Abstract
immunofluorescence כל ההר כדי לאתר 3 הופעלו caspase (assay Casp3) הוא שימושי כדי לזהות תאים עוברים אפופטוזיס הפנימי או חיצוני בעוברי דג הזברה. ניתוח כל ההר מספק מידע מרחבי בכל קשור לייחוד רקמה של תאי apoptosing, אם כי חתך ו / או colabeling נדרש סופו של דבר לאתר את סוגי התאים בדיוק עוברים אפופטוזיס. Assay כל הר Casp3 מותאם במיוחד עבור ניתוח של עוברים קבועים בין שלב 4 תאים ו32 HR-לאחר ההפריה והוא שימושי עבור מספר היישומים, כולל ניתוח של מוטציות וmorphants דג הזברה, ביטוי יתר של סוג הפראי שעבר מוטציה ו mRNAs, וחשיפה לכימיקלים. בהשוואה לכתמים כתומים acridine, אשר יכול לזהות תאים אפופטוטיים בעוברת לחיות בעניין של שעות, מבחני Casp3 וTunel ייקחו הרבה יותר זמן כדי להשלים (2-4 ימים). עם זאת, בשל האופי הדינמי של היווצרות תאים אפופטוטיים ואישור, ניתוח של תיקוןעוברי ed מבטיח השוואה מדויקת של תאים אפופטוטיים פני דגימות מרובות בנקודות זמן ספציפיות. יש לנו גם מצאתי assay Casp3 להיות עדיף על ניתוח של תאים אפופטוטיים ידי assay כל הר Tunel לגבי עלות ואמינות. בסך הכל, assay Casp3 מייצג assay חזק, מאוד לשחזור שבו כדי לנתח את התאים אפופטוטיים בעוברי דג הזברה מוקדמים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Denville Scientific | c2170 | Nonhazardous. Any similar 1.5 m plastic tubes will suffice. |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Nonhazardous. |
| a-activated-human-Caspase-3 antibody | Fisher Scientific | BDB559565 | May be harmful if inhaled or swallowed. |
| a-GFP monoclonal antibody (mouse) | Life Technologies | 33-2600 | May be harmful if inhaled or swallowed. |
| a-HuC/HuD human neuronal protein, mouse IgG2b, monoclonal 16A11 - UNCONJ | Life Technologies | A21271 | May be harmful if inhaled or swallowed. |
| Albumin, Bovine BSA Heat Shock Isolation | Amresco | CAS 9048-46-8 | Nonhazardous. Can also be purchased through Bioexpress: 0332-1006 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | Use at 1:200 dilution. May be harmful if inhaled or swallowed. |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21206 | Use at 1:200 dilution. May be harmful if inhaled or swallowed. |
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A10042 | Use at 1:200 dilution. May be harmful if inhaled or swallowed. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418 | Flammable. |
| Dumont #5 Inox Forceps (standard tips/straight) | Fine Science Tools | 11251-20 | Sharp! |
| FBS HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | SH3091003 | Nonhazardous. |
| Fisher Scientific Ocelot Rotator | Fisher Scientific | 05-450-21 | Any rotator with manual speed control is suitable. |
| Instant Ocean Aquarium Salt | Petco | 1373684 | Nonhazardous. |
| Methanol (acetone-free) | Sigma Aldrich | M1775 | Flammable: toxic by inhalation, ingestion and contact. |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0387-1006 | Nonhazardous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Flammable: toxic by inhalation, ingestion and contact. |
| Probe (Angled 80 Short/15.5cm/0.15mm tip diameter) | Fine Science Tools | 10140-02 | Sharp! |
| Pronase | Roche | 11459643001 | Nonhazardous. |
| Pyrex Spot Plate | Fisher Scientific | 13-748B | Nonhazardous. |
| Transfer Pipets, Samco general purpose | Thermo-Scientific | 204 | Nonhazardous. |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Irritant: harmful by ingestion or contact. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P7949 | Nonhazardous. Other brands include VWR #97063-872. |
References
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
- Eimon, P. M., et al. Delineation of the cell-extrinsic apoptosis pathway in the zebrafish. Cell Death Differ. 13, 1619-1630 (2006).
- Jette, C. A., et al. BIM and other BCL-2 family proteins exhibit cross-species conservation of function between zebrafish and mammals. Cell Death Differ. 15, 1063-1072 (2008).
- Kratz, E., et al. Functional characterization of the Bcl-2 gene family in the zebrafish. Cell Death Differ. 13, 1631-1640 (2006).
- Sidi, S., et al. Chk1 suppresses a caspase-2 apoptotic response to DNA damage that bypasses p53, Bcl-2, and caspase-3. Cell. 133, 864-877 (2008).
- Zhao, X., et al. Interruption of cenph causes mitotic failure and embryonic death, and its haploinsufficiency suppresses cancer in zebrafish. J. Biol. Chem. 285, 27924-27934 (2010).
- Yager, T. D., Ikegami, R., Rivera-Bennetts, A. K., Zhao, C., Brooker, D. High-resolution imaging at the cellular and subcellular levels in flattened whole mounts of early zebrafish embryos. Biochem. Cell Biol. 75, 535-550 (1997).
- Furutani-Seiki, M., et al. Neural degeneration mutants in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 229-239 (1996).
- Sorrells, S., et al. Ccdc94 Protects Cells from Ionizing Radiation by Inhibiting the Expression of p53. PLoS Genet. 8, (2012).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the developing zebrafish embryo. Dev. Biol. 240, 123-142 (2001).
- Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, 29-43 (1993).
- Beers Jr, R. F., Hendley, D. D., Steiner, R. F. Inhibition and activation of polynucleotide phosphorylase through the formation of complexes between acridine orange and polynucleotides. Nature. 182, 242-244 (1958).
- Delic, J., Coppey, J., Magdelenat, H., Coppey-Moisan, M. Impossibility of acridine orange intercalation in nuclear DNA of the living cell. Exp. Cell Res. 194, 147-153 (1991).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
- Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev. Biol. 227, 279-293 (2000).
