløsningen eller tykkelsen af ​​afbildede område at detektere hurtige ændringer eller øge opløsning til fine morfologiske træk studier.

Fiksering af trædepuden skal være stram nok til ikke at tillade drift af billedet, men på samme tid, det bør ikke påvirke blodcirkulationen i than huden. Til optimering af proceduren, injektioner af blodkar sporstoffer (f.eks TexasRed mærket 70 kDa dextran) er mulige, tillader en at justere plastemballage materiale tryk via overvågning af blodgennemstrømningen. Motion artefakter i præparatet er beskrevet i denne protokol er usandsynligt, fordi dyret er dybt bedøvet, er pote sig solidt fastgjort til fiksering forsamling, og fordi hjerteslag og vejrtrækning bevægelse ikke direkte overføres til pote. Er imidlertid mulige, især hvis høj forstørrelse billeddannelse udføres, mindre bevægelser. I dette tilfælde kan vi anbefale at bruge ImageJ plugins der skal kompensere bevægelse.

Den gentagne billeddannelse af samme område kan opnås ved anvendelse af sådanne referencepunkter som carpal pude ^14, eller i tilfælde af injektion af visse stoffer i trædepuden stedet for injektion kan tjene som en milepæl ^6. Den anden mulighed er tatovering af huden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782