Summary
توضح هذه الورقة كيف يمكن أن يجمد على الزرد الكبار، مدخل أنبوب، وتستخدم لفي التجارب المجراة الكهربية للسماح التسجيلات والتلاعب في النشاط العصبي في حيوان سليمة.
Abstract
سابقا، دراسات الكهربية في الزرد الكبار اقتصرت على شريحة الاستعدادات أو لاستعدادات كأس العين والتسجيلات electrorentinogram. توضح هذه الورقة كيف يمكن أن يجمد على الزرد الكبار، مدخل أنبوب، وتستخدم لفي التجارب المجراة الكهربية، مما يتيح تسجيل النشاط العصبي. تجميد الكبار يتطلب آلية لتقديم الأكسجين الذائب إلى الخياشيم بدلا من الحركة والشدق وصادي. مع أسلوبنا، ويجمد الحيوانات ومع perfused المياه الموائل للوفاء بهذا المطلب. يتم إجراء حج القحف تحت تريكين methanesulfonate (MS-222؛ تريكين) التخدير لتوفير الوصول إلى الدماغ. ثم يتم وضع القطب الأساسي ضمن إطار حج القحف لتسجيل نشاط المخ خارج الخلية. من خلال استخدام نظام نضح multitube، ومجموعة متنوعة من المركبات الدوائية يمكن أن تدار على الأسماك الكبار وأي تعديلات في النشاط العصبيويمكن ملاحظة. المنهجية لا يسمح للالملاحظات إلى أن تتخذ بشأن التغيرات في النشاط العصبي، ولكنه يسمح أيضا لإجراء مقارنات بين اليرقات والزرد الكبار. وهذا يعطي الباحثين القدرة على تحديد التغيرات في النشاط العصبي نتيجة لإدخال مركبات مختلفة في مراحل الحياة المختلفة.
Introduction
في هذه المقالة، يوصف بروتوكول للحصول على التسجيلات في الجسم الحي من النشاط العصبي في الزرد الكبار. وتستخدم أساليب تسجيل خارج الخلية، وتوفير قياسات الجهد من النشاط الكهربائي داخل منطقة صغيرة من الأنسجة العصبية. هذا الأسلوب من التحقيق ينطوي على رصد عدد كبير من الخلايا في حيوان يتصرف 1. سابقا، وقد أجريت تسجيلات شريحة في كل من البالغين واليرقات، وكذلك الاستعدادات كوب العين والتسجيلات مخطط كهربية الشبكية. إلى حد كبير تم تنفيذ هذه التجارب بالتفاصيل الاستجابات الفسيولوجية لمختلف الأنظمة الحسية 2-5. حتى وقت قريب، كانت الاستعدادات الدماغ سليمة متوفرة لأداء الكهربية مع الزرد 3،6،7 يرقة، حيث يمكن أن يحدث التنفس والأوكسجين نشرها من خلال الجلد فقط. إعداد لدينا يسمح النشاط عصبية الأم من الزرد الكبار أن تقاس بينما يبقى حيوان واعية تماما ومدركة سو محيطها.
الزرد (دانيو rerio) تلعب حاليا دورا أساسيا بوصفها نموذجا للدراسات الجينية، السمية، الدوائية، وphysiopathological 3. اكتسبت الزرد الرؤية ضمن مجال علم الأعصاب لأنها تناظر مشاركة مكثفة مع الثدييات في الوراثية، والغدد الصماء العصبية مستويات 8. على مدى العقد الماضي، وقد استخدمت تقنيات neuroanatomic والمناعى لتحديد معيار المنظمة مميزة مفصلة للجهاز العصبي الزرد 9-12 وتوزيع الناقلات العصبية المختلفة 3،8،13. في الآونة الأخيرة، تحولت الباحثين التركيز على الدراسات الفنية 14،15، وكثير منها تركز على العمليات السلوكية والخصائص الكهربية 16-19 من أنظمة حسية 2،13،20. وركزت وهناك عدد قليل من هذه الدراسات على النشاط الكهربائي للمناطق معينة من أدولر الدماغ الزرد 21-23، ولكن لم تنفذ باستخدام نهج في الجسم الحي.
هذا البروتوكول يمكن تكييفها للدراسات الكهربية في كل من النشاط العفوي والمسموعة داخل الجهاز العصبي الزرد لوصف أنماط النشاط في مناطق محددة في الدماغ. استخدام هذه التقنية تتيح إجراء مقارنات بين النشاط العصبي من مراحل اليرقات والبالغين الشباب. علاوة على ذلك، يسمح بروتوكول لدينا مقارنات بين تعديلات وراثية أو الدوائية. جنبا إلى جنب مع المناهج الأخرى، مثل الهندسة الوراثية أو الاختبارات الدوائية، وهذه الطريقة توفر إمكانية جديدة لتحليل وظيفي للاتصال الخلايا العصبية واللدونة في حيوان بالغ سليمة فضلا عن التطبيقات المحتملة، مثل دراسة أواخر الصرع أو بداية العمليات الاعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت كافة الإجراءات التجريبية وفقا صارمة مع المعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ويتبع بروتوكول # A2011 09-003، التي تم فيها استعراض وافق، وتشرف عليها جامعة جورجيا المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
1. إعداد المعدات
- نظام الارواء عن حج القحف
تجميد الكبار يتطلب نظام التنبيب لتسليم الأوكسجين المذاب للأسماك. مجموعة متنوعة من أنظمة يمكن استخدامها، ولكن يستخدم نظام الجاذبية بسيطة تتكون من حقنة 60 مل. رفع رأسه إلى ارتفاع الضغط يمكن أن ينتج باستمرار معدل تدفق ~ 1 مل / دقيقة. يمكن وضع هذه الحقنة في سلسلة مع المحاقن التي تستخدم بعد ذلك لنظام نضح الكهربية.- الحصول على واحدة 60 مل يور قفل أنبوب حقنة وإزالة المكبس.
- تعليق الحقنة حوالي 8 في و# 160؛ فوق قاعدة من موقف حلقة باستخدام المشبك.
- توصيل محبس في اتجاه واحد إلى نهاية الحقنة. إلى الطرف الآخر من محبس، وربط قطعة من الأنابيب، 2 مم في القطر، وهي فترة كافية لتمتد إلى قاعدة التنبيب.
- نظام الارواء للالكهربية
للتجارب الكهربية، فمن الضروري في كثير من الأحيان لتقديم مجموعة متنوعة من المركبات أثناء تجربة. هي مجموعة متنوعة من النظم المتاحة، ولكن نظام الجاذبية التي تتكون من 60 مل المحاقن في سلسلة يمكن استخدامها. هذا الإعداد يسمح بسيطة، مقدمة المسلسل من الحلول التي يتعين الاضطلاع بها عن طريق فتح محبس المقابلة.- الحصول على اثنين أو أكثر من 60 يور مل المحاقن القفل وإزالة الغطاسون من كل. مطلوب واحد حقنة لإدارة المياه الموائل للأسماك في حين أن كل أنبوب لاحقة يمكن استخدامها لإدارة مجموعة متنوعة من المركبات الدوائية للأسماك.
- ربط كل حقنة ل3 -طريقة محبس مع اتصال ليور.
- استخدام ⅛ في القطر الخارجي (OD) أنابيب لتوصيل الحقن في سلسلة مع قفل يور الذكور على نهاية واحدة.
- تأمين الجهاز من النوع الذي رأسه هو ارتفاع الضغط إلى ارتفاع 27 في فوق قاعدة، أو يمكن أن ينتج باستمرار ارتفاع معدل تدفق ~ 1 مل / دقيقة.
- التنبيب قنية
قنية التنبيب يسهل إدخال السوائل للأسماك. يوفر هذا الإعداد كلا من المرونة والحزم لأفضل موقف قنية داخل فم الحيوان.- باستخدام أي زوج من مقص العامة (على سبيل المثال. FISKARS) أو شفرة حلاقة، إزالة القسم 1.5 سم من نهاية واسعة من طرف ماصة P-200.
- إدراج 6 سم × 1 مم قطعة من الأنابيب في صمام تخفيض مع الإناث يور غطاء قفل والسيليكون الطويق، أي محول Tuohy بورست، وإدراج هذه قنية في تلميح ماصة تعديل. عقد غيض ماصة في موقف مع يور لاوك استخدام جزء قصير من ⅛ في قطر الأنبوب.
الشكل 1
- قاعدة التنبيب
ويستخدم هذا الطبق لعقد الحيوان يجمد في موقف مستقر وتستقيم لتسهيل إزالة السوائل دخول الحيوانات من خلال التنبيب. إذا كان هذا لا يتم تأسيس بشكل صحيح، يمكن أن يحدث تجمع، مما يؤدي إلى إشارات الذبذبات تدخلا في تسجيل الكهربية.- الحصول على طبق قاعدة من طبق بتري 100 ملم × 15 ملم من البلاستيك.
- باستخدام أداة لحام، وتذوب حفرة، 6 مم وقطرها 7.5 ملم تحت الشفة من الحافة، إلى جانب الطبق. باستخدام نفس الأداة، تذوب حفرة، و 10 ملم في القطر و 11 ملم تحت الشفة من الطبق ~ 74 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة من ثقب أصغر. وهذا الثقب بمثابة حفرة الصرف الصحي.
- إدراج أنبوب، رفعت 1 سم في القطر، في حفرة مع نهاية هذا أن نهاية لا يمكن حجبها. ثم إدراج غيض P-200 Pipetteman في حفرة صغيرة، وهذا سيكون بمثابة قنية وهمية.
- مع طبق بتري مرتفعة قليلا على جانب الحفرة أكبر، صب الشمع المنصهر التعليب في طبق بحيث يتم تغطية الحفرة قنية فقط. فإن المنطقة بمثابة وقف، والسماح للقنية لإدراجها ~ 3 مم في فم السمكة. وينبغي أن يسمح هذا الإعداد لترسيخ.
- باستخدام معدن الحافة ساخنة اللهب، نحت قناة لعقد الأسماك بحيث تبدأ القناة من غيض من قنية ويمتد حوالي 1-2 فيه.
- ويجب اتخاذ الحذر لضمان أن زاوية الهبوط المستمر من منطقة قنية إلى ميناء الصرف يتم تشكيلها.065fig2.jpg "العرض =" 400px "/>
الرقم 2
- ويجب اتخاذ الحذر لضمان أن زاوية الهبوط المستمر من منطقة قنية إلى ميناء الصرف يتم تشكيلها.065fig2.jpg "العرض =" 400px "/>
- الإعداد التروية
- قبل البداية، تدفق نضح مجموعة عمليات بالماء الموائل، وضمان أن تتم إزالة جميع فقاعات الهواء.
- إضافة ~ 30 مل من 0.016٪ (630 ميكرومتر) حل تريكين إلى الإعداد حج القحف نضح والسماح ~ 2 مل لتشغيل من خلال أنابيب لضمان أن يتم تسليم تريكين للحيوان عند بدء نضح. راجع الخطوة 2.2 للتخفيف.
- إلى الإعداد نضح الرئيسي، إضافة ~ 50 مل من الماء الموائل إلى الأنبوب الأول. إضافة أي مركبات التجريبية المطلوب لكل من أنابيب المتبقية.
- وضع الإعداد قنية في حفرة صغيرة من قاعدة التنبيب.
- تحريف 1 في الشريط واسعة من 42 سم Kimwipe في دوامة ضيق وأدخله في أنبوب الصرف الصحي بحيث Kimwipe يمتد على كلا الجانبين. وهذا النسيج بمثابة الفتيل لإزالة السائل perfused ومنع تراكم السوائل داخل رانه التنبيب قاعدة، والتي يمكن أن تتداخل مع تسجيل الكهربية.
- إدراج واحدة من نهاية الأنبوب في حفرة كبيرة من طبق بيتري، مما يسمح الطرف الأدنى لتمتد إلى طبق الخاملة التي هي كبيرة بما يكفي لجمع كل النفايات الارواء. وهذا الطبق بمثابة خزان للتدفق الإعداد. وضع الأنسجة بحيث نهاية واحدة ستقع بالقرب من منطقة البطن الحيوان ويمكن تمديد أقل بالتنقيط في طبق.
- وضع هذه القاعدة التنبيب الانتهاء بالقرب من مجهر تشريح. ربط قفل يور من قنية إلى أنابيب تريكين الارواء.
- إبرة الشعرية والأقطاب
- الحصول على القطب الأولية تتكون من 2.5 في من 0.010 في سلك الفضة والقطب الثانوية التي يجب أن تتكون من 15 في نفس السلك إلى الأرض الإعداد. لالقطب الثانوية، استخدم 15 في القسم من 0.010 في سلك الفضة مع طرف ملحوم، والذي يسمح لتناسبفي الظهر من مرحلة الرأس.
- بالكهرباء نصائح من كل من أسلاك الفضة الابتدائي والثانوي مع أيونات الكلوريد.
- باستخدام مجتذب micropipette، وسحب، البورسليكات الشعرية إبرة رقيقة الجدران مع مقاومة <15 mΩ.
- ملء الإبرة الشعرية مع 2-3 ميكرولتر من 2 كلوريد البوتاسيوم M، أو ما يكفي لتغطية جزء من غيض المغلفة كلوريد السلك الفضة.
- إدراج القطب الأساسي في الرأس الشعرية وتركيبها في حامل القطب.
- جبل للمرحلة الرأس إلى مياداة مجهرية ثم جبل القطب الثانوية في مياداة مجهرية الثانية. مع الإعداد، المركز الأول كل قطب كهربائي ومن ثم تناسب غيض من القطب ملحوم الثانوية في الجزء الخلفي للمرحلة الرأس.
- الحصول على القطب الأولية تتكون من 2.5 في من 0.010 في سلك الفضة والقطب الثانوية التي يجب أن تتكون من 15 في نفس السلك إلى الأرض الإعداد. لالقطب الثانوية، استخدم 15 في القسم من 0.010 في سلك الفضة مع طرف ملحوم، والذي يسمح لتناسبفي الظهر من مرحلة الرأس.
2. إعداد حلول، نظام الإرواء، وتسجيل الكهربية معدات
- الحصول على 1 لتر من الماء الموائلمن الحوض من الأسماك.
- 0.016٪ T] تريكين methanesulfonate (تريكين) (50 مل من 630 ميكرومتر) 24.
- ذوبان الجليد قسامة من 0.4٪ تريكين تريس مخزنة، ودرجة الحموضة 7.2.
- إضافة 2.1 مل من 0.4٪ تريكين تريس مخزنة إلى 47.9 مل من الماء وتخلط الموائل.
- ذوبان الجليد تركيز الأسهم من المطلوب للذوبان في الماء مركب التجريبية (على سبيل المثال 300 ملم بنتيلين تترازول، وهو chemoconvulsant المشتركة).
- ذوبان الجليد من قسامة من 1 ميكروغرام / ميكرولتر بانكورونيوم بروميد في حل رينغر.
- ملء كل من التخدير ونظم التنبيب التجريبية مع مياه البيئة واستنزاف على الأقل بما يكفي لإزالة جميع فقاعات من الأنابيب. ويجب أن يتم هذا لأن فقاعات عرقلة تدفق السوائل، مما يؤدي إلى الاختناق من الحيوان.
- تماما استنزاف أنابيب نضح التي ستعقد الأدوية دون السماح الهواء في الأنبوب الموصل.
- ملء أنبوب التخدير مع 0.016٪ (630 ميكرومتر) حل تريكين ووضع أي EXPERمجمع imental (ق) في أنبوب إضافي (ق) على نظام نضح التجريبية.
- يجب أن يحتوي الأنبوب الأول من نضح المياه الموائل التجريبية فقط.
- بلل الاسفنجة بالماء مسام صغيرة ومكان السكن في فارغة 60 مم × 15 مم طبق بتري. سيتم استخدام هذا الطبق لعقد الأسماك في حين يتم حقن مخدر.
3. حج القحف
- إضافة ما يكفي من الحل تريكين 630 ميكرومتر إلى 15 × 60 مم طبق بتري لملء ذلك نحو ثلاثة أرباع من الطريق. وزن الطبق شغلها. وسوف تستخدم هذه لشل حركة الحيوان بحيث التخدير مزيد يمكن حقن الغشاء البريتونى.
- تزج الحيوان في طبق يحتوي على تريكين وتزن الطبق مرة أخرى.
- طرح الفرق بين الأوزان من الخطوات 1 و 2 للحصول على وزن الأسماك.
- يسمح بالبقاء الحيوان في حل تريكين حتى الهدوء وتوقف معظم الحركة.
- باستخدام زوج من الملقط واسعة، ونقل الأسماك إلى الإسفنج premoistened وضعه أفقيا. نقل الأسماك من ذيله يعمل بشكل جيد لهذه العملية.
- وضع الاسفنج والأسماك تحت مجهر تشريح.
- مع حقنة Nanofil تحتوي على 34 إبرة G، وقياس ما يكفي من بروميد بانكورونيوم بحيث هناك 1 ميكروغرام / غرام من وزن الأسماك.
- استخدام عصا المصاصة على طول الجانب الظهري من السمك لأنه عقد ثابت، وإدارة بروميد بانكورونيوم الغشاء البريتونى باستخدام حقنة Nanofil.
- باستخدام ملقط غرامة، والاستيلاء على الأسماك من قبل الفك السفلي وبسرعة نقل الحيوان إلى قاعدة التنبيب.
- وضع الحيوان بحيث يكون ظهري المتابعة على شكل الشمع ومثل أن 1 ملم قنية يمكن إدراجها في الفم. استخدام ملقط غرامة على المناورة الأسماك وفتح الفم في جميع أنحاء قنية. ويرجع ذلك إلى ماكياج من الدرج التنبيب، تم تصميم محطة في القاعدة، والسماح للقنية لإدراجها 3 مم في فم السمكة.
- مرة واحدة في الموقف، تشغيل أنبوب نضح بالجاذبية التي تحتوي على تريكين.
- قطع الباب 3 سم 2 من الأنسجة Kimqipe والرطب مع الماء الموائل.
- وضع الأنسجة على الحيوان لمنع جفاف. ويمكن أيضا وضعه قسم Kimwipe للمساعدة في عقد الحيوان الظهرية المتابعة.
- تحت المجهر تشريح، واستخدام مقص الربيع فانا لإزالة ~ 2 مم 2 الجزء من الجمجمة الذي يغطي السقف البصري. هذا المجال يبدو وكأنه، لوحة العظمية الظلام الذي يجلس وراء العين.
الرقم 3- إدراج شفرة واحدة من مقص فانا على حافة اللوحة ودفع مع ما يكفي من القوة لpenetraالشركة المصرية للاتصالات العظم، دون ثقب الدماغ. إغلاق مقص قص العظام.
- إزالة قطعة من العظام.
- إن وجدت الدم موجودا، وإزالة باستخدام حافة Kimwipe. نزيف عموما يتوقف بعد وقت قصير من تنفيذ حج القحف.
4. الكهربية
- اغلاق التنبيب توقف الديك وسرعان ما قطع القفل يور ربط قاعدة التنبيب إلى بالتنقيط تريكين.
- نقل الإعداد التنبيب سليمة إلى المجهر الكهربية والاتصال إلى نظام الارواء.
- بدوره على المياه الموائل ويروي بمعدل 1 مل / دقيقة ل~ 1 ساعة، وذلك لتغسل تريكين.
- باستخدام مياداة مجهرية تحت المراقبة البصرية، ضع القطب الثانوية بحيث يمكن إدراج غيض الكهربائي في المنخر الحيوان أو في تراجع وراء الفك العلوي.
- ادخال الإبرة القطب الأساسي في افتتاح حج القحف. إدراجإبرة في الأنسجة، بحيث يتم وضع الطرف سطحية إلى حد ما ضمن السقف البصري.
- إذا كان القطب هو عميق جدا، قد تكون إشارة كهربائية صغيرة.
- جمع وتحليل الفرق الكهربائية سجلت بين الأقطاب المرجعية الابتدائية والثانوية. وسوف تسمح هذه العملية للحصول على تسجيلات خارج الخلية التي يمكن الحصول عليها.
- جمع البيانات في وضع خال من الفجوة في معدل العينة 5 كيلو هرتز، مع مرشح تمرير منخفض من 0.1 كيلو هرتز ومرشح تمريرة عالية من 1 هرتز.
- لا تبدأ تسجيل النشاط الكهربية حتى perfused المياه الموائل مدة لا تقل عن 45 دقيقة.
- تسجيل خط الأساس للنشاط الأصلي لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إضافة العقاقير التجريبية. يبدأ نضح مع الأدوية التجريبية الاختيار وسجل لمبلغ من الوقت المطلوب. في استعدادات صحية، فمن الممكن لتسجيل النشاط العصبي لمدة 2-3 ساعة.
5. تنظيف
- الموت ببطء الحيوانية جرعة زائدة من المخدرات باستخدام تريكين وفقا للممارسات المقبولة، على النحو المبين من قبل الجمعية الأميركية للطب البيطري (اخر احصاء) المبادئ التوجيهية للالقتل الرحيم للحيوانات (2013).
- يجب وضع الزرد إلى أن يتم التخلص في حل تريكين في 200-500 ملغ / لتر. الأسماك هي أن تترك في الحل مدة لا تقل عن 10 دقيقة بعد التوقف عن النشاط وصادي الإيقاعي، وبعد ذلك يتعرضون إلى الوسائل المادية للقتل الرحيم (transection عنق الرحم) للتأكد من الموت.
- تشغيل المياه DI من خلال جميع الأنابيب وجمع المناسبة للتخلص منها، إذا الخطرة.
- ترك الصمامات لكل أنبوب في موقف فتح لتسهيل تجفيف الهواء.
- نقع الأقطاب في الايثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف.
- تنظيف كل قطعة مع الايثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم هذا البروتوكول لقياس النشاط العصبي من الزرد الكبار في الجسم الحي. وباستمرار وبتكاثر الحصول على هذه التسجيلات الكهربية. ويبين الشكل 5 مثالا ممثل التعديلات المحلية والناجم عن النشاط العصبي من الزرد الكبار عندما يتم إدخال بنتيلين تترازول (PTZ)، وchemoconvulsant المشتركة 6،7،25،26، في التنبيب الإعداد.
تم رصد النشاط العصبي مواطن من الزرد الكبار لكل تجربة (الشكل 5A). وقد لوحظ باستمرار أن هذا النشاط هو عفوية والصغيرة في السعة خلال فترة التسجيل. بعد إدخال 15 ملي PTZ إلى النظام، وبدأت عمليات التصريف مثل صرعي عفوية لتطوير حوالي 5 دقائق. بعد إدخال. وكان هذا النشاط وجيزة في البداية، والسعة الصغيرة وقعت في كثير من الأحيان، على غرار ما لوحظ داخل ض اليرقاتebrafish 6،7. مع استمرار التعرض للPTZ، وجود نمط ثابت من تصريف السعة الكبيرة المتقدمة التي تليها، رشقات نارية أكثر تواترا أصغر من النشاط وفترة الهدوء لاحقة (الشكل 5B).
وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لإدخال chemoconvulsants أخرى من خلال نظام التنبيب. مع هذه المركبات، وقد أثار أيضا بشكل فعال التغيرات في النشاط العصبي الأصلية. وقد استخدم بنتيلين تترازول هنا كمثال بسبب ذلك القدرة على تغيير بقوة على النشاط العصبي مواطن من الزرد بطريقة نمطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدم هذا البروتوكول لقياس النشاط العصبي من الزرد الكبار في الجسم الحي. مع الممارسة، النشاط العصبي يمكن ملاحظتها باستمرار، على الرغم من أن الخصائص (السعة وشكل الأحداث) من النشاط المسجل يمكن أن تختلف بين الأسماك الفردية. الاستفادة من تقنيات التسجيل خارج الخلية يمكن أن تفسر هذه الملاحظة. يوفر طريقة الرصد المتزامن لعدد كبير من الخلايا داخل المنطقة 1، لذلك الاختلافات في وضعية القطب الأساسي يمكن أن تلعب دورا في النشاط الملحوظ. عمق القطب الأساسي أيضا تغيير المنطقة التي يجري قياسها. إذا تم وضع غيض من القطب عميق جدا داخل المنطقة، وإشارة لوحظ يكون أصغر مما كان متوقعا وسوف تغيرات في النشاط يكون من الصعب مراقبة، وإذا حدث هذا، ببساطة سحب القطب الأساسي بحيث غيض يجلس أكثر سطحية . الإحاطة علما بأن هذا هو سمة من السقف البصري، وألا يكونبدا داخلي في متعمقة في مناطق أخرى من الدماغ. ومع ذلك، يمكن أن يتم هذا الإجراء في غضون منطقة مختلفة من الدماغ. إذا يقلل من النشاط العصبي لوحظ أن مستويات خط الأساس خلال التجربة وليس من المؤكد إذا كان السمك لا يزال حيا، وإزالة الأقطاب من الجمجمة وتحقق لمعرفة ما اذا كان لا يزال هناك تدفق الدم في جميع أنحاء الحيوان. هذا يمكن التحقق من خلال مراقبة السفن الكبيرة في الشفة أو منطقة الأنف من الأسماك. تدفق الدم يمكن رؤيتها بسهولة في هذه المناطق. إذا تم إزالة الأقطاب للتحقق من تدفق الدم في منتصف التسجيل، عندما تموضع الأقطاب، وأنها ستكون في موقع مختلف قليلا مما كانت عليه في البداية، يلغي القدرة على مقارنة مباشرة هذا الجزء من التسجيل لخط الأساس الأصلي .
قبل البدء في هذا الإجراء، يجب التأكد من أن أنابيب التنبيب وكذلك أنابيب نضح لكل من حج القحف والاجهزة الكهربية وخالية من أي فقاعات. إذا فقاعات لا جمع، فإنها يمكن أن تدار من النظام عن طريق فتح محبس والسماح لبعض من المياه الموائل لتشغيل من خلال. إذا كان هذا لا يلغي المشكلة، يمكن تركيبها حقنة صغيرة إلى نهاية الأنبوب، حيث سيتم وضع قنية، وشفط ضوء تطبيقها لإزالة أي الهواء المتبقية داخل النظام. لفقاعات عنيد والمياه الموائل يمكن أن يجبر من خلال الأنابيب. أيضا، تأكد من أن أنابيب التروية ومعبي ويقطر قبل تنبيب الأسماك. إذا كان معدل التدفق من 1 مل ~ / لم يتم الحصول على الحد الأدنى، وارتفاع الرأس الضغط يمكن تغييرها من أجل تحقيق ذلك. وهذا يضمن أن الأسماك لديه حق الوصول إلى تدفق كميات كافية من المياه. عند الإعداد الكهربية نضح هو الإعداد مع العديد من الأنابيب في سلسلة، وتقرر أن الأمر استغرق حوالي ~ 1 دقيقة لحل جديد لتكون على قدم الحيوان، كأن ينتج تغيرات في النشاط العصبي سجلت تعتمد على bein مجمعقدم ز. ينصح أن هذا معدل تدفق تقاس قبل القيام بأية تجارب. وقد أظهرت الأعمال السابقة التي تريكين يمكن تخفيف النشاط العصبي، والتي تتطلب أن يتم إزالتها من النظام من أجل الحصول على تسجيلات دقيقة 27،28. من خلال الأعمال السابقة، تقرر أن مدة 45-60 دقيقة التنبيب بالماء الموائل هو مطلوب لتغسل تريكين والنشاط العصبي ليصل إلى مستويات الأصلية. وبالمثل، تم تنفيذ تبييض من pentylenetetrazole أيضا، وتقرر أن كان يحتاج لفترة من 20 دقيقة للعودة إلى النشاط العصبي مستويات خط الأساس. لذا، ينبغي المجربون استكمال المحاكمات لتحديد الأوقات تبييض لكل مركب من الفائدة التي أدخلت على النظام.
يتطلب هذا الأسلوب بعض الممارسات. عند إجراء حج القحف، يجب اتخاذ المزيد من الحيطة لضمان أن منطقة صغيرة من لوحة العظمية التي تغطي الرأس ويمكن ثقب وإزالتها دون الإضرارالدماغ. ويمكن أن يتم هذا من خلال إدخال مقص فانا في زاوية حادة فيما يتعلق الرأس. منطقة العظمية التي تغطي السقف البصري لديه اندماج بالقرب من مركز التي هي ضعيفة وخدمة نقاط دخول جيدة للمقص. مرة واحدة أحرز استراحة صغيرة داخل لوحة، واستخدام مقص لتقليم منطقة صغيرة من العظام، وإزالة باستخدام زوج من ملقط غرامة. الأسماك الأصغر سنا غالبا ما يكون أكثر ليونة، جماجم أكثر مرونة، بحيث يتم اقترح الأسماك التي هي 1 سنة من العمر أو أقل للاستخدام في الوقت الذي تعلم هذه التقنية. في بعض الأحيان، وسوف تبدأ لجمع الدم في جميع أنحاء المنطقة من حج القحف، ولكن هذا يمكن إزالتها عن طريق اللمس على Kimwipe بلطف في جميع أنحاء المنطقة. مع هذا الإجراء، حج القحف هو صغير جدا، ويجري حوالي 2 مم 2 في المنطقة. ونتيجة لهذا الحجم الصغير، لم يحدث جفاف المنطقة الجمجمة. ومع ذلك، إذا حج القحف أكبر في الحجم، فمن الممكن تطبيق أجار أو بعض المواد الأخرى لمنع فقدان الرطوبة من الدماغ إذا كان هذا لا تصبح مؤيدةblem.
وهناك نقطة من الفائدة هو استخدام بروميد بانكورونيوم. يتم تخزين هذه المادة الكيميائية في aliquots من 10 ميكرولتر من أجل منع تجميد والذوبان المتكررة. حجم اقترح لاستخدامها في تجربة، ويجري 1 ميكرولتر لكل غرام من الوزن، وعادة ما يكفي لشل حركة سمكة الكبار. في بعض الأحيان، ولكن هذا الصوت ليست كافية. وعندما يحدث هذا لم يتم الحصول على الشلل، أكثر بروميد بانكورونيوم يمكن أن تدار الغشاء البريتونى للأسماك، طالما لم تبدأ تسجيل. عند إجراء الحقن، لا في محاولة لحقن من خلال جداول الجانب صعبة؛ حقن الأسماك في المنطقة البطن ليونة، بالقرب من تنفيس. إذا يبدأ السمك للتحرك بمجرد وضع القطب الرئيسي، وهناك فرصة جيدة أن الإبرة قد قطعت في حج القحف، ويجب تكرار هذا الإجراء باستخدام حيوان جديد. من خلال هذا العمل، فقد تقرر أن بروميد بانكورونيوم يمكن أن تقلل من العصبية المسجلةومن المفترض النشاط في الزرد اليرقات (≤ 50٪ من السعة الأساسية) وأن يصدق الشيء نفسه بالنسبة للبالغين. ومع ذلك، في التجربة الأخيرة، والنشاط العصبي في مرحلة البلوغ هو قوي بما فيه الكفاية أن أي آثار الملطف نسبت إلى بروميد بانكورونيوم لا يبدو أن تؤثر سلبا على القدرة على جمع وتحليل البيانات. في المقابل، يمكن أن يفند المرتبطة الحركة تكون كبيرة. لهذا الإجراء، وفوائد من الجمود الكامل للحيوان ذو قيمة وراء هذا القيد والتغيرات العصبية التي يتم تقديمها هي قوية بما يكفي لتستمر إلى ما بعد أي آثار الملطف. أيضا، أي حركة من الحيوان يمكن أن تحل محل القطب، تكون مسجلة من قبل الكهربية معدات التسجيل وربما تشكل خطرا على الحيوانات.
القيود المفروضة على هذه التقنية تكمن أساسا في حقيقة أن تسجيل خارج الخلية هو السبيل الوحيد الممكن لتسجيل النشاط العصبي داخل الزرد الكبار سليمة. عند وضع الوجاهة راي الكهربائي، يجب إدخال الإبرة في حج القحف، ومنع احد من رؤية بالضبط حيث يتم وضع القطب. رغم ذلك، مع الممارسة، فمن الممكن لوضع قطب كهربائي داخل نفس المنطقة وعلى نفس العمق باستمرار.
في الجسم الحي الكهربية تم إلى حد كبير تقتصر على اليرقات الزرد. ويرجع ذلك إلى القدرة على شل بسهولة الأسماك الصغيرة وحقيقة أنها لا تتطلب التنبيب هذا. وبالتالي، فقد ركزت الدراسات الكهربية على مراحل اليرقات وقلة ما تم إنجازه بشأن النشاط الكهربية في الدماغ الكبار. وقد منعت هذه أي مقارنات بين الأحداث والبالغين النشاط العصبي في هذا الشأن. استخدام نظام التنبيب multitube يسمح لمقدمة سهلة من مجموعة متنوعة من المركبات للأسماك. وهذا يسمح أيضا لتأثيرات المواد الكيميائية أو المخدرات لدراستها داخل كل من نظم اليرقات والكبار المختلفة.
الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 1. التنبيب قنية. إزالة القسم 1.5 سم من نهاية واسعة من طرف الأصفر P-200 Pipetteman (A). إدراج 6 سم × 1 مم قطعة من أنابيب (سهم) إلى قفل يور الحد الموصل (B) وإدراج هذه قنية في تلميح ماصة تعديل. عقد غيض ماصة في موقف مع قفل يور استخدام جزء قصير من ⅛ في الأنابيب (C).
الشكل 2. أنهى التنبيب إعداد قاعدة. بمجرد أن يبرد الشمع الخليج، ووضع الإعداد قنية في حفرة أصغر من كثافة العملياتقاعدة ubation (A). تحريف 1 في الشريط واسعة من 42 سم Kimwipe في دوامة ضيق وأدخله في أنبوب الصرف الصحي بحيث Kimwipe يمتد على كلا الجانبين. إدراج واحدة من نهاية الأنبوب الصرف في حفرة كبيرة من طبق بتري (B)، مما يسمح الطرف الأدنى لتمديد إلى 30 ملم × 100 ملم بلورة طبق (وليس في طريقة العرض). وضع الأنسجة بحيث يمكن للمرء النهاية سوف تقع بالقرب من منطقة المعدة الحيوان (المذكورة مع خط أسود متقطع) ويمكن تمديد أقل بالتنقيط في طبق.
الرقم 3. حج القحف. تحت المجهر تشريح، واستخدام مقص الربيع فانا لإزالة ~ 2 مم 2 الجزء من الجمجمة الذي يغطي السقف البصري. هذا المجال يشبه الظلام، شبه منحرف لوحة العظمية التي ق وراء العين. دائرة منقط ترسم حيث تم وضع حج القحف. رأس السهم يظهر هناك يتم وضع إبرة من القطب الرئيسي في حفرة من حج القحف. يتكون القطب الأساسي من 2.5 في قسم من 0.010 في سلك الفضة التي تم مطلي مع أيونات الكلوريد وإدراجه ضمن إبرة البورسليكات الشعرية. شغل الإبرة الشعرية مع 2-3 ميكرولتر من 2 كلوريد البوتاسيوم M، أو ما يكفي لتغطية جزء من غيض المغلفة كلوريد السلك الفضة. يتكون القطب الثانوي من 15 في الفرع من نفس الأسلاك المستخدمة لالقطب الأساسي فيما عدا أنه يتم ملحوم تلميح في نهاية واحدة، والسماح لها لإدراجها في الجزء الخلفي للمرحلة الرأس. ويجب أيضا مطلي نهاية السلك الثانوي الذي سيتم وضعه لمس السمك مع أيونات الكلوريد. يظهر السهم حيث تم وضع القطب الثانوية داخل فتحة الأنف اليمنى من الأسماك البالغة.
together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 4. الإعداد لمجموعة من الأنشطة الكهربية. يتم نقل الإعداد التنبيب سليمة إلى المجهر الكهربية ويتم توصيل قنية إلى نظام الارواء (A). يجب تشغيل النظام على المياه، مما يسمح التروية للبدء فورا. باستخدام مياداة مجهرية، ضع القطب الثانوية (B) بحيث يتم إدخال طرف القطب في المنخر الحيوان أو في تراجع وراء الفك العلوي (السهم). ادخال الإبرة القطب الرئيسي (C) في افتتاح حج القحف. ادخال الإبرة بحيث يتم وضعه سطحية إلى حد ما ضمن السقف البصري. أنبوب الصرف كبيرة (D) تمتد من طبق التنبيب، للخروج من مجال الرؤية، والطرف الآخر يصب رانه طبق جمع.
الرقم 5. التسجيلات الكهربية داخل السقف البصري. (A) لوحظ باستمرار أن النشاط الأصلي ضمن السقف البصرية من الزرد الكبار هو عفوي مبسط، والتي تبين السعة الصغيرة (2-10 بالسيارات) النشاط طوال فترة التسجيل. (B) بعد إدخال 15 ملي PTZ إلى النظام، بدأت عمليات التصريف مثل صرعي عفوية لتطوير حوالي 5 دقائق التالية المقدمة. وكان هذا النشاط وجيزة في البداية، والسعة الصغيرة. مع استمرار التعرض للPTZ، وجود نمط ثابت من السعة كبيرة (تصل إلى 15 فولت) التصريف المتقدمة التي تلتها، رشقات نارية أصغر أكثر تواترا من النشاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS غرانت R01NS070159 (لانظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى، ورابطة الدفاع اليهودية ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M.
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
