Summary
Dette papir beskriver, hvordan en voksen zebrafisk kan immobiliseres, intuberet og anvendes til in vivo elektrofysiologiske eksperimenter for at tillade optagelser og manipulation af neural aktivitet i et intakt dyr.
Abstract
Tidligere har elektrofysiologiske studier i voksne zebrafisk været begrænset til at skære præparater eller til øje kop præparater og electrorentinogram optagelser. Dette papir beskriver, hvordan en voksen zebrafisk kan immobiliseres, intuberet og anvendes til in vivo elektrofysiologiske eksperimenter, som muliggør optagelse af neural aktivitet. Immobilisering af den voksne kræver en mekanisme med opløst oxygen til gæller i stedet for buccal og opercular bevægelse. Med vores teknik er dyr immobiliseres og perfunderet med habitat vand for at opfylde dette krav. En craniotomy udføres under tricaine methanesulfonate (MS-222, tricaine) anæstesi til at give adgang til hjernen. Den primære elektrode er derefter anbragt i kraniotomi vinduet til at optage ekstracellulære hjerneaktivitet. Gennem brug af en multitube perfusion system, kan en bred vifte af farmakologiske forbindelser administreres til voksne fisk, og eventuelle ændringer i neural aktivitetkan iagttages. Den metode ikke kun mulighed for observationer, der skal foretages om ændringer i neurologisk aktivitet, men det giver også mulighed for at foretage sammenligninger mellem larve og voksen zebrafisk. Dette giver forskerne mulighed for at identificere de ændringer i neurologisk aktivitet på grund af indførelsen af forskellige forbindelser ved forskellige livsfaser.
Introduction
I denne artikel er en protokol, der er beskrevet for at opnå in vivo optagelser af neurale aktivitet i voksen zebrafisk. Anvendes ekstracellulære optagelse metoder, som giver spænding målinger af elektrisk aktivitet inden for et lille område af nervevæv. Denne undersøgelsesmetode involverer overvågning af et stort antal celler i en opfører dyr 1. Tidligere har slice optagelser udført i både voksne og larver, som har øje kop præparater og elektroretinogrammet optagelser. Disse eksperimenter er stort set blevet udført til detaljer fysiologiske reaktioner af forskellige sansesystemer 2-5. Indtil for nylig har intakte hjerne præparater kun været til rådighed til udførelse af elektrofysiologi med zebrafisk larve 3,6,7, hvor respiration og oxygendiffusion kan forekomme gennem huden. Vores forberedelse giver den indfødte neurologiske aktivitet en voksen zebrafisk, der skal måles, mens dyret stadig er ved fuld bevidsthed og bevidst of dens omgivelser.
Zebrafisk (Danio rerio) aktuelt spiller en fundamental rolle som model for genetiske, toksikologiske, farmakologiske og fysiopatologiske undersøgelse 3. Zebrafisk har fået synlighed inden for neuroscience, fordi de deler omfattende homologi med pattedyr ved de genetiske, neurale og endokrine niveauer 8. Gennem det seneste årti, har standard neuroanatomisk og immunhistokemiske teknikker blevet brugt til at fastlægge det detaljerede karakteristisk organisering af zebrafisk nervesystem 9-12 og af fordelingen af forskellige neurotransmittere 3,8,13. For nylig har forskere flyttet deres fokus til funktionelle studier 14,15, hvoraf mange centrum på adfærdsmæssige processer 16-19 og elektrofysiologiske karakteristika sansesystemer 2,13,20. Et lille antal af disse undersøgelser har koncentreret sig om den elektriske aktivitet i specifikke områder af adult zebrafisk hjerne 21-23, men ikke blev gennemført ved hjælp af en in vivo-tilgang.
Denne protokol kan tilpasses til elektrofysiologiske undersøgelser af både spontane og fremkaldte aktivitet inden zebrafisk nervesystem til at beskrive mønstre af aktivitet i bestemte områder af hjernen. Brugen af denne teknik gør det muligt at foretage sammenligninger mellem den neurologiske aktivitet af unge larvestadier og voksne. Endvidere vores protokol tillader sammenligninger mellem genetiske eller farmakologiske ændringer. Sammen med andre metoder, såsom genteknologi eller farmakologiske forsøg, denne metode giver en ny mulighed for funktionel analyse af neuronal kommunikation og plasticitet i den intakte voksent dyr samt for potentielle applikationer, såsom at studere sen debut epilepsi eller neurodegenerative processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført i nøje overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og fulgte protokol # A2011 09-003, som blev revideret, godkendt og overvåget af University of Georgia Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1.. Opsætning af udstyr
- Perfusionssystem for kraniotomi
Immobilisering af den voksne nødvendiggør en intubation systemet til at levere opløst oxygen på fisken. En række systemer kan blive anvendt, men en simpel tyngdekraft system bestående af en 60 ml sprøjte anvendes. Hæve trykhoved til en højde, der konsekvent giver en strømningshastighed på ~ 1 ml / min. Denne sprøjte kan placeres i serie med sprøjter, der derefter bruges til elektrofysiologiske perfusion system.- Anskaf en enkelt 60 ml Luer lock sprøjte rør og fjerne stemplet.
- Suspender sprøjten cirka 8 i &# 160; over bunden af en ring-stativ ved hjælp af en klemme.
- Tilslut en en-vejs stophane til enden af sprøjten. Til den modsatte ende af stophanen, skal du tilslutte et stykke slange, 2 mm i diameter, som er lang nok til at strække sig til intubation base.
- Perfusionssystem for elektrofysiologi
For elektrofysiologiske eksperimenter, er det ofte nødvendigt at indføre en række forbindelser i løbet af et eksperiment. En række systemer er tilgængelige, men kan anvendes en tyngdekraft, der består af 60 ml sprøjter i serie. Denne opsætning giver mulighed for enkel, seriel indførelse af løsninger, der skal udføres ved at åbne den tilsvarende stophane.- Opnå to eller flere 60 ml luer lock sprøjter og fjerne stemplerne fra hver. En sprøjte er nødvendig for at administrere habitat vand til fisk, mens hvert efterfølgende rør kan anvendes til at administrere en lang række farmakologiske forbindelser til fiskene.
- Forbind hver sprøjte til en 3 -vejs stophane med en Luer-forbindelse.
- Brug ⅛ i ydre diameter (OD) slange til at forbinde sprøjterne i serie med en Luer-lås på den ene ende.
- Fastgøre enheden, således at trykhøjde er hævet til en højde af 27 i over bunden, eller en højde, der konsekvent giver en strømningshastighed på ~ 1 ml / min.
- Intubationsrør
Den intubationskanyle letter indførelsen af fluid til fisk. Denne opsætning giver både fleksibilitet og fasthed til bedste position kanylen i dyrets mund.- Ved hjælp af en generel saks (f.eks. Fiskars) eller et barberblad, fjerne en 1,5 cm sektion af den brede ende af en P-200 pipettespids.
- Indsæt en 6 cm x 1 mm stykke slange ind i en reduktionsventil med en kvindelig Luer lock hætte og silicone ferrul, dvs Tuohy Borst adapter, og indsætte denne kanyle ind i den modificerede pipette spids. Hold pipettespids i stilling med den Luer lock hjælp af en kort del af ⅛ i diameter slange.
Figur 1
- Intubations basen
Denne parabol bruges til at holde det immobiliserede dyr i en stabil, opretstående stilling, og at lette fjernelse af væsken ind i dyret gennem intubation. Hvis dette ikke er etableret korrekt, kan pooling forekomme, hvilket fører til indgribende vibrationelle signaler i elektrofysiologiske optagelse.- Anskaf base fad af en 100 mm x 15 mm plast petriskål.
- Ved hjælp af et loddeværktøj, smelte et hul på 6 mm i diameter og 7,5 mm under kanten af fælgen, ind i siden af skålen. Brug af det samme værktøj, smelte et hul, 10 mm i diameter og 11 mm under kanten af skålen ~ 74 ° mod uret fra mindre hul. Dette hul vil fungere som drænhul.
- Sæt et rør, 1 cm i diameter, ind i hullet med enden løftet sådan, at enden ikke kan blokeres. Sæt derefter et P-200 pipetteman spids ind i det lille hul, og dette vil tjene som en dummy kanyle.
- Med petriskålen lidt forhøjet på den side af det større hul, hæld smeltet konserves voks i skålen, således at kanylen hullet kun er dækket. Regionen vil tjene som et stop, således at kanylen skal indsættes ~ 3 mm ind i munden på fisken. Dette sæt op, bør have lov til at størkne.
- Ved hjælp af en flamme opvarmes metalkant, skære en kanal til at holde fisk, så at kanalen begynder fra spidsen af kanylen og strækker sig omkring 1-2 i.
- Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at en kontinuerlig nedadgående vinkel fra kanylen område drænageporten dannes.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Figur 2
- Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at en kontinuerlig nedadgående vinkel fra kanylen område drænageporten dannes.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Perfusion setup
- Inden du begynder, skylle perfusion set-ups med habitat vand, sikre, at alle luftbobler fjernes.
- Læg ~ 30 ml 0,016% (630 uM) tricaine løsning kraniotomi perfusion opsætning og tillade ~ 2 ml at køre gennem slangen for at sikre, tricaine vil blive leveret til dyret ved perfusion indledning. Se trin 2.2 til fortynding.
- Til de vigtigste perfusion setup tilsættes ~ 50 ml habitat vand til det første rør. Tilføj de ønskede eksperimentelle forbindelser til hver af de resterende rør.
- Placer kanylen opsætningen ind i det lille hul i intubation base.
- Sno en 1 i bred strimmel af 42 cm Kimwipe i en stram spiral og indsætte det i drænrøret, således at den Kimwipe strækker begge ender. Dette væv vil fungere som en væge for at fjerne perfunderet væske og for at forhindre væske oprustning inden for than intubation base, som kan interferere med elektrofysiologiske optagelse.
- Sæt den ene ende af slangen i det store hul af petriskålen, hvorved den nedre ende for at strække sig ind i et indifferent skål, der er stor nok til at samle alle perfusion affald. Denne parabol vil tjene som udstrømning reservoir for opsætningen. Placer væv, således at den ene ende vil ligge nær dyrets mave region og nedre forlængelsesrør kan dryppe ned i skålen.
- Placer denne afsluttet intubation base nær dissektionsmikroskop. Slut LuerLock kanylen til tricaine perfusionsslange.
- Kapillær nål og elektroder
- Anskaf en primær elektrode bestående af 2,5 i 0,010 i sølvtråd og en sekundær elektrode, som bør bestå af 15 i den samme ledning til jord opsætningen. For den sekundære elektrode bruge en 15 i snit af 0,010 i sølvtråd med en loddet spids, hvilket gør det til at passei bagsiden af et hoved-fase.
- Galvanisere tips af både den primære og sekundære sølvtråde med chloridioner.
- Med en mikropipette aftrækker, trække en tyndvægget, borosilicate kapillar nål med en modstand på <15 MOhm.
- Fyld kapillær nål med 2-3 pi 2 M kaliumchlorid, eller nok til delvis dækning af den chlorid-overtrukne spidsen af sølvtråd.
- Sæt den primære elektrode ind i kapillar hovedet og montere den i elektroden holderen.
- Monter hoved-scene i en mikromanipulator og derefter montere den sekundære elektrode ind i en anden mikromanipulator. Opsætningen, første position hver elektrode og sæt derefter påloddet af den sekundære elektrode i baghovedet fase.
- Anskaf en primær elektrode bestående af 2,5 i 0,010 i sølvtråd og en sekundær elektrode, som bør bestå af 15 i den samme ledning til jord opsætningen. For den sekundære elektrode bruge en 15 i snit af 0,010 i sølvtråd med en loddet spids, hvilket gør det til at passei bagsiden af et hoved-fase.
2. Udarbejdelse af løsninger, perfusionssystem og Elektrofysiologiske recording-udstyr
- Anskaf 1 L af levesteder vandfra akvarium fisk.
- 0,016% T] tricaine methanesulfonate (tricaine) (50 ml 630 uM) 24.
- Optø en alikvot af 0,4% Tris-pufret tricaine, pH 7,2.
- Tilføj 2,1 ml 0,4% Tris-buffered tricaine til 47,9 ml habitat vand og blandes.
- Optø lager ønskede koncentration af vandopløselige eksperimentelle forbindelse (fx 300 mM pentylentetrazol, en fælles chemoconvulsant).
- Tø en portion af 1 pg / pl pancuroniumbromid i Ringers opløsning.
- Fyld både bedøve og eksperimentelle intubation systemer med habitat vand og afløb i det mindste nok til at fjerne alle bobler fra rør. Dette skal gøres, fordi bobler hindrer fluidstrømning, hvilket fører til kvælning af dyret.
- Helt dræne perfusionen rør, der vil holde medicin uden at lade luft ind i forbinder slangen.
- Fyld bedøve rør med 0,016% (630 uM) tricaine løsning og placere nogen experimental forbindelse (r) i yderligere rør (r) på eksperimentel perfusion system.
- Det første rør af eksperimentel perfusion bør kun indeholde habitat vand.
- Fugt lille pore svamp med habitat vand og placer i en tom 60 mm x 15 mm petriskål. Denne skål vil blive anvendt til at holde fisk, mens bedøvelsesmidlet injiceres.
3. Kraniotomi
- Tilføj nok af 630 pM tricaine løsning på en 15 x 60 mm petriskål til at fylde det omkring tre fjerdedele af vejen. Den fyldte fad afvejes. Dette vil blive anvendt til immobilisering af dyr, således at yderligere anæstesi kan injiceres intraperitonealt.
- Fordyb dyret i fadet indeholder tricaine og vejer fadet igen.
- Fratræk forskellen mellem vægtene fra trin 1 og 2 for at opnå vægten af fisken.
- Lad dyret til at forblive i tricaine løsning, indtil ro og mest bevægelse er ophørt.
- Ved hjælp af et par brede pincet overføre fisk til en fugtet svamp og placer den sideværts. Overførsel af fisken ved halen fungerer godt for denne proces.
- Placer svamp og fisk under dissektionsmikroskop.
- Med en Nanofil sprøjte indeholdende en 34 G kanyle, udmåle nok pancuroniumbromid sådan, at der er 1 ug / g fisk vægt.
- Ved hjælp af en ispind pind langs dorsalsiden af fisk at holde den stabil, administrere pancuroniumbromid intraperitonealt ved hjælp af Nanofil sprøjten.
- Brug de fine pincet, tag fat i fisk ved underkæben og hurtigt overføre dyret til intubation base.
- Placer dyret, så det er dorsal op på voks form og således, at 1 mm kanyle kan indsættes i munden. Brug fine tænger til at manøvrere fisk og åbne munden omkring kanylen. På grund af makeup af intubation bakken blev et stop manipuleret ind i basen, såkanyle at blive indsat 3 mm ind i munden på fisken.
- Når du er i position, tænde for tyngdekraft-fed perfusion rør indeholdende tricaine.
- Skær en 3 cm 2 afsnit af Kimqipe væv og våd det med habitat vand.
- Placer vævet over dyret for at forhindre udtørring. Den Kimwipe sektion kan også være placeret for at hjælpe med at holde dyret dorsal up.
- Under dissektion mikroskop bruge Vanna foråret saks at fjerne ~ 2 mm 2 sektion af kraniet, der dækker den optiske tectum. Dette område ligner en mørk, benede plade, der sidder bag øjet.
Figur 3- Indsæt den ene vinge af Vanna saks på kanten af pladen og skubbe med nok kraft til indtrængente knoglen uden piercing hjernen. Luk saks til at klippe knoglen.
- Fjern stykke knogle.
- Hvis nogen blod er til stede, fjernes ved hjælp kanten af en Kimwipe. Blødning generelt stopper kort efter at udføre kraniotomi.
4.. Elektrofysiologi
- Sluk intubation stop pik og hurtigt afbryde Luer lock forbinder intubation basen til tricaine drop.
- Flyt intakte intubation setup til elektrofysiologi mikroskop og oprette forbindelse til perfusionssystemet.
- Tænd for vandet levesteder og perfuse med en hastighed på 1 ml / min for ~ 1 time, for at vaske ud tricaine.
- Ved hjælp af en mikromanipulator under visuel kontrol, placere den sekundære elektrode, således at elektroden spids kan indsættes i dyrets næsebor eller til dip bag overkæben.
- Sæt den primære elektrode nål i kraniotomi åbning. Indsætnålen ind i vævet, således at spidsen er placeret temmelig overfladisk i optiske tectum.
- Hvis elektroden er for dyb, kan det elektriske signal være lille.
- Indsamle og analysere den elektriske forskel indspillet mellem de primære og sekundære reference elektroder. Denne proces vil give mulighed for ekstracellulære optagelser, der skal opnås.
- Indsamle data i Gap-fri tilstand på en 5 kHz samplingfrekvens, med et lavpasfilter på 0,1 kHz og et højpasfilter på 1 Hz.
- Må ikke starte optagelsen elektrofysiologiske aktivitet indtil habitat vand har perfunderet i mindst 45 min.
- Optag en baseline af indfødte aktivitet i mindst 15 minutter før tilsætning af eksperimentel medicin. Begynd perfusion med eksperimentel medicin af valg og post for det ønskede tidsrum. Hos raske præparater er det muligt at registrere neurologisk aktivitet for 2-3 timer.
5.. Clean Up
- Aflive dyret ved overdosis hjælp tricaine i overensstemmelse med gældende praksis, som skitseret af American Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer for aflivning af dyr (2013).
- Zebrafisk skal aflives bør placeres i en tricaine løsning på 200-500 mg / L. Fisk, skal efterlades i opløsningen i mindst 10 minutter efter ophør af rytmisk opercular aktivitet, hvorefter de udsættes for en fysisk måde til eutanasi (cervikal overskæring) for at sikre død.
- Kør DI vand gennem alle rør og indsamler til hensigtsmæssig bortskaffelse, hvis farlige.
- Lad stophaner for hvert rør i den åbne stilling for at lette lufttørring.
- Soak elektroderne i 70% ethanol og lad det lufttørre.
- Rengør hvert stykke med 70% ethanol og lad det lufttørre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er blevet anvendt til at måle den neurale aktivitet af voksne zebrafisk in vivo. Disse elektrofysiologiske optagelser er konsekvent og reproducerbar opnået. Figur 5 viser et repræsentativt eksempel på indfødte og inducerede ændringer af den neurale aktivitet af en voksen zebrafisk når pentylentetrazol (PTZ), en fælles chemoconvulsant 6,7,25,26, er indført i intubation opsætning.
Den native neurologisk aktivitet af den voksne zebrafisk blev overvåget for hvert forsøg (figur 5A). Det sås konsekvent, at denne aktivitet er spontan og lille i amplitude under varigheden af optagelsen. Efter indførelsen af 15 mM PTZ til systemet begyndte spontane epilepsilignende-lignende udledninger at udvikle omkring 5 min. efter introduktion. Denne aktivitet blev oprindeligt kort, lille amplitude og forekom ofte, i lighed med hvad der blev observeret inden for larvernes zebrafish 6,7. Med fortsatte eksponering for PTZ, et konsekvent mønster af store udledninger amplitude udviklet som blev efterfulgt af mindre, mere hyppige byger af aktivitet og en efterfølgende stille periode (figur 5B).
Denne teknik har været anvendt med succes til at indføre andre chemoconvulsants gennem intubation system. Med disse forbindelser er der foretaget ændringer i native neurologisk aktivitet også effektivt fremkaldt. Pentylenetetrazol blev anvendt her som et eksempel på grund af den evne til robust ændre den native neurale aktivitet af zebrafisk i en stereotyp måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er blevet anvendt til at måle den neurale aktivitet af voksne zebrafisk in vivo. Med praksis, kan neurale aktivitet observeres konsekvent, selvom karakteristika (amplitude og form af hændelser) af den optagne aktivitet kan variere mellem de enkelte fisk. Udnyttelse af den ekstracellulære optagelse teknik kan forklare denne observation. Fremgangsmåden giver samtidig overvågning af et stort antal celler i en region 1, så variationer i positionen af den primære elektrode kan spille en rolle i den observerede aktivitet. Dybden af den primære elektrode ændrer også region vil blive målt. Hvis spidsen af elektroden er placeret for dybt inden for en region, vil den observerede signal være mindre end forventet, og ændringer i aktiviteten vil blive sværere at observere, hvis dette sker, skal du blot trække sig tilbage den primære elektrode, så spidsen sidder mere overfladisk . Vær opmærksom på, at dette er karakteristisk for den optiske tectum og har ikke væreda kigget på indgående i andre regioner af hjernen. Imidlertid kunne denne procedure gennemføres inden for et andet område af hjernen. Hvis den observerede neurale aktivitet falder til baseline niveau under forsøget, og det er usikkert, om fisken er stadig i live, fjerne elektroderne fra kraniet og tjek for at se, om der stadig er blodgennemstrømningen i hele dyret. Dette kan kontrolleres ved at observere de store skibe i læben eller nasale område af fisken. Blodgennemstrømning let kan ses i disse regioner. Hvis elektroderne er fjernet for at kontrollere for blodgennemstrømningen i midten af en registrering, når repositionering elektroderne, vil de være i en lidt anden placering end de var i første omgang, at bevirke, at evnen til direkte at sammenligne denne del af optagelsen til det oprindelige baseline .
Inden denne procedure, skal det sikres, at de intubation rør samt perfusion rør til både kraniotomi og elektrofysiologi opsætninger erfri for bobler. Hvis der er bobler indsamler, kan de løbe ud af systemet ved at åbne for hanen og lade noget af vandet levested til at køre igennem. Hvis dette ikke eliminerer problemet, kan en lille sprøjte fastgøres til enden af røret, hvor kanylen vil blive placeret, og let sugning for at fjerne eventuel luft i systemet. Til genstridige bobler kan levested vand tvinges gennem slangen. Sørg også for, at perfusionen rørene er primet og dryp før intubating fisken. Hvis en strømningshastighed på ~ 1 ml / min er ikke opnået, kan højden af trykhøjden ændres for at opnå dette. Dette vil sikre, at fiskene har adgang til tilstrækkelig vandgennemstrømning. Når elektrofysiologi perfusion opsætningen er setup med mange rør i serie, blev det besluttet, at det tog omkring ~ 1 min for den nye løsning at blive introduceret til dyret, selvom deraf følgende ændringer i den registrerede neurologiske aktivitet var afhængig af den sammensatte being indført. Det anbefales, at blive målt dette flow før udfører nogen eksperimenter. Tidligere arbejde har vist, at tricaine kan dæmpe neurale aktivitet, der kræver det at blive fjernet fra systemet for at opnå nøjagtige optagelser 27,28. Gennem tidligere arbejde blev det bestemt, at en periode på 45-60 minutter af intubation med habitat vand er forpligtet til at vaske ud tricaine og neurale aktivitet at nå indfødte niveau. Tilsvarende blev udvaskning af pentylentetrazol også udført, og det blev fastslået, at en periode på 20 min var forpligtet til at vende tilbage neurale aktivitet til udgangsniveauet. Derfor bør eksperimentatorerne gennemføre forsøg for at bestemme udvaskning gange for hver forbindelse af interesse, indføres i systemet.
Denne teknik kræver lidt øvelse. Ved udførelsen af kraniotomi, skal der træffes ekstra omhu for at sikre, at en lille region af den benede plade, der dækker hovedet kan punkteres og fjernes uden at beskadigehjernen. Dette kan gøres ved at indføre Vanna saks ved en spids vinkel i forhold til hovedet. Den knoklet område, der dækker den optiske tectum har fusioner nær centrum, der er svage og tjene som gode entry point for saksen. Når en lille pause er foretaget inden for den plade, bruge en saks til at trimme et lille område af knoglen og fjerne med et par fine pincet. Yngre fisk ofte har blødere, mere smidigt kranier, så fisk, der er 1 år eller derunder er foreslået til brug, mens man lærer denne teknik. Lejlighedsvis, vil blodet begynder at samle sig rundt region kraniotomi, men dette kan fjernes ved at duppe en Kimwipe forsigtigt omkring området. Med denne procedure, kraniotomi er meget lille, er omkring 2 mm 2 i området. På grund af denne lille størrelse, har udtørring af skallepartiet ikke fundet sted. Men hvis kraniotomi er større i størrelse, er det muligt at anvende agar eller andet materiale for at forhindre fugttab fra hjernen, hvis det bliver en proBlem.
Et andet interessepunkt er brugen af pancuroniumbromid. Dette kemikalie er opbevaret i portioner af 10 pi for at forhindre gentagen nedfrysning og optøning. Den foreslåede mængde, der skal anvendes i et eksperiment, som er 1 pi per gram af vægten, er normalt tilstrækkeligt til at immobilisere en voksen fisk. Den lejlighed, men denne mængde er ikke tilstrækkelig. Når dette sker, og lammelse er ikke opnået, kan mere pancuroniumbromid indgives intraperitonealt på fisken, så længe optagelsen ikke er begyndt. Ved udførelse af injektionen, skal du ikke forsøge at injicere gennem hårde side skalaer, injicere fisk i blødere maven region, nær vent. Hvis fisken begynder at bevæge sig, når den primære elektrode er blevet anbragt, der er en god chance for, at nålen har været afbrudt i kraniotomi, og proceduren skal gentages med et nyt dyr. Gennem dette arbejde er det blevet bestemt, at pancuroniumbromid kan reducere den optagne neuraleaktivitet i larvernes zebrafisk (≤ 50% af baseline amplitude), og det antages, at det samme gælder for voksne. Men i de seneste erfaring, den neurale aktivitet i en voksen er robust nok til, at eventuelle afdæmpende virkning tilskrives pancuroniumbromid ikke synes at påvirke evnen til at indsamle og analysere data. I modsætning hertil kan forvirrer forbundet med bevægelse være betydelig. For denne procedure, at fordelene ved fuldstændig ubevægelighed af dyret er af værdi ud over denne begrænsning, og de neurale forandringer, der er indført er robuste nok til at fortsætte ud over enhver afdæmpende virkning. Desuden kan enhver bevægelse fra dyret fortrænge elektroden, registreres af elektrofysiologi kontrolapparatet og muligvis bringe dyret.
Begrænsningerne i denne teknik ligger primært i, at ekstracellulære optagelse er den eneste mulige måde at optage neurologisk aktivitet i intakte voksne zebrafisk. Ved placering af prima ry elektrode, må nålen indsættes i kraniotomi, forhindrer i at se præcis, hvor elektroden er anbragt. Selv med praksis er det muligt at placere elektroden inden for samme område og samme dybde konsekvent.
In vivo elektrofysiologi har stort set været begrænset til zebrafisk larver. Dette skyldes muligheden for nemt at immobilisere små fisk, og at de ikke kræver intubation. Derfor har elektrofysiologiske undersøgelser fokuseret på de larvestadier og lidt er gjort vedrørende den elektrofysiologiske aktivitet i den voksne hjerne. Dette har forhindret nogen sammenligninger mellem unge og voksne neurologiske aktivitet, der skal foretages. Anvendelsen af multitube intubation Systemet tillader nem indførelse af en række forbindelser til fiskene. Dette giver også mulighed for effekten af forskellige kemikalier eller lægemidler, der skal undersøges inden for både larve og voksen-systemer.
nt "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 1. Et afsnit 1.5 cm Fjern fra den brede ende af en gul P-200 pipetteman spids (A). Intubationsrør. Indsæt en 6 cm x 1 mm stykke slange (pil) i en Luer Lock reducerende stik (B) og indsætte denne kanyle ind i den modificerede pipette spids. Hold pipettespids i position med Luer lock ved hjælp af en kort del af ⅛ i rør (C).
Figur 2. Færdig intubation basis setup. Når Golfen Wax er afkølet, placere kanylen opsætningen ind i mindre hul på intubation base (A). Sno en 1 i bred strimmel af 42 cm Kimwipe i en stram spiral og indsætte det i drænrøret, således at den Kimwipe strækker begge ender. Sæt den ene ende af drænageslangen ind i den store hul i petriskålen (B), hvorved den nedre ende at strække sig ind i en 30 mm x 100 mm krystalliseringsskål (ikke i betragtning). Placer væv, således at den ene ende vil ligge nær dyrets mave-området (skitseret med sort stiplet linie) og den nedre forlængelse kan dryppe ned i skålen.
Figur 3. Kraniotomi. Under dissektion mikroskop bruge Vanna foråret saks til at fjerne ~ 2 mm 2 sektion af kraniet, der dækker den optiske tectum. Dette område ligner en mørk, trapezformet knoklet plade at sdens bag øjet. Den stiplede cirkel afgrænser hvor kraniotomi er placeret. Pilespidsen viser at der nålen i den primære elektrode er anbragt inde i hullet i kraniotomi. Den primære elektrode består af en 2,5 i snit af 0,010 i sølvtråd, der er blevet elektropletteret med chloridioner og indsættes i en borsilicat kapillær nål. Den kapillære nålen er fyldt med 2-3 pi 2 M kaliumchlorid, eller nok til delvis dækning af den chlorid-overtrukne spidsen af sølvtråd. Den sekundære elektrode består af en 15 i snit af den samme ledning, der anvendes til den primære elektrode, bortset fra at en spids er loddet ved den ene ende, så det kan indsættes i bagsiden af hovedet fase. Enden af den sekundære ledning, der skal placeres røre fiskene skal også elektropletteres med chloridioner. Pilen viser, hvor den sekundære elektrode er placeret i højre næsebor af voksne fisk.
Figur 4.. Opsætning til indsamling af elektrofysiologisk aktivitet. Det intakte intubation setup flyttes til elektrofysiologi mikroskop og kanylen er forbundet til perfusionssystem (A). Systemet vand skal være tændt, så perfusion til at starte med det samme. Brug mikromanipulator placere den sekundære elektrode (B), således at elektroden spidsen indsættes i dyrets næsebor eller til dip bag den øverste kæbe (pil). Sæt den primære elektrode nål (C) i kraniotomi åbning. Sæt nålen sådan, at det er placeret temmelig overfladisk indenfor optikken tectum. Den store drænrøret (D) strækker sig fra intubation skålen, ud af synsfeltet, og den anden ende udmunder than indsamling skålen.
Figur 5. Elektrofysiologiske optagelser inden for optiske tectum. (A) Det blev konsekvent observeret, at den indfødte aktivitet indenfor den optiske tectum af den voksne zebrafisk er stereotypisk spontan, viser lille amplitude (2-10 mV) aktivitet under hele optagelsen. (B) Efter indførelsen af 15 mM PTZ til systemet, begyndte spontane epilepsilignende-lignende udledninger til udvikling omkring 5 min efter introduktion. Denne aktivitet blev oprindeligt kort, lille amplitude. Med fortsat eksponering for PTZ, et konsekvent mønster af stor amplitude (op til 15 mV) udledninger, der er udviklet som blev efterfulgt af mindre, mere hyppige byger af aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH / NINDS Grant R01NS070159 (til TMD, JDL og ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M.
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
