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Neuroscience

में लारवल दूध पिलाने सर्किट का कार्य विश्लेषण ड्रोसोफिला Published: November 19, 2013 doi: 10.3791/51062
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacological and Physiological Science, Saint Louis University School of Medicine

Summary

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा में खिला सर्किट भोजन दर में परिवर्तन stomatogastric तंत्रिका circuitry में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध किया जा करने की अनुमति देता है कि एक सरल अभी तक शक्तिशाली मॉडल कार्य करता है. इस सर्किट मुंह हुक करने के अनुमानों के साथ ही अग्रांत्र भेज कि केंद्रीय serotonergic न्यूरॉन्स से बना है.

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा में serotonergic खिला सर्किट सर्किट के विकास के दौरान महत्वपूर्ण महत्व के neuronal substrates की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सर्किट के कार्यात्मक उत्पादन का उपयोग, भोजन, stomatogastric प्रणाली के neuronal संरचना में परिवर्तन देखे जा सकते हैं. भोजन व्यवहार मस्तिष्क से तंत्रिका वितरण प्राप्त जो मुंह हुक, के त्याग की दर देख द्वारा दर्ज किया जा सकता है. लार्वा एक अगर सब्सट्रेट भर में पार करने के लिए उनके मुंह हुक उपयोग के बाद हरकत का व्यवहार, भोजन के लिए एक शारीरिक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. खिला व्यवहार में परिवर्तन neurites की axonal वास्तुकला के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता आंत innervating. Immunohistochemistry का प्रयोग यह इन परिवर्तनों के लिए कल्पना और quantitate संभव है. वे जोड़तोड़ करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं के रूप में व्यवहार मानदंड दौरान लार्वा के अनुचित हैंडलिंग डेटा बदल सकते हैं. Neurite वास्तुकला innervating के समुचित इमेजिंगपेट सटीक varicosities की संख्या और आकार के quantitation के साथ ही शाखा नोड्स की हद के लिए महत्वपूर्ण है. सबसे सर्किट का विश्लेषण केवल neurite वास्तुकला या व्यवहार प्रभाव के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन, इस मॉडल एक neuronal वास्तुकला में impairments के साथ सर्किट के कार्यात्मक उत्पादन सहसंबंधी अनुमति देता है.

Introduction

ड्रोसोफिला के कारण तेजी पीढ़ी समय, कम प्रयोगात्मक लागत, और आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों में हेरफेर और नियंत्रित करने की क्षमता के लिए तंत्रिका सर्किट विकास के अध्ययन के लिए एक अत्यंत शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. Neurogenesis, neuronal रास्ता खोजने और synaptogenesis मानव और ड्रोसोफिला के बीच संरक्षित कर रहे हैं, इसलिए बनाने को बनाए रखने और तंत्रिका सर्किट को संशोधित करने में तंत्र के रूप में अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं.

इस तरह सेरोटोनिन (5 hydroxytryptamine, या 5 हिंदुस्तान टाइम्स) के रूप में शास्त्रीय न्यूरोट्रांसमीटर, परिपक्व तंत्रिका सर्किट 1-3 में संकेतन अणुओं के रूप में अपनी भूमिका को अपनाने से पहले वृद्धि कारकों के रूप में काम कर सकते हैं पिछले अध्ययनों परिपक्व न्यूरॉन्स 4 की कनेक्टिविटी बदल embryogenesis दौरान 5 हिंदुस्तान टाइम्स के स्तर को परेशान दिखाई है. दूसरों सुसंस्कृत Helisoma न्यूरॉन्स के लिए 5 हिंदुस्तान टाइम्स के अस्थानिक आवेदन neurite परिणाम के साथ ही synaptogenesis 5-7 दबाने दिखाया है. डी मेंrosophila, विकासात्मक 5 हिंदुस्तान टाइम्स स्तर inversely सीएनएस 8 से अग्रांत्र को पेश neurites की लंबाई के साथ अपस्फीति संख्या और आकार, साथ ही aborization की डिग्री, से संबंधित हैं.

Serotonergic neurotransmission ड्रोसोफिला 8-9 सहित विविध प्रजातियों में खिला व्यवहार को व्यवस्थित करना दिखाया गया है. ड्रोसोफिला में खिला सर्किट अग्रांत्र को मस्तिष्क से axonal अनुमानों के विकास में परिवर्तन के साथ कार्यात्मक निर्गम (खिला) सहसंबंधी करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक अपेक्षाकृत सरल सर्किट है. Schoofs एट अल. ड्रोसोफिला लार्वा खिला मांसलता 10 प्रभाव है कि केंद्रीय पैटर्न जनरेटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि पता चला है. विशिष्ट पेशी शरीर रचना पूरी तरह से नहीं समझा गया है, जबकि यह स्पर्शतंतु तंत्रिका, दाढ़ की हड्डी का तंत्रिका, और prothoracic गौण तंत्रिका में शामिल पेशी लक्ष्यों के लिए जिम्मेदार हैं दिखाया गया है किव्यवहार खिला. दब्बू खिलाने की मांसलता और तंत्रिका शरीर रचना को शामिल अधिकांश डेटा कैलीफोरा लार्वा तक सीमित है.

दूसरी instar लार्वा का भोजन दर cephalopharyngeal sclerites (मुंह हुक) का त्याग करके मूल्यांकन, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च throughput है किया जा सकता है. cephalopharyngeal प्लेटें ललाट तंत्रिका के माध्यम से केंद्रीय 5 हिंदुस्तान टाइम्स न्यूरॉन्स से तंतुओं द्वारा innervated हैं. proventriculus, या अग्रांत्र, आद्यमध्यांत्र में स्तबकमय और चित्रा (1) 11-12 अग्रांत्र के संकुचन के लिए जिम्मेदार हैं कि serotonergic फाइबर (तंत्रिका recurrens) द्वारा innervated है. Axonal शाखाओं में परिवर्तन, और neurite लंबाई के साथ varicosities की संख्या और आकार, immunohistochemical तकनीक का उपयोग कर quantitated किया जा सकता है. प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से, विकास के दौरान neuronal 5 हिंदुस्तान टाइम्स से छेड़छाड़ morpholo में परिवर्तन के साथ मूल्यांकन और सहसंबद्ध किया जा सकता है जो इस खिला सर्किट के कार्यात्मक उत्पादन, बदल सकते हैंneurite वास्तुकला की GY.

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Protocol

1. जनसंख्या पिंजरों का रखरखाव

  1. एक 12 घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र पर 25 डिग्री सेल्सियस पर जनसंख्या पिंजरों बनाए रखें. जब तक नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों में एक ही प्रकाश व्यवस्था की स्थिति को उजागर कर रहे हैं, तो इस तकनीक का एक मानक प्रयोगशाला स्थापित करने में किया जा सकता है.
  2. महिलाओं सेब का रस अगर प्लेटों पर रात भर अंडे देना करने की अनुमति दें.
  3. 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर नव जमा अंडे के साथ प्लेटें बनाए रखने के द्वारा नव रची लार्वा लीजिए. रची लार्वा को आकर्षित करने के लिए थाली के केंद्र में खमीर की एक छोटी टूकड़ा रखें.
  4. सेब का रस प्लेट के केंद्र में खमीर पेस्ट में स्थानांतरित किया है कि 1 सेंट instar लार्वा लीजिए. एक ताजा सेब का रस प्लेट को हस्तांतरण करने के लिए एक धातु रंग का प्रयोग करें. अतिरिक्त खमीर पेस्ट assays के प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक पर्याप्त भोजन नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा जा सकता है. अंगूर का रस प्लेटें भी सेब का रस प्लेटों के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है.
  5. देर से 2 एन डी जल्दी 3 instar एल प्राप्त1 सेंट 40-48 घंटे के लिए उम्र के लिए instars अनुमति देकर arvae. इस सीमा के भीतर खिला दरें 13 लगातार कर रहे हैं. प्रत्येक लार्वा गिरना साथ इस संरचना में विशिष्ट परिवर्तन के रूप में वहाँ आयु मुंह हुक की परीक्षा से इसकी पुष्टि की जा सकती है.
  6. देर से 2 एन डी जल्दी 3 instar लार्वा धीरे और बड़े पैमाने पर पानी के साथ सेब का रस प्लेटें धोने और एक जाल फिल्टर पर लार्वा को इकट्ठा करके व्यवहार assays के लिए एकत्र होते हैं. लार्वा तो एक अगर प्लेट को हस्तांतरित कर रहे हैं.
  7. सभी विश्लेषण नियंत्रण और प्रयोगात्मक पशुओं का उपयोग समानांतर में प्रदर्शन कर रहे हैं.

2. व्यवहार प्रतिमान - हरकत

  1. एक 100 मिमी टिशू कल्चर पकवान में एक 2% अगर सब्सट्रेट पर एक भी 3 instar लार्वा प्लेस और लार्वा 30 सेकंड के लिए acclimate करने के लिए अनुमति देते हैं. लार्वा अगर सब्सट्रेट की सतह भर में अपने शरीर को प्रेरित करने के लिए उनके cephalopharyngeal sclerites (मुंह हुक) का उपयोग करें. यह एक अलग प्लेट पर किया जाता है क्योंकि मैंटी जानवर लगभग खमीर के रूप में एक ही रंग के रूप में खमीर समाधान में शरीर संकुचन कल्पना करना मुश्किल है.
  2. 1 मिनट की अवधि के लिए सब्सट्रेट पर पूर्वकाल आंदोलन करने के लिए प्रत्येक पीछे निरीक्षण करें और रिकॉर्ड. n = प्रत्येक जीनोटाइप के लिए 20. कोई 10 से अधिक जानवरों की थाली प्रति assayed किया जाना चाहिए.

3. व्यवहार प्रतिमान - दूध पिलाने

  1. कुंद आइनॉक्स # 5 चिमटी का प्रयोग, ध्यान से 2% सक्रिय बेकर की खमीर समाधान के 5 मिलीलीटर से मढ़ा एक अग्रवाल भरी थाली के केंद्र के लिए हरकत अगर थाली से 3 instar लार्वा हस्तांतरण. खमीर समय के साथ निपटा जाएगा के रूप में समाधान समरूप है कि सुनिश्चित करें. जब खमीर समाधान में, लार्वा बड़े पैमाने पर व्यवहार के अवलोकन की सुविधा, जगह और चारा में रहेगा. मुंह हुक संकुचन की दर सीधे 14 भोजन किया जाता है की राशि के साथ संबद्ध करता है.
  2. लार्वा 30 सेकंड के लिए acclimate करने की अनुमति दें.
  3. निरीक्षण और की संख्या रिकॉर्ड1 मिनट की अवधि के लिए मुंह हुक संकुचन. n = प्रत्येक जीनोटाइप के लिए 20.

4. लार्वा आंत Dissections

  1. एक 3 अच्छी तरह से हाजिर गिलास में 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और जगह में एक 4% ईएम ग्रेड formaldehyde निर्धारण समाधान करें.
  2. ध्यान से, 1x पीबीएस समाधान का उपयोग कर एक 3 अच्छी तरह से कांच डिश में देर से 3 instar लार्वा हिम्मत भटक proventriculus बरकरार रह गया है यह सुनिश्चित करें कि हर बार बनाने काटना. एक forcep के साथ, पीछे अंत पकड़, और अन्य के साथ, मुंह हुक पकड़. पीछे अंत स्थिर धारण करते हुए, धीरे हिम्मत तक पहुँच प्राप्त करने के लिए मुंह के हुक पर पुल. किसी भी जुड़े ऊतकों (लार ग्रंथियों, मस्तिष्क, शरीर में वसा, आदि) निकालें, तो formaldehyde तय युक्त 3 अच्छी तरह से डिश के लिए प्रत्येक पेट हस्तांतरण. 3 instar लार्वा भटक क्योंकि विकास के इस स्तर पर, लार्वा pupariation के लिए तैयारी में खिलाने के लिए संघर्ष किया जाता है, और proventriculus खमीर की मंजूरी दे दी है.
    3. <ली> एक अपारदर्शी टिशू कल्चर बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर हिम्मत सेते हैं.
  3. कुओं से formaldehyde निर्धारण समाधान निकालने से पहले, गैस्ट्रिक caeca हटाने और अनुमानों स्पष्ट रूप से बाधा के बिना देखा जा सकता है कि इतने proventriculus से ~ 150 माइक्रोन 2 आद्यमध्यांत्र क्लिप.
  4. कुओं से formaldehyde तय निकालें और 1x पीबीटी (1x पीबीएस, 0.1% प्रोटीज मुक्त गोजातीय सीरम albumin, 0.1% ट्राइटन X-100) बफर समाधान के साथ बदलें. अच्छी तरह 1x पीबीटी में 10 मिनट के लिए हिम्मत 6x धो लो. Washes कर रही है जबकि एक यांत्रिक रोटेटर पर ऊतकों के नमूनों रखें.
  5. 10 -6 एम सेरोटोनिन संकेतन बढ़ाने के लिए 5 हिंदुस्तान टाइम्स में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. अच्छी तरह 1x पीबीटी में 10 मिनट के लिए हिम्मत 6x धो लो. पिछले अध्ययनों एक्सोजेनस 5 हिंदुस्तान टाइम्स की इस एकाग्रता immunohistochemical विश्लेषण में neuronal वास्तुकला या अपस्फीति घनत्व को प्रभावित नहीं करता है कि प्रदर्शन और बस शोर अनुपात 15-16 के लिए संकेत बढ़ाता है.
  6. 4 सेते हैं और# 176; सी रातोंरात विरोधी सेरोटोनिन प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस या खरगोश में उठाया पॉलीक्लोनल में उठाया मोनोक्लोनल) में. अच्छी तरह 1x पीबीटी में 10 मिनट के लिए हिम्मत 6x धो लो. Washes कर रही है जबकि एक यांत्रिक रोटेटर पर ऊतकों के नमूनों रखें.
  7. (; 1:400 कमजोर पड़ने एलेक्सा Fluor 568 बकरी विरोधी माउस या विरोधी खरगोश आईजीजी) माध्यमिक एंटीबॉडी में 90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. अच्छी तरह 1x पीबीटी में 10 मिनट के लिए हिम्मत 6x धो लो. Washes कर रही है जबकि एक यांत्रिक रोटेटर पर ऊतकों के नमूनों रखें.
  8. एक यांत्रिक रोटेटर पर 10 मिनट के लिए 4 मिमी सोडियम कार्बोनेट में सेते हैं, तो N-propyl gallate/20 मिमी सोडियम कार्बोनेट 4% में माउंट, और प्रतिदीप्ति के तहत देखें. सोडियम कार्बोनेट mountant मीडिया में इस्तेमाल किया बफर और पीएच के लिए नमूने कन्वर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  9. विश्लेषण के लिए 400X बढ़ाई immunostained ऊतकों के नमूनों की छवियों पर कब्जा.

5. तंत्रिका circuitry का विश्लेषण

  1. Neurite फाइबर (मात्रा निर्धारित किया गया नंबर और varicosities का आकारऔर शाखाओं में बंटी की डिग्री) Neuroleucida और Neuroexplorer का उपयोग कर. बहरहाल, यह भी मैन्युअल रूप से पूरा या सरल neurite अनुरेखक (ऑनलाइन डाउनलोड किया जा सकता है कि एक स्वतंत्र अनुप्रयोग) का उपयोग किया जा सकता है.
  2. Proventriculus को मस्तिष्क से व्यक्तिगत फाइबर अनुमानों ट्रेस और अपस्फीति संख्या, शाखाओं और इकाई लंबाई प्रति बड़ी varicosities की संख्या यों. मस्तिष्क से पेश axonal फाइबर recurrens तंत्रिका में बंडल और वे अलग जहां proventriculus और स्तबकमय जब तक विश्लेषण के लिए सुलभ नहीं हैं.

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Representative Results

ड्रोसोफिला लार्वा में serotonergic खिला सर्किट तंत्रिका तंत्र के विकास पर विशेष कारकों के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए एक अत्यंत प्रभावी मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं. भोजन दर quantitating करके, यह अपने कार्य निर्गम (चित्रा 1) के साथ खिला सर्किट की axonal वास्तुकला से जोड़ने के लिए संभव है. लार्वा अगर की सतह भर में खुद को प्रेरित करने के लिए उनके मुंह हुक उपयोग के बाद हरकत परख, मुंह हुक के retractions के लिए एक शारीरिक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. म्यूटेशन ही खिला सर्किट 8 (2A चित्रा) को प्रभावित अगर नियंत्रण और उत्परिवर्ती जीनोटाइप के बीच हरकत प्रतिक्रियाओं में कोई अंतर नहीं होना चाहिए. महत्वपूर्ण मतभेद होते हैं, तो यह लार्वा व्यवहार अनुचित हैंडलिंग से समझौता किया गया था संभव है. परख के दौरान लार्वा स्टॉप अगर सब्सट्रेट के माध्यम से बिल के लिए प्रयास करने के लिए करते हैं, वे बहुत पुराना हो सकता है, और संभावना instars भटक करने के लिए परिवर्तित कर रहे हैं.यह अगर सब्सट्रेट यह मुश्किल लार्वा मुंह हुक अगर सब्सट्रेट हड़पने के लिए कर रही है, इस प्रकार, बहुत कठिन हो सकता है यह भी संभव है, यह अगर सतह गीला द्वारा संबोधित किया जा सकता है.

यह परख neuronal शारीरिक दोष के साथ ड्रोसोफिला उपभेदों serotonergic खिला सर्किट के विकास को प्रभावित आकलन है कि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. खुले उत्परिवर्ती दीर्घवृत्ताभ शरीर (EBO 3) केंद्रीय परिसर के दीर्घवृत्ताभ शरीर में एक संरचनात्मक दोष है. जंगली प्रकार पैतृक गुआंगज़ौ एस तनाव, सीएस वू के साथ तुलना करें, इन संरचनात्मक दोषों उदास खिलाने में मस्तिष्क के विकास परिणाम दौरान हरकत चित्रा (2 बी) अप्रभावित है कि जब तक पता चलता है.

3 म्यूटेंट पेट की neurite वास्तुकला के विकास को बदलने के लिए प्रकट EBO में संरचनात्मक दोषों. चित्रा 3 EBO 3 लार्वा कंपनियों में फाइबर संरचना में परिवर्तन से पता चलता हैसीएस वू के साथ लाल, ये लार्वा शाखाओं में बंटी में वृद्धि के साथ ही neurite लंबाई के साथ दोनों छोटे और बड़े varicosities की संख्या में वृद्धि प्रदर्शित करते हैं. शाखा नोड्स (तीर) नोट (तीर), और बड़े varicosities (तारक) varicosities. चित्रा 4 इन छवियों के quantitation का प्रतिनिधित्व करता है.

Axonal वास्तुकला का उचित quantitation छवियाँ. चित्रा 5A विश्लेषण के लिए उपयुक्त एक छवि का प्रतिनिधित्व करता है अत्यंत स्पष्ट होने की आवश्यकता है. गरीब गुणवत्ता की छवियों यह मुश्किल फाइबर और varicosities (चित्रा 5 ब) के बीच भेद करने के लिए कर देगा. फाइबर वास्तुकला जब photographing, फाइबर कस बंडल हैं और एक दूसरे से अलग कर रहे हैं और वे branched रहे हैं, हालांकि के रूप में प्रकट हो सकता है के बाद से proventriculus के पूर्वकाल में अनुमानों, शामिल है कि छवियों को लेने से बचें. वे स्तबकमय क्योंकि आद्यमध्यांत्र भीतर अधिक पश्च फाइबर अधिक branched रहे हैं एक बार वे एक इस ऊतक के भीतर में फिर से. शाखा और अपस्फीति संख्या, और varicosities के आकार के quantitation, स्वयं या ऐसे Neuroleucida रूप neurite आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के उद्देश्य के लिए बनाया गया एक कार्यक्रम के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है. जब तक proventriculus immunohistochemical प्रोटोकॉल के दौरान क्षतिग्रस्त, और छवि को ध्यान में नहीं है, जैसा कि तैयारी इमेजिंग और विश्लेषण के लिए स्वीकार्य होगा. फाइबर वास्तुकला स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि से अलग पहचाना है, और व्यक्तिगत varicosities neurite लंबाई के साथ पहचाना जा सकता है, तो तैयारी विश्लेषण के लिए उपयुक्त है. व्यक्तिगत varicosities फाइबर के बाकी हिस्सों से पहचाना जा सकता है इसके अलावा, अगर, यह भी विश्लेषण के लिए एक गुणवत्ता छवि का एक और संकेत है. सभी फाइबर उन के अपवाद के साथ विश्लेषण कर रहे हैं कि ध्यान की रेंज (फोकस के कई विमानों के बीच कुछ मामलों में फाइबर होगा वक्र) के बाहर.

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चित्रा 1. लार्वा खिला सर्किट. मस्तिष्क और आंत ऊतकों (ए) दिखा 3 instar लार्वा की एक पट्टिका. 3 instar लार्वा से विच्छेदित आंत ऊतकों ड्रोसोफिला neuronal tryptophan hydroxylase के खिलाफ उठाए गए एक एंटीबॉडी के साथ immunostained गया (DTRH, बी) या 5 हिंदुस्तान टाइम्स ( सी). ए, बी. ई, घेघा, महाराष्ट्र, मुंह हुक, पीआर, proventriculus, बी आर, मस्तिष्क (5 हिंदुस्तान टाइम्स न्यूरॉन्स के पैटर्न पर ध्यान दें). Arrowhead ललाट तंत्रिका designates;., Recurrens तंत्रिका सी तीर. proventriculus axonal फाइबर (तीर) दिखा. स्केल बार = 20 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2 <br /> चित्रा 2. उदास खिला व्यवहार में मस्तिष्क के विकास के परिणाम के दौरान शारीरिक दोष. जानवरों हरकत (ए) और खिला व्यवहार (बी) के लिए assayed थे. हरकत अप्रभावित रहा था. एन = 2-3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्रत्येक व्यवहार परख के लिए 20,. **** पी <0.0001, unpaired टी परीक्षण. ग्राफ ऊपर लाइनों मतलब की मानक त्रुटि को दर्शाती है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. पेट फाइबर वास्तुकला में विपथन में सीएनएस परिणाम 3 instar लार्वा से विच्छेदित और विरोधी 5 हिंदुस्तान टाइम्स के साथ immunostained. आंत ऊतक के विकास के दौरान शारीरिक दोष. तीर शाखा नोड अर्थ. Arrowhead एक छोटे अपस्फीति अर्थ. Asterisk डेबड़े अपस्फीति नोटों. स्केल बार = 40 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. न्यायपालिका पेट फाइबर वास्तुकला विच्छेदित और विरोधी 5 हिंदुस्तान टाइम्स के साथ incubated 3 instar लार्वा से proventricular ऊतक की. विश्लेषण में मस्तिष्क के विकास परिणाम दौरान शारीरिक दोष. 0.1 मिमी neurite लंबाई (बी) और बड़े varicosities की संख्या प्रति कुल varicosities की neurite (ए) शाखाओं में बंटी, संख्या (> 1μm 2) 0.1 मिमी लंबाई (सी) के अनुसार. सीएस वू, 2 स्वतंत्र प्रयोगों से 17 हिम्मत से 20 फाइबर, EBO 3, 3 स्वतंत्र प्रयोगों से 18 हिम्मत से 20 फाइबर. **** पी <0.0001, ** पी <0.01, * पी <0.05, unpaired टीटीग्राफ ऊपर अनुमान लाइन्स मतलब की मानक त्रुटि को दर्शाती है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. छवियों की गुणवत्ता पेट फाइबर वास्तुकला का उचित quantitation के लिए महत्वपूर्ण है. सीएस वू 3 instar लार्वा से विच्छेदित और विरोधी 5 हिंदुस्तान टाइम्स के साथ immunostained आंत ऊतकों. (ए). अच्छी गुणवत्ता छवि. (बी). खराब गुणवत्ता छवि. स्केल बार = 40 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

देर embryogenesis दौरान होता है जो serotonergic stomatogastric सर्किट, की न्यायपालिका विकास, इसके परिपक्व समारोह को प्रभावित करेगा. Neurite संरचना में परिवर्तन आंत (एक खमीर समाधान में मुंह हुक संकुचन से मापा) दर खिला है, जो सर्किट के कार्यात्मक उत्पादन, चित्रा (1) के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता innervating. ड्रोसोफिला में यूएएस Gal4 द्विपक्षीय प्रणाली का उपयोग यह संभव विशेष रूप से एक विशिष्ट ऊतकों को एक दिया प्रतिलेख के ऊपर या नीचे विनियमित अभिव्यक्ति लक्ष्य बनाता है, किसी दिए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन ठीक उपयुक्त उपकरण दिए quantitated किया जा सकता है. इस तकनीक मस्तिष्क क्षेत्रों, और एक विशिष्ट तंत्रिका सर्किट के विकास के लिए आवश्यक भी neuronal सबसेट को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हरकत परख लार्वा अन्यथा physiologically समझौता नहीं कर रहे हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इसलिए 40 शरीर दीवार संकुचन या कम थानेदार के साथ लार्वाuld विश्लेषण (2A चित्रा) से बाहर रखा जाना. जीनोटाइप शारीरिक असामान्यताएं का कारण बनता है, क्योंकि या व्यक्ति पशुओं से निपटने के दौरान घायल हो गए हैं, क्योंकि यह या तो हो सकता है. इसके अलावा, परख प्रदर्शन किया है, जिसमें कमरे के तापमान कूलर या गर्म तापमान डेटा को प्रभावित कर सकते हैं, जब से नियंत्रित किया जाना चाहिए. यह 24-26 डिग्री सेल्सियस के बीच इस व्यवहार परख प्रदर्शन करने की सिफारिश की है परीक्षण के कमरे के तापमान कूलर है जब दिन पर, अगर कड़ा करने की प्रवृत्ति है, प्रत्येक लोकोमोटिव परख अगर पर्याप्त नरम है यह सुनिश्चित करने के पूर्ण होने के बाद इसलिए, अगर प्लेट की rewetting आवश्यक हो जाएगा. यह लार्वा सतह भर में यात्रा करने के लिए और बिल खोदने से रोकने के लिए उन्हें अनुमति देने के लिए हरकत नम (गीला नहीं) के लिए अगर प्लेट रखने के लिए महत्वपूर्ण है. लार्वा तरजीही तापमान (24-26 डिग्री सेल्सियस) 17-18 की ओर यात्रा करते हैं के रूप में कूलर तापमान भी, अगर सब्सट्रेट पर लार्वा के प्रदर्शन को प्रभावित. एनओ 10 से अधिक जानवरों की थाली प्रति assayed, और अगर सब्सट्रेट में punctures के साथ किसी भी थाली त्यागने की जानी चाहिए.

खिला परख प्रदर्शन करते हैं, तो यह खमीर निलंबन समय के साथ निपटा जाएगा कि जानकारी होना जरूरी है, थाली पर खमीर घूमता खमीर परख भर समरूप रहता है सुनिश्चित करता है. खमीर समाधान भी केंद्रित हो जाता है, तो मुंह हुक से कम दृश्यता हो सकता है. खमीर मीडिया अनुबंध मिनट प्रति उनके मुंह हुक लगभग 150-170 बार में रखा स्वस्थ लार्वा, कम खिला 120 जितनी कम किया जा सकता है, और ऊपरी सीमा सीमा 210 है.

Immunohistochemical प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं, तो यह ऊतकों के नमूनों की समान गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण और समानांतर में प्रयोगात्मक ऊतकों के नमूनों दोनों immunostain बुद्धिमान है. Neurite वास्तुकला innervating पेट की Immunofluorescence 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी में ऊतक के नमूने incubating द्वारा बढ़ाया जा सकता है ऊष्मायन ओच 4 डिग्री सेल्सियस एंटीबॉडी शोर अनुपात संकेत (चित्रा 5) में सुधार. इस फाइबर वास्तुकला के सटीक quantitation शाखाओं में बंटी और अपस्फीति संख्या और आकार (चित्रा 4) में परिवर्तन प्रकट करने के लिए (चित्रा 3) के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में छवियों की गुणवत्ता बहुत महत्वपूर्ण है. वॉशिंग अवधि के दौरान इस्तेमाल किया रोटेटर निरंतर उपयोग से किसी भी बिंदु पर गरमा अगर ऊतकों के नमूनों की गुणवत्ता को नष्ट किया जा सकता है. इमेजिंग जबकि ऊतक के नमूने इस नमूने को वर्तमान में ध्यान केंद्रित करने के तहत एक, लेकिन साथ ही आसपास के नमूने न केवल की immunofluorescence कम हो जाएगा के रूप में भी लंबे समय के लिए माइक्रोस्कोप प्रकाश के तहत नमूने छोड़ नहीं करना सुनिश्चित करें. फाइबर वास्तुकला का विश्लेषण आसानी से सॉफ्टवेयर की सहायता से पूरा किया जा सकता है, लेकिन अभी भी मैन्युअल रूप से पूरा किया जा सकता है. छोटे और बड़े varicosities का वर्गीकरण varicosities के क्षेत्र का उल्लेख है, अधिक से अधिक से अधिक 1 माइक्रोन 2 मापने varicosities बड़े varicosities के रूप में वर्गीकृत किया जाता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों डब्लूएसएन को सम्मानित किया सेंट लुई विश्वविद्यालय से राष्ट्रपति के रिसर्च फंड स्वीकार करना चाहते हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eclipse E-800 Microscope Nikon Instruments
Neuroleucida MBF Biosciences NL-15 Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have
Northern Eclipse Empix Inc Imaging software
G-2E/C TRITC EX 528-553 Nikon Instruments 96312 Filter for specific secondary antibody
N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded Nikon Instruments MRH00400 Objective used for imaging
Simple Neurite Tracer NIH Image J http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S.… More

Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e51062, doi:10.3791/51062 (2013).

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