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Neuroscience

त्वचा में एकल तंत्रिका अंत के vivo दो photon माइक्रोस्कोपी में

Published: August 24, 2014 doi: 10.3791/51045
Automatic Translation
1, 1
1Neuroscience Center, University of Helsinki

ERRATUM NOTICE

Summary

गतिशील अनुदैर्ध्य इमेजिंग और रिपोर्टर ट्रांसजेनिक चूहों में तंत्रिका अंत के चयनात्मक लेजर घाव के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

Abstract

त्वचा में तंत्रिका अंत ऐसे न्यूरोपैथिक दर्द 2 जैसे 1 संवेदन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग प्रक्रियाओं में शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं. उनके पास से सतह स्थिति बरकरार पशु रहने में त्वचा तंत्रिका अंत की सूक्ष्म इमेजिंग की सुविधा. Multiphoton माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, यह त्वचा के ऊतकों की तेज रोशनी बिखरने की समस्या पर काबू पाने के ठीक छवियों को प्राप्त करने के लिए संभव है. (परिधि संवेदी न्यूरॉन्स सहित) न्यूरॉन्स में तेरा-1 प्रमोटर के नियंत्रण में EYFP व्यक्त कि रिपोर्टर ट्रांसजेनिक चूहों के ऊपर कई महीनों के लिए या यहां तक ​​कि जीवन लंबे समय की विस्तारित अवधि से अधिक व्यक्ति तंत्रिका अंत के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. इसके अलावा, इमेजिंग के लिए के रूप में ही femtosecond लेजर का उपयोग कर, यह तंत्रिका फाइबर पुनर्गठन की पढ़ाई के लिए तंत्रिका तंतुओं के अत्यधिक चयनात्मक घावों का उत्पादन संभव है. यहाँ, हम vivo इमेजिंग में अनुदैर्ध्य multiphoton के लिए एक सरल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल वर्तमान औरमाउस त्वचा तंत्रिका अंत पर लेजर आधारित microsurgery.

Introduction

त्वचीय तंत्रिका अंत अलग pathophysiological राज्यों तहत dynamical परिवर्तन से गुजरना. तंत्रिका तंतुओं परिधीय न्यूरोपैथी 2 या मॉर्टन न्यूरोमा 3 के रूप में इस तरह के रोगों के पाठ्यक्रम में अध: पतन और उत्थान या पुनर्गठन की प्रक्रिया के माध्यम से जा सकते हैं. दर्दनाक चोट के बाद, त्वचा में तंत्रिका अंत गतिशीलता का एक महत्वपूर्ण हिस्सा क्षतिग्रस्त क्षेत्र के reinnervation है. हालांकि, तंत्रिका अंत की जांच के लिए सामान्य दृष्टिकोण चल रही प्रक्रियाओं 4 पर वास्तविक समय की जानकारी का अभाव है कि पूर्व vivo ऊतकीय सेक्शनिंग है. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करना, यह इस प्रकार संरचनात्मक परिवर्तन पर अमीर और काफी अधिक प्रासंगिक जानकारी प्राप्त करने, जीवित पशुओं की त्वचा में तंत्रिका अंत ट्रैक करने के लिए संभव है. त्वचीय तंत्रिका अंत की जांच पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, हालांकि, त्वचा के ऊतकों की तेज रोशनी बिखरने जोरदार गुणवत्ता को नजरअंदाज का उपयोग संभव हैडेटा के 5 हासिल कर ली. Multiphoton माइक्रोस्कोपी के कारण ही उद्देश्य के केन्द्र बिन्दु से प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप उत्तेजना प्रकाश फोटॉनों की ऊर्जा के गैर रेखीय योग करने के लिए दृढ़ता से बिखरने के ऊतकों में उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देता है. इस आशय की त्वचा के ऊतकों 6 में मापन के लिए एक मजबूत पैठ गहराई में वृद्धि हुई है और संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार के लिए जाता है. इमेजिंग के लिए के रूप में ही लेसर का उपयोग कर, यह तंत्रिका तंतुओं 7 के चुनिंदा विच्छेदन का उत्पादन संभव है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम चयनात्मक लेजर घाव व्यावसायिक रूप से उपलब्ध multiphoton खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग के साथ संयुक्त संवाददाता ट्रांसजेनिक चूहों में vivo में त्वचा संबंधी तंत्रिका अंत के अनुदैर्ध्य इमेजिंग की पद्धति दिखा.

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Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं राष्ट्रीय पशु प्रयोग बोर्ड, फिनलैंड द्वारा अनुमोदित किया गया है.

इमेजिंग के लिए 1 पशु तैयारी

  1. Intraperitional ketamine के इंजेक्शन (आईपी) (शरीर के वजन के प्रति 0.08 मिलीग्राम) और xylazine (शरीर के वजन के प्रति 0.01 मिलीग्राम) द्वारा एक माउस anesthetize. रियर पैर की अंगुली चुटकी पलटा साथ संज्ञाहरण की जाँच करें.
  2. आँख निर्जलीकरण से आंखों की रक्षा के लिए (Viscotears) बूंदों में पशु की आंखों विसर्जित कर दिया.
  3. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग पैड (सुपरटेक) पर माउस रखो.
  4. 70% इथेनॉल के साथ इमेजिंग के लिए नामित पैर पैड साफ करें.
  5. त्वचा और कवर कांच के बीच विसर्जन युग्मन के लिए पैर पैड की त्वचा पर पानी की एक बूंद जोड़ें.
  6. कवर वर्ग के साथ एक धातु की अंगूठी के तहत तैनात है कि हिंद पंजा के तहत प्लास्टिक की पैकेजिंग सामग्री डाल.
  7. त्वचा को समतल करने के लिए प्लास्टिक की पैकेजिंग सामग्री की मोटाई को समायोजित करें.
  8. कवर glas पर पानी की एक बूंद रखोकवर कांच और उद्देश्य के बीच विसर्जन के लिए है.

2 धातु Fixator रिंग तैयारी

  1. त्वचा के स्थिरीकरण के लिए धातु fixator उपयोग. हम एक धातु की अंगूठी (Neurotar लिमिटेड, फिनलैंड के सौजन्य से) के साथ समुदाय डिजाइन की रक्षा की दो विंग fixator का उपयोग करें. , Superglue साथ सिरिंज भरें अंगूठी पर सुई के माध्यम से superglue की छोटी सी बूंद डाल दिया और धीरे अंगूठी सतह की वर्दी कवरेज के लिए गोंद फैल गया. गोंद की अत्यधिक मात्रा में देखने के क्षेत्र को कम करने और बाद में इमेजिंग में बाधा डालती सकता है, क्योंकि यह केवल वर्दी कवरेज के लिए आवश्यक है कि गोंद की न्यूनतम राशि डालने के लिए महत्वपूर्ण है.
    नोट: एक (नीचे से) धातु पट्टी और (एक कवर के रूप में) मानक खुर्दबीन गिलास स्लाइड के वैकल्पिक रूप से संयोजन त्वचा को समतल करने और विधानसभा की 14 उचित ऑप्टिकल युग्मन सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दो पेपर क्लिप कांच और धातु पट्टी की सतह के बीच पंजा ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 4
  2. माइक्रोस्कोप कवर स्लाइड (5 मिमी व्यास, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान) के साथ अंगूठी को कवर किया.
  3. मोटरयुक्त खुर्दबीन मंच पर montaged है कि कठोर धातु पट्टी करने के लिए अंगूठी fixator पर पेंच.

3 इमेजिंग प्रक्रिया

  1. Thy1-YFP एच चूहों का उपयोग करने के मामले में, तंत्रिका तंतुओं कल्पना करने के लिए प्रतिदीप्ति दीपक स्पेक्ट्रा के नीले भाग का चयन करें. Epifluorescence मोड में ब्याज की तंत्रिका लगाएं और उस पर ध्यान केंद्रित.
  2. अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक स्थान के निर्देशांक नीचे लिखें. एक संदर्भ बिंदु के रूप में एक कलाई पैड का प्रयोग करें. निम्नलिखित इमेजिंग सत्र के दौरान, पहली कलाई पैड का पता लगाने के लिए और फिर एक ही नदी के ऊपर बड़ी तंत्रिका तंतुओं को खोजने और बचाया निर्देशांक का उपयोग कर वापस चले जाते हैं. यह संदर्भ की एक ही व्यवस्था रखने के लिए धातु पट्टी को सीधा एक ही दिशा में पैर पैड की स्थिति के लिए आवश्यक है.
  3. दो photon मोड को चालू करें. Thy1-YFP एच चूहों के लिए, यह लेजर विकिरण के 950 एनएम तरंगदैर्ध्य उपयोग करने के लिए उपयुक्त हैतंत्रिका तंतुओं कल्पना करने के लिए.
  4. (450 से 520 से YFP लेबल नसों की इमेजिंग के लिए 550 एनएम और 580 से YFP प्रतिदीप्ति और बालों की autofluorescence का पता लगाने के लिए 630 एनएम के लिए दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी का पता लगाने के लिए 480 एनएम, के लिए) का चयन लेजर तरंगदैर्ध्य और उत्सर्जन चैनलों के साथ शुरू photodamage और विरंजन रोकने के लिए कम लेजर पावर (3-5%). photomultiplier ट्यूब पर ठेठ वोल्टेज इमेजिंग के इस तरह के लिए 600-700 वी है.
  5. (1-10 वांछित संकल्प (512 x 512 या तेज घटनाओं माप के लिए 640 एक्स 640, एक्स 800 या रूपात्मक इमेजिंग के लिए 1024 x 1024 800), अक्षीय कदम (1-3 माइक्रोन), नमूना की मोटाई और समय अंतराल सेट मिनट). जोखिम समय एक पिक्सेल प्रति 1 मिसे के क्रम में है.
  6. पहले सॉफ्टवेयर में इमेजिंग मात्रा के ऊपरी और निचले सीमाओं निशान.
  7. घाव से पहले संदर्भ के लिए संदर्भ छवि ढेर मोल. जरूरत है, यह कई मिनट के दौरान आधारभूत रिकॉर्ड करने के लिए संभव है.
  8. एक ऊतक के साथ पैड साफ इमेजिंग और यह पूरी तरह से जाग है जब तक 36 डिग्री सेल्सियस पर एक वसूली बॉक्स में माउस डाल के बाद.
    नोट: आमतौर पर, लेजर प्रेरित घाव के साथ संयुक्त एक इमेजिंग सत्र की अवधि (देखें नीचे) 1 घंटा से अधिक नहीं है. हम जानवरों की गहराई से हर 10-15 मिनट anaesthetized है कि पुष्टि करने की सलाह देते हैं; यह अपने आप इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए लेकिन प्रायोगिक प्रक्रिया की योजना बनाई है, जबकि माना जाना चाहिए. एक एकल ketamine / xylazyne खुराक के प्रभाव की अवधि इस प्रकार हम 25-30 मिनट के बाद खुराक साढ़े ¼ अतिरिक्त लागू करने की सिफारिश, 40 मिनट के लिए लगभग 30 है.
    नोट: प्रयोग एक व्यक्ति पशुओं के लिए इमेजिंग सत्र की आवृत्ति पुनः के प्रतिकूल प्रभाव से बचने के लिए 1 सत्र 2 प्रति दिन से अधिक नहीं होना चाहिए कि योजना बना रहा है जब यह रूप में अच्छी तरह से विचार किया जाना चाहिएप्रतिस्पर्धात्मक संज्ञाहरण.

4 लेजर घाव

  1. संदर्भ छवि ढेर प्राप्त करने के बाद, एक सूक्ष्म घाव बनाने के लिए विरंजन प्रोटोकॉल का उपयोग करें.
  2. 100% करने के लिए लेजर शक्ति बढ़ाएँ.
  3. ब्याज (100-1,000x मानक इमेजिंग के मामले में अधिक से अधिक) के क्षेत्र में प्रति 100-1,000 मिसे के लिए जोखिम समय बढ़ाएँ.
  4. घाव के लिए क्षेत्र को रेखांकित करें.
  5. विरंजन पर स्विचन द्वारा घाव बनाओ.
  6. वापस नियमित इमेजिंग मोड में स्विच करें और समय चूक रिकॉर्डिंग के साथ जारी है.

5 डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. ImageJ 8 में वर्णक्रमीय unmixing प्लगइन का उपयोग unmixing साथ (जोकिम वाल्टर, आगे बढ़ो http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
  2. छवि पर ढेर खोलें और चैनलों विभाजित.
  3. पृष्ठभूमि माप के लिए तंत्रिकाओं या बालों का मुक्त क्षेत्र का पता लगाएं. एक क्षेत्र ओ रखोउस क्षेत्र में एफ ब्याज.
  4. इसे ध्यान से नसों से स्पष्ट रूप से अलग पहचाना है जहां बाल का हिस्सा रेखांकित करें.
  5. यह बालों से अलग है जहां छवि के भाग में तंत्रिका को रेखांकित करें.
  6. मैट्रिक्स unmixing बचाओ.
  7. पूरे ढेर के लिए मापा unmixing मैट्रिक्स लागू करें.
  8. * .tif प्रारूप में नई संसाधित छवि के ढेर को बचाओ.

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Representative Results

यह संभव है कि वर्णित तकनीक का प्रयोग घाव के बाद एक ही फाइबर को ट्रैक करने और क्षतिग्रस्त तंत्रिका अंत (चित्रा 1) की गिरावट अध्ययन करने के लिए. 120-150 माइक्रोन की मोटाई के साथ ढेर के अधिग्रहण को देखने के क्षेत्र में पूरे फाइबर रखने के क्रम में कई दिनों के दौरान दोहराए इमेजिंग के लिए आमतौर पर उचित है.

प्लास्टिक की पैकेजिंग सामग्री त्वचा समतल करने के लिए निकाला जाता है जब घाव आम तौर पर संक्षेप में उत्पादन किया जा सकता है, तो कोलेजन परतों छवि पर वर्दी तीव्रता (चित्रा 2) के साथ दिखाई देते हैं. कोलेजन परत के ऊपर तंत्रिका अंत सटीक घाव का उत्पादन करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं.

त्वचा चपटा नहीं है मामले में, छवि को धुंधला होने के लिए (चित्रा 3) हो सकती है. इस स्थिति में तीव्रता अभी भी रूपात्मक तंत्रिका तंतुओं की जांच लेकिन लेजर घाव प्रक्रिया होगा के लिए उपयुक्त हो सकता है रुकावट हो.

चित्रा 1
और सीधे घाव के बाद, कम पैनल 30 मिनट और 10 दिन (छोड़ दिया और बाद में एक ही फाइबर से पता चलता है इससे पहले अधिकतम प्रक्षेपण छवियों के रूप में प्रस्तुत तंत्रिका फाइबर पर लेजर घाव के प्रभाव की चित्रा 1 समय ट्रैक. ऊपरी छवियों फाइबर दिखाने सही पैनल, तदनुसार). 10 दिनों के घाव के बाद दिखाई देते हैं कि गैर neuronal प्रकृति के कुछ YFP व्यक्त संरचनाओं हैं. इन संरचनाओं दर्दनाक परिस्थितियों में क्षणिक Thy1 जीन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है केरेटिनकोशिकाओं होने की संभावना है. तंत्रिका तंतुओं के YFP प्रतिदीप्ति पीले रंग में दिखाया गया है. एक तीर घाव के क्षेत्र के निशान. स्केल बार 30 माइक्रोन.

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चपटी त्वचा क्षेत्र में तंत्रिका अंत के लिए चित्रा 2 अधिकतम प्रक्षेपण छवि. तंत्रिका तंतुओं के YFP प्रतिदीप्ति पीले रंग में दिखाया गया है, कोलेजन की दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी नीले रंग में दिखाया गया है. स्केल बार 50 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3 कई ऑप्टिकल वर्गों के लिए एक अधिकतम Z-प्रक्षेपण के रूप में प्राप्त की त्वचा की घुमावदार क्षेत्र में तंत्रिका अंत. तंत्रिका तंतुओं और बालों की autofluorescence के YFP प्रतिदीप्ति पीले रंग में दिखाया गया है, कोलेजन की दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी दिखाया गया है नीले रंग में. स्केल बार 50 माइक्रोन.

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एक कवर के रूप में खुर्दबीन गिलास स्लाइड का उपयोग पंजा निर्धारण प्रक्रिया 4 चित्रा. स्लाइड मानक पेपर क्लिप का उपयोग धातु पट्टी से जुड़ा हुआ है.

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Discussion

इस वीडियो प्रोटोकॉल में हम एक तंत्रिका अंत की गैर इनवेसिव अनुदैर्ध्य दो photon इमेजिंग के लिए विधि प्रदर्शित करता है.

त्वचा innervations की गतिशीलता सोरायसिस और परिधीय न्यूरोपैथी 2, के रूप में इस तरह के रोगों में और दर्दनाक चोटों 9 में प्रभावित है. दो photon इमेजिंग मैट्रिक्स कोलेजन में तंत्रिका तंतुओं संरचनाओं का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है. ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों का उपयोग तंत्रिका तंतुओं के धुंधला के विषय में समस्याओं से बचने में मदद करता है. Thy1-mitoCFP चूहों तंत्रिका तंतुओं 11 में mitochondrial गतिशीलता के कार्य के अध्ययन के लिए एक अवसर प्रदान कर सकता है, जबकि Thy1-YFP एच तनाव रूपात्मक डेटा विश्लेषण 10 के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत हो रहा है. YFP-16 / आईसीआर लाइन Meissner शव 12 के अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक दृष्टिकोण विशिष्ट neuronal आबादी के चुनिंदा ट्रैकिंग के लिए पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि में वायरल इंजेक्शन हो सकता है13.

यह कोलेजन मैट्रिक्स के भीतर चयनात्मक घाव का उत्पादन दृढ़ता से त्वचा की ऊपरी परत की तुलना में रुकावट है कि देख लायक है. इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति की तीव्रता 10-20% की सीमा पर अलग है, जबकि तंत्रिका तंतुओं के विच्छेदन के लिए कभी कभी जोखिम बार के रूप में ज्यादा के रूप में दस गुना अलग कर सकते हैं यही कारण है कि. लगातार विसर्जन युग्मन रखा जाना है छवि की अच्छी गुणवत्ता बनाए रखने के लिए.

छवि का संकल्प आमतौर पर अधिग्रहण की वांछनीय गति पर निर्भर करता है. एक तेजी से परिवर्तन का पता लगाने या ठीक रूपात्मक सुविधाओं के अध्ययन के लिए संकल्प को बढ़ाने के लिए संकल्प या imaged क्षेत्र की मोटाई कम कर सकते हैं तो संकल्प 800 x 800 पिक्सल के साथ एक 30 फ्रेम ढेर के उत्पादन के लिए विशिष्ट समय, 1 मिनट है.

लुटेरा का निर्धारण छवि का बहाव अनुमति देने के लिए पर्याप्त नहीं तंग होना चाहिए, लेकिन एक ही समय में यह टी में रक्त परिसंचरण प्रभावित नहीं होना चाहिएवह त्वचा. प्रक्रिया के अनुकूलन के लिए, रक्त वाहिकाओं tracers के इंजेक्शन रक्त प्रवाह की निगरानी के माध्यम से प्लास्टिक की पैकेजिंग सामग्री के दबाव को समायोजित करने के लिए एक, की अनुमति संभव हो रहे हैं (उदाहरण के लिए, TexasRed 70 केडीए dextran लेबल). दिल की धड़कन और सांस लेने आंदोलन सीधे पंजा को प्रेषित नहीं कर रहे हैं, क्योंकि पशु गहरा anaesthetized है क्योंकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित तैयारी में गति कलाकृतियों की संभावना नहीं है, पंजा ही मजबूती निर्धारण विधानसभा से जुड़ा है, और है. हालांकि, मामूली आंदोलनों उच्च वृद्धि इमेजिंग किया जाता है, खासकर अगर संभव हो रहे हैं. इस मामले में हम गति कलाकृतियों की भरपाई के लिए बनाया गया ImageJ प्लगइन्स उपयोग करने की अनुशंसा कर सकते हैं.

एक ही क्षेत्र का दोहराव इमेजिंग कलाई पैड 14 के रूप में, या इंजेक्शन की जगह एक मील का पत्थर के रूप में 6 की सेवा कर सकते लुटेरा में कुछ पदार्थों के इंजेक्शन के मामले में इस तरह के संदर्भ अंक का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. दूसरी संभावना यह त्वचा की गोदना है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों वित्तीय सहायता के लिए तकनीकी सहायता, CIMO फाउंडेशन और FGSN लिए Neurotar लिमिटेड को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Round cover glass  Electron Microscopy Science 72296-05 5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears Novartis 2 mg/g
Superglue Loctite 401 Henkel 135429
Ketaminol Intervet Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun Bayer Healthcare Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml BD 300013
30 G 1/2" needles BD 304000
Plastic packaging material Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope Olympus FV-1000MPE Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective Olympus XLPLN 25XWMP Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W) SpectraPhysics
Heating pad Supertech TMP-5b Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator Neurotar Ltd.
ImageJ NIH Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ 
Thy1-YFPH mice strain JaxLab 003782

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References

  1. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 90 multiphoton माइक्रोस्कोपी तंत्रिका अंत घाव तेरा -1 प्रमोटर,

Erratum

Formal Correction: Erratum: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin.

Leonard Khiroug was removed as an author.

त्वचा में एकल तंत्रिका अंत <em>के</em> vivo दो photon माइक्रोस्कोपी <em>में</em>
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Yuryev, M., Molotkov, D. In… More

Yuryev, M., Molotkov, D. In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin. J. Vis. Exp. (90), e51045, doi:10.3791/51045 (2014).

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