В Vivo Двухфотонное микроскопии Одноместный нервных окончаний в коже

Summary

Протокол динамической продольной томографии и селективной лазерной поражением нервных окончаний в репортера трансгенных мышей представлена.

Abstract

Нервных окончаний в коже участвуют в физиологических процессах, таких как зондирование ^1, а также в патологических процессах, таких как невропатическая боль ^2. Их близкие к поверхности позиционирования облегчает микроскопических изображений нервных окончаний кожи в живых интактного животного. Использование многофотонной микроскопии, можно получить высококачественные изображения преодоления проблемы сильного рассеяния света в ткани кожи. Репортер трансгенных мышей, которые выражают EYFP под контролем Thy-1 промоутера в нейронах (в том числе периферии сенсорных нейронов) хорошо подходят для продольных исследованиях отдельных нервных окончаний более длительных периодов времени до нескольких месяцев или даже всю жизнь. Кроме того, с помощью того же фемтосекундного лазера, как для визуализации, можно произвести высоко селективных поражения нервных волокон для исследования перестройки нервных волокон. Здесь мы представляем простой и надежный протокол для продольной МФ в естественных изображений ина основе лазера микрохирургии на мыши нервных окончаний кожи.

Introduction

Кожные нервные окончания пройти динамические изменения при различных патофизиологических состояниях. Нервные волокна могут пройти через процесс дегенерации и регенерации или реструктуризации в ходе таких заболеваний как периферическая нейропатия ² или Мортона невромы ^3. После травматического повреждения, важной частью нервных окончаний динамики в коже реиннервация из поврежденной области. Тем не менее, общий подход для исследования нервных окончаний является экс естественных гистологическое секционирования, что отсутствует информация о текущих процессах ⁴ в режиме реального времени. Использование генетически закодированные флуоресцентные маркеры, можно отслеживать на нервные окончания в коже живых животных, таким образом, получить богатую и значительно более соответствующую информацию о структурных изменениях. Исследование кожных нервных окончаний можно с помощью обычной люминесцентной микроскопии, однако, сильное рассеяние света от кожной ткани сильно подрывает качестводанных приобрела ^5. Многофотонная микроскопия позволяет получать изображения с высоким разрешением в сильно рассеивающих тканей в связи с не-линейного суммирования энергии возбуждения световых фотонов в результате эмиссии флуоресценции только от точки фокуса объектива. Этот эффект приводит к надежной увеличения глубины проникновения и улучшение соотношения сигнал-шум для измерения в тканях кожи ^6. Используя ту же самую, что и для лазера изображений, можно произвести избирательное рассечение нервных волокон ^7. В следующем протоколе мы покажем метод продольной томографии кожных нервных окончаний в естественных условиях в репортера трансгенных мышей в сочетании с селективного лазерного поражения с использованием коммерчески доступного систему многофотонное микроскопа.

Protocol

Процедуры, связанные животных предметы были одобрены опытной Национальный животных совета, Финляндии.

1 Подготовка животных для визуализации

1. Обезболить мыши по intraperitional (IP) инъекции кетамина (0,08 мг на массу тела) и ксилазина (0,01 мг на массу тела). Проверьте анестезии с задней ног пинч рефлекса.
2. Погрузитесь глаза животного в глазные капли (Viscotears) для защиты глаз от обезвоживания.
3. Поставьте курсор на грелку (Supertech) при 37 ° С, чтобы предотвратить переохлаждение.
4. Очистите ноги площадку, предназначенную для визуализации с 70% этанола.
5. Добавить каплю воды на коже подушечку лапы для погружения связи между кожей и покровным стеклом.
6. Поместите пластиковую упаковочный материал под заднюю лапу, который расположен под металлическим кольцом с крышкой класса.
7. Отрегулировать толщину пластикового упаковочного материала, чтобы сгладить кожу.
8. Поместите каплю воды на обложке Glasс для погружения между защитным стеклом и объективом.

2 Metal Фиксатор Подготовка кольцо

1. Для стабилизации кожи используют металлический фиксатор. Мы используем в сообществе Дизайн-защищенный два крыла фиксатор с металлическим кольцом (любезно Neurotar Ltd, Финляндия). Заполните шприц с суперклеем, поставить небольшую каплю суперклея через иглу на кольце и аккуратно развести клей для равномерного освещения поверхности кольца. Очень важно поставить минимальное количество клея, которое необходимо только для получения равномерного покрытия, поскольку чрезмерное количество клея может снизить поле зрения и препятствует последующему изображений.
   Примечание: В качестве альтернативы сочетание металлической панели (с) и под микроскопом стандартной стекло (как покрытие) может быть использован, чтобы сгладить кожу и обеспечить надлежащее соединение оптического узла ^14. Два скрепки могут быть использованы, чтобы зафиксировать лапу между стеклом и металлическим прутом поверхности (Рисунок 4
2. Накройте кольцо с микроскопа крышкой слайд (диаметром 5 мм, электронная микроскопия наук).
3. Винт на кольцевой фиксатор к жесткой металлической панели, которая montaged на моторизованной столике микроскопа.

3 изображений Порядок

1. В случае использования мышей Thy1-YFP-H, выберите синий часть спектров лампы флуоресценции для визуализации нервных волокон. Найти нерв интерес в режиме эпифлуоресцентной и сосредоточиться на нем.
2. Запишите координаты места для продольной томографии. Используйте кистевой площадку в качестве точки отсчета. В течение следующих сессий визуализации, обнаружить первые кистевой площадку, а затем найти те же добывающие большие нервные волокна и вернуться, используя сохраненные координаты. Очень важно, чтобы расположить ноги площадку в том же направлении, перпендикулярном металлического стержня, чтобы сохранить тот же систему отсчета.
3. Включите режим двухфотонного. Для мышей Thy1-YFP-Н, он подходит для использования длины волны 950 нм лазерного излучениявизуализировать нервные волокна.
4. Выберите лазера длина волны и выбросов каналы (от 450 до 480 нм для второй обнаружения гармонического поколения, от 520 до 550 нм для визуализации YFP-меченых нервов и от 580 до 630 нм для обнаружения YFP флуоресценции и флуоресценции волос), начните с низкий мощность лазера (3-5%) для предотвращения фотоповреждения и отбеливание. Типичный напряжение на ФЭУ 600-700 V для этого вида изображений.
5. Установите необходимое разрешение (512 х 512 или 640 х 640 для быстрых измерений событий, 800 х 800 или 1024 х 1024 для морфологического изображений), осевой шаг (1-3 мкм), толщины образца и временные интервалы (1-10 мин). Время экспозиции в порядке 1 мсек на один пиксель.
6. Первый отметить верхние и нижние границы объема формирования изображения в программном обеспечении.
7. Приобретение стек опорного изображения для задания перед поражением. При необходимости, можно записать базовой линии в течение нескольких минут.
8. После визуализации чистый площадку с ткани и положить мышь в коробке восстановления на 36 ° С, пока не полностью проснулся.
   Примечание: Как правило, продолжительность одного сеанса визуализации в сочетании с лазерной индуцированной повреждением (смотри ниже) не превышает 1 часа. Мы рекомендуем проверить, что животное глубоко под наркозом каждые 10-15 минут; это не должно мешать визуализации себя, но следует учитывать при экспериментальная процедура планируется. Длительность эффекта разовой дозы кетамина / xylazyne составляет около 30 до 40 минут, таким образом, мы рекомендуем применять дополнительные ¼ до ½ дозы после 25-30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это следует рассматривать как хорошо, когда эксперименты планирует, что частота сессий визуализации для конкретного животного не должен превышать 1 сеанс в 2 дня, чтобы избежать негативных последствий повторногокурентной анестезия.

4 Лазерная Поражение

1. После приобретения стека изображений справочную, использовать протокол отбеливающий сделать микро поражение.
2. Увеличение мощности лазера до 100%.
3. Увеличение времени экспозиции в 100-1000 мс в области интереса (100-1,000x больше, чем в случае стандартного изображения).
4. Опишите область для поражения.
5. Сделать поражения путем переключения на отбеливание.
6. Переключитесь на режим регулярного изображений и продолжить с покадровой записи.

5 Обработка и анализ данных

1. Продолжайте несмешивания использованием Спектральный расслоение плагин в ImageJ ⁸ (Joachim Вальтер, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Откройте стека изображений и разбил каналы.
3. Найдите площадь свободной от нервов или волос для фоновых измерений. Поставьте области сое интерес к этой области.
4. Тщательно Опишите часть волос, где он явно отличается от нервов.
5. Outline нерва в части изображения, где она отделена от волос.
6. Сохранить расслоение матрицу.
7. Применить измеренное расслоение матрицу для всей стопки.
8. Сохраните новые обработанные стеки изображения в формате * .tif.

Representative Results

Используя описанную методику, то можно отследить же волокна после поражения и изучать деградации поврежденных нервных окончаний (рисунок 1). Получение стека с толщиной 120-150 мкм, как правило, надлежащее для повторной визуализации в течение нескольких дней, чтобы сохранить всю волокна в поле зрения.

Поражение, как правило, могут быть получены сжато, когда пластиковый упаковочный материал регулируется, чтобы сгладить кожу, таким образом, коллагеновые слои появляются с однородной интенсивностью на изображении (рисунок 2). В нервных окончаний над слоем коллагена являются наиболее подходящими для получения точного поражения.

В случае кожа не плоский, изображение может произойти быть размыты (Рисунок 3). Интенсивность в этой ситуации еще могут быть пригодны для морфологического исследования нервных волокон, но процедура лазерного поражения будет быть затруднено.

Рисунок 1 Время дорожки эффекта лазерного поражения на нервные волокна, представленного в качестве максимальной проекции изображений. Верхние изображения показывают волокна до и непосредственно после повреждения, нижняя панель показывает ту же волокна через 30 мин и через 10 дней (левый и правая панели, соответственно). Есть некоторые YFP ​​выражающие сооружений не нейронов природы, которые появляются через 10 дней после поражения. Эти структуры могут быть кератиноциты, которые, как известно, чтобы выразить ген Thy1 временно под травматических условиях. YFP флуоресценции нервных волокон показан на желтый. Стрелка отмечает область поражения. Измерительная линейка 30 мкм.

/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51045 / 51045fig2.jpg "/>
Рисунок 2 Максимальная проекция на изображение для нервных окончаний в уплощенной области кожи. YFP флуоресценции нервных волокон показан на желтый, генерация второй гармоники коллагена показаны синим цветом. Измерительная линейка 50 мкм.

Рисунок 3 нервных окончаний в изогнутой области кожи, полученной в максимальной Z-проекции для нескольких оптических секций. YFP флуоресценции нервных волокон и флуоресценции волос показано на желтый, генерация второй гармоники из коллагена показано в синий. Измерительная линейка 50 мкм.

ftp_upload / 51045 / 51045fig4highres.jpg "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51045 / 51045fig4.jpg "/>
Рисунок 4 Процедура лапа фиксации с помощью микроскопа предметное стекло в качестве прикрытия. Слайд крепится к металлической перекладине, используя стандартные скрепки.

Discussion

В этом видео-протокола мы демонстрируем метод неинвазивной продольной двухфотонного визуализации одиночных нервных окончаний.

Динамика иннервации кожи влияет при таких заболеваниях, как псориаз и периферической нейропатии ^2, и при травматических повреждениях ^9. Томография Двухфотонное позволяет детальный анализ структуры нервных волокон в коллагеновой матрице. Использование трансгенных репортеров мышей помогает избежать проблем, связанных окрашивание нервных волокон. Штамм Thy1-YFP-H, кажется, достаточно надежной для морфологического анализа данных ¹⁰ в то время как мыши Thy1-mitoCFP может предоставить возможность функциональных исследований митохондриальных динамики в нервных волокнах ^11. YFP-16 / ICR линия может быть использована для наблюдения мейсснеров- органов ^12. Альтернативный подход может быть вирусный инъекции в спинной ганглий корень для селективного отслеживания конкретных нейрональных популяций13.

Стоит отметить, что производство селективного очага в коллагеновой матрице сильно затруднена по сравнению с верхних слоев кожи. Вот почему иногда время экспозиции для вскрытия нервных волокон может отличаться столько, сколько десять раз, а интенсивность флуоресценции для визуализации отличается от диапазона 10-20%. Чтобы поддерживать хорошее качество изображения постоянная погружение муфта должна быть сохранена.

Разрешение изображения, как правило, зависит от желаемой скорости приобретения. Типичное время для производства в 30 рамы- стека с разрешением 800 х 800 пикселей составляет 1 мин, так что можно уменьшить разрешение или толщину распечатанных области для обнаружения быстрых изменений или увеличить разрешение для мелких морфологические особенности исследований.

Фиксация подушечку стопы должно быть достаточно, чтобы не допустить дрейфа изображения туго, но в то же время это не должно влиять на кровообращение в тон кожи. Для оптимизации процедуры, инъекции кровеносных сосудов индикаторов (например, TexasRed помечены 70 кДа декстран) возможны, позволяя регулировать пластиковую упаковку давление материала через мониторинг кровотока. Артефакты движения в подготовке указанных в настоящем Протоколе вряд потому что животное глубоко под наркозом, сама лапа прочно прикреплены к фиксации сборки, и потому сердцебиение и движение дыхание непосредственно не передается на лапу. Тем не менее, незначительные движения возможны, особенно если выполняется визуализация высокого увеличения. В этом случае можно рекомендовать использовать ImageJ плагины, предназначенные для компенсации артефактов движения.

Повторяющиеся изображений одной и той же области может быть достигнуто с помощью таких как опорные точки запястья площадку ^14, или в случае инъекции некоторых веществ в подушечку лапы месте инъекции могут служить в качестве ориентира ^6. Другая возможность состоит в татуировки кожи.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782