Summary
Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.
Abstract
Eerder hebben elektrofysiologische studies bij volwassen zebravis beperkt tot preparaten of in oog cup voorbereidingen en electrorentinogram opnames snijden. Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten, geschikt voor opname van neurale activiteit. Immobilisatie van de volwassene is een mechanisme vereist om opgeloste zuurstof te leveren aan de kieuwen in plaats van buccale en opercular beweging. Met onze techniek, worden de dieren geïmmobiliseerd en perfusie van habitats met water om deze eis te voldoen. Een craniotomie wordt uitgevoerd onder tricaïne methaansulfonaat (MS-222, tricaïne) anesthesie toegang tot de hersenen verschaffen. De primaire elektrode wordt dan geplaatst in de craniotomie venster extracellulaire hersenactiviteit opnemen. Door het gebruik van een multitube perfusie systeem, een grote farmacologische verbindingen in de neurale activiteit worden toegediend aan de volwassen vissen en eventuele veranderingenkan worden waargenomen. De methode maakt het mogelijk niet alleen voor opmerkingen worden gemaakt met betrekking tot veranderingen in de neurologische activiteit, maar het maakt het ook vergelijkingen worden gemaakt tussen larven en volwassen zebravis. Dit geeft onderzoekers de mogelijkheid om de veranderingen in neurologische activiteit te identificeren door de invoering van verschillende verbindingen in verschillende ontwikkelingsstadia.
Introduction
In dit artikel wordt een protocol beschreven voor het verkrijgen van in vivo opnames van neurale activiteit bij volwassen zebravissen. Extracellulaire technieken worden gebruikt, waardoor de spanning metingen van elektrische activiteit in een klein gebied van zenuwweefsel. Deze onderzoeksmethode volgt men een groot aantal cellen in een dier gedragen 1. Eerder hebben slice opnamen uitgevoerd bij zowel volwassenen als larven, evenals oog cup voorbereidingen en electroretinogram opnames. Deze experimenten zijn grotendeels uitgevoerd detail fysiologische reacties van verschillende sensorische systemen 2-5. Tot voor kort waren intactehersenen preparaten alleen voor het uitvoeren elektrofysiologie met zebravissen larve 3,6,7, waarbij ademhaling en zuurstof diffusie kan optreden door de huid is. Onze voorbereiding kan de inheemse neurologische activiteit van een volwassen zebravissen te meten, terwijl het dier blijft volledig bij bewustzijn en bewust of zijn omgeving.
Zebravis (Danio rerio) spelen momenteel een fundamentele rol als model voor genetische, toxicologische, farmacologische en fysiopathologische studies 3. Zebravis hebben zichtbaarheid binnen het gebied van de neurowetenschappen opgedaan, omdat ze delen uitgebreide homologie met zoogdieren in de genetische, neurale en endocriene niveau 8. In de afgelopen tien jaar hebben standaard neuro-anatomische en immunohistochemische technieken zijn gebruikt om de gedetailleerde kenmerkende organisatie van de zebravis zenuwstelsel 9-12 en van de verdeling van de verschillende neurotransmitters 3,8,13 bepalen. Meer recent hebben onderzoekers hun focus naar functionele studies 14,15, waarvan vele centreren op gedragsprocessen 16-19 en elektrofysiologische kenmerken van sensorische systemen 2,13,20. Een klein aantal van deze studies hebben zich geconcentreerd op de elektrische activiteit van specifieke gebieden van de adult hersenen zebravis 21-23, maar werden niet uitgevoerd met behulp van een in vivo benadering.
Dit protocol kan worden aangepast voor elektrofysiologische studies van zowel spontane en uitgelokte activiteit in het zebravis zenuwstelsel de activiteitspatronen beschrijven specifieke hersengebieden. Het gebruik van deze techniek maakt vergelijkingen worden gemaakt tussen de neurologische activiteit van jonge larvale stadia en volwassenen. Verder, ons protocol maakt vergelijkingen tussen genetische of farmacologische veranderingen. Samen met andere benaderingen, zoals genetische manipulatie of farmacologische proeven, biedt deze methode een nieuwe mogelijkheid voor de functionele analyse van neuronale communicatie en plasticiteit in de intacte volwassen dier en voor mogelijke toepassingen, zoals het bestuderen late onset epilepsie en neurodegeneratieve processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren en volgde protocol # A2011 09-003, dat werd beoordeeld, goedgekeurd, en onder toezicht van de Universiteit van Georgia Institutional Animal Care en gebruik commissie.
1. Plaatsing van het apparaat
- Perfusie-systeem voor craniotomy
Immobilisatie van de volwassene vereist een intubatie systeem om opgeloste zuurstof te leveren aan de vis. Verschillende systemen kunnen worden gebruikt, maar een eenvoudige zwaartekracht bestaande uit een injectiespuit 60 ml gebruikt. Verhoog de drukhoogte tot een hoogte die consequent levert een debiet van ~ 1 ml / min. De spuit kan in serie met de injectiespuiten die vervolgens worden gebruikt voor het elektrofysiologische perfusie systeem worden geplaatst.- Verkrijgen van een enkele 60 ml Luer lock spuit buis en verwijder de plunjer.
- Hang de spuit ongeveer 8 in &# 160; boven de basis van een ring-stand met behulp van een klem.
- Sluit een driewegkraan naar het einde van de injectiespuit. Aan het andere uiteinde van de plugkraan, sluit een stuk slang, 2 mm in diameter, die lang genoeg te breiden tot de intubatie basis.
- Perfusie-systeem voor elektrofysiologie
Voor elektrofysiologische experimenten, is het vaak nodig om een verscheidenheid van verbindingen voeren tijdens een experiment. Verschillende systemen zijn beschikbaar, maar een ernst bestaande uit 60 ml spuiten in serie worden gebruikt. Daarmee kan eenvoudig seriële invoering van oplossingen door het openen van de overeenkomstige plugkraan te voeren.- Krijgen twee of meer 60 ml Luer lock spuiten en verwijder de zuigers van elkaar. Een spuit moet leefgebied water dienen aan de vis tijdens elke volgende kous kan worden gebruikt om een verscheidenheid van farmacologische verbindingen dienen aan de vis.
- Sluit elke spuit een 3 -weg kraan met een Luer-aansluiting.
- Gebruik ⅛ in buitendiameter (OD) slang aan de spuiten in serie met een mannelijke Luer lock op een einde.
- Bevestig het apparaat zodat de drukhoogte verhoogd tot een hoogte van 27 in boven de basis, of een hoogte die consequent levert een debiet van ~ 1 ml / min.
- Intubatiecanule
De intubatiecanule vergemakkelijkt de introductie van vloeistof naar de vis. Deze opstelling biedt flexibiliteit en stevigheid aan de beste positie de canule in de mond van het dier.- Het gebruik van een algemene schaar (bv. Fiskars) of een scheermesje, verwijderen van een 1,5 cm doorsnede van het brede uiteinde van een P-200 pipet tip.
- Plaats een 6 cm x 1 mm stuk slang in een reduceerventiel met een vrouwelijke Luer lock cap en siliconen beentje, dat wil zeggen een Tuohy Borst adapter en steek deze canule in de gewijzigde pipet tip. Houd de pipet tip in positie met de Luer lock met behulp van een kort gedeelte van ⅛ diameter buizen.
Figuur 1
- Intubatie base
Deze schotel wordt gebruikt om de geïmmobiliseerde dier houden in een stabiele rechtop en het verwijderen van het fluïdum dat het dier door intubatie te vergemakkelijken. Indien dit niet correct vastgesteld, kan pooling optreden, wat leidt tot ingrijpende vibratie signalen in de elektrofysiologische opname.- Krijgen de basis schotel van een 100 mm x 15 mm plastic petrischaal.
- Met een soldeerbout, smelten gat 6 mm in diameter en 7,5 mm onder de rand van de velg, in de zijkant van de schaal. Met hetzelfde gereedschap, smelten gat, 10 mm in diameter en 11 mm onder de rand van de schotel ~ 74 ° linksdraaiend van de kleiner gat. Dit gat zal dienen als de drainage gat.
- Plaats een buis, 1 cm in diameter, in het gat met het einde opgetild zodat uiteindelijk niet kan worden geblokkeerd. Steek vervolgens een P-200 pipetteman tip in het kleine gaatje, dit zal dienen als een dummy canule.
- Met de petrischaal licht verhoogd aan de kant van de grotere opening, giet gesmolten inblikken was in de schaal, zodat de canule gat net bedekt. De regio zal dienen als een aanslag, waarbij de canule wordt ingebracht ~ 3 mm in de mond van de vis. Deze set-up moet worden toegestaan te stollen.
- Met behulp van een vlam verwarmd metalen rand, snijd een kanaal om de vis zodat het kanaal begint vanaf het uiteinde van de canule en strekt zich ongeveer 1-2 inch vasthouden
- Voorzichtigheid moet worden gezorgd dat een continue neerwaartse hoek van de canule vlak voor de afvoerpoort gevormd.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Figuur 2
- Voorzichtigheid moet worden gezorgd dat een continue neerwaartse hoek van de canule vlak voor de afvoerpoort gevormd.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Perfusie setup
- Voordat u begint, spoel de perfusie set-ups met leefgebied water, zodat alle luchtbellen worden verwijderd.
- Voeg ~ 30 ml 0.016% (630 uM) tricaïne oplossing voor de craniotomie perfusie opstart en laat ~ 2 ml om door buis zodat tricaïne opnieuw het dier op diens perfusie initiatie. Zie stap 2.2 voor verdunning.
- Om de belangrijkste perfusie setup, voeg ~ 50 ml leefgebied water om de eerste buis. Voeg de gewenste experimentele verbindingen aan elk van de overgebleven buizen.
- Plaats de canule setup in het kleine gaatje van de intubatie basis.
- Draai een 1 in brede strook van 42 cm Kimwipe in een strakke spiraal en steek deze in de drainage buis zodanig dat de Kimwipe uitstrekt aan beide uiteinden. Dit weefsel zal dienen als een lont aan de perfusie vloeistof te verwijderen en vocht ophoping binnen t voorkomenhij intubatie basis, die kunnen interfereren met de elektrofysiologische opname.
- Steek een uiteinde van de slang in het grote gat van de petrischaal, zodat de onderkant uit te breiden naar een inerte schaal die groot genoeg is om alle perfusie afval in te zamelen. Dit gerecht zal dienen als de uitstroom reservoir voor de setup. Plaats het weefsel, zodat het ene uiteinde in de buurt van buik regio van het dier komt te liggen en de onderste uitbreiding kan druppelen in de schotel.
- Plaats deze voltooid intubatie basis in de buurt van de dissectiemicroscoop. Sluit de Luer lock van de canule aan de tricaïne perfusieslang.
- Capillairnaaldspanning en elektroden
- Verkrijgen van een primaire elektrode bestaande uit 2,5 in van 0.010 in zilverdraad en een tweede elektrode die dient te worden samengesteld van 15 in dezelfde draad om de installatie te aarden. Voor de secundaire elektrode, gebruik dan een 15 in doorsnede van 0.010 in zilverdraad met een gesoldeerde tip, die het mogelijk maakt om te passenaan de achterkant van een hoofd-podium.
- Galvaniseren de uiteinden van zowel de primaire en secundaire zilveren draden met chloride-ionen.
- Met behulp van een micropipet trekker, trek een dunwandige, borosilicaat capillaire naald met een weerstand van <15 mQ.
- Vul het capillaire naald met 2-3 ul van 2 M kaliumchloride, of genoeg om gedeeltelijk de-chloride gecoate uiteinde van de zilveren draad.
- Plaats de primaire elektrode in de capillaire hoofd en monteer deze in de houder elektrode.
- Monteer het hoofd-podium in een micromanipulator en monteer vervolgens de secundaire elektrode in een tweede micromanipulator. Met de opbouw, eerste positie elke elektrode en past vervolgens de gesoldeerd uiteinde van de secundaire elektrode in de achterkant van het hoofd-podium.
- Verkrijgen van een primaire elektrode bestaande uit 2,5 in van 0.010 in zilverdraad en een tweede elektrode die dient te worden samengesteld van 15 in dezelfde draad om de installatie te aarden. Voor de secundaire elektrode, gebruik dan een 15 in doorsnede van 0.010 in zilverdraad met een gesoldeerde tip, die het mogelijk maakt om te passenaan de achterkant van een hoofd-podium.
2. Voorbereiding van Solutions, perfusie-systeem, en elektrofysiologische opname apparatuur
- Verkrijgen 1 L van leefgebied watervan aquarium vissen.
- 0.016% T] tricaïne methaansulfonaat (tricaïne) (50 ml van 630 uM) 24.
- Ontdooi een hoeveelheid van 0,4% Tris-gebufferd tricaïne, pH 7,2.
- Voeg 2,1 ml van 0,4% Tris-gebufferde tricaïne tot 47,9 ml van de habitat water en meng.
- Dooi voorraad concentratie van gewenste wateroplosbare experimentele verbinding (bijv. 300 mM pentylenetetrazol, een gemeenschappelijke chemoconvulsant).
- Ontdooien een hoeveelheid van 1 ug / ul pancuroniumbromide in Ringer-oplossing.
- Vul beide verlamming en experimentele intubatie systemen van habitats met water en afvoer in ieder geval genoeg om alle luchtbellen uit buizen te verwijderen. Dit moet worden gedaan omdat bellen belemmeren fluïdumstroming, waardoor stikken van het dier.
- Volledig laten perfusie buizen die drugs zal houden zonder dat er lucht in de verbindende buis.
- Vul de verlamming buis met 0.016% (630 uM) tricaïne oplossing en leg er geen expertiseimental verbinding (en) extra buis (buizen) experimentele perfusie systeem.
- De eerste buis van experimentele perfusie mag alleen leefgebied water bevatten.
- Bevochtig de kleine poriën spons met leefgebied water en plaats in een lege 60 mm x 15 mm petrischaal. Deze schaal wordt gebruikt om de vis te houden terwijl de verdoving wordt geïnjecteerd.
3. Craniotomie
- Genoeg van de 630 uM tricaïne oplossing toe te voegen aan een 15 x 60 mm petrischaal te vullen ongeveer driekwart van de weg. Weeg de gevulde schotel. Dit wordt gebruikt om het dier te immobiliseren zodat verdere anesthesie intraperitoneaal worden geïnjecteerd.
- Dompel het dier in het schaaltje met tricaïne en wegen van de schotel weer.
- Trek het verschil in het gewicht van stap 1 en 2 om het gewicht van de vis te verkrijgen.
- Laat het dier in de tricaïne oplossing blijven totdat de rust en de meeste beweging is gestopt.
- Met behulp van een paar brede tang, overdracht van de vis aan de voorbevochtigde spons en plaats het zijdelings. Het overbrengen van de vis bij de staart werkt goed voor dit proces.
- Plaats de spons en vis onder de microscoop ontleden.
- Met een Nanofil spuit met een 34 G naald, afmeten genoeg pancuroniumbromide zodanig dat er 1 ug / g gewicht van de vis.
- Met behulp van een popsiclestok langs de dorsale zijde van de vis vast te houden stabiel, beheren van de pancuroniumbromide intraperitoneaal met de Nanofil spuit.
- Met behulp van de fijne tang, pak de vis door de onderkaak en snel overbrengen van het dier aan de intubatie basis.
- Plaats het dier zodat het dorsale-up op de was vorm en zodanig dat de 1 mm canule in de mond worden ingebracht. Gebruik de fijne tang om de vis te manoeuvreren en de mond rond de canule te openen. Door de samenstelling van de intubatie schaal, werd een aanslag ontworpen in de basis, waardoor decanule invoegen 3 mm in de mond van de vis.
- Eenmaal in positie, zet de zwaartekracht gevoede perfusie buis met tricaïne.
- Snijd een deel 3 cm 2 van Kimqipe weefsel en bevochtig het met leefgebied water.
- Plaats het weefsel op het dier om uitdroging te voorkomen. Het gedeelte Kimwipe kan ook worden gepositioneerd om te helpen bij het houden van de dieren dorsale-up.
- Onder de dissectie microscoop, gebruik Vanna lente schaar om ~ 2 mm 2 sectie van de schedel die de optische Tectum verwijderen. Dit gebied lijkt op een donkere, benige plaat die zit achter het oog.
Figuur 3- Steek een mes van de Vanna schaar op de rand van de plaat en duw met genoeg kracht om penetratieTÉ het bot, zonder piercing de hersenen. Sluit de schaar om het bot snip.
- Verwijder het stukje bot.
- Als er wat bloed zichtbaar is, verwijderen met behulp van de rand van een Kimwipe. Bloeden algemeen stopt kort na het uitvoeren van de craniotomie.
4. Elektrofysiologie
- Schakel de intubatie stop-haan en snel los te koppelen van de Luer lock aansluiting van de intubatie uitvalsbasis om de tricaïne infuus.
- Verplaats de intacte intubatie setup om de elektrofysiologie microscoop en maak verbinding met de perfusie-systeem.
- Zet het leefgebied water en perfuseren met een snelheid van 1 ml / min voor ~ 1 uur, om te wassen het tricaïne.
- Met behulp van een micromanipulator onder visuele controle positioneren de secundaire elektrode zodat de elektrode in neusgat van het dier of in de dip achter de bovenkaak kan worden ingebracht.
- Steek de primaire elektrode naald in de craniotomie opening. Plaats denaald in het weefsel, zodanig dat de punt vrij oppervlakkige binnen de optiek tectum gepositioneerd.
- Als de elektrode te diep, kan het elektrische signaal klein.
- Verzamelen en de elektrische geconstateerde verschil tussen de primaire en secundaire referentie-elektroden te analyseren. Dit proces zal zorgen voor extracellulaire opnames te verkrijgen.
- Verzamel de gegevens in-Gap vrije modus bij een 5 kHz sample rate, met een low pass filter van 0,1 kHz en een high-pass filter van 1 Hz.
- Niet beginnen met opnemen elektrofysiologische activiteit totdat leefgebied water heeft perfusie voor een minimum van 45 minuten.
- Neem een basislijn van natieve activiteit gedurende ten minste 15 min voor de toevoeging van experimentele geneesmiddelen. Begin perfusie met experimentele geneesmiddelen van keuze en record voor de gewenste tijdsduur. Bij gezonde preparaten, is het mogelijk om de neurologische activiteit opnemen 2-3 uur.
5. Clean Up
- Euthanaseren het dier door overdosis drugs gebruik tricaïne in overeenstemming met de aanvaarde praktijken, zoals die door de American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtsnoeren voor de euthanasie van dieren (2013).
- Zebravis worden gedood moeten een tricaïne oplossing bij 200-500 mg / l worden geplaatst Vissen worden achtergelaten in de oplossing ten minste 10 minuten na beëindiging van ritmische opercular activiteit, waarna ze onderworpen aan een fysieke middelen euthanasie (cervicale doorsnijding) om dood te verzekeren.
- Ren DI water door alle buizen en verzamel voor een adequate verwijdering, als gevaarlijk.
- Laat de kranen voor elke buis in de open positie om de lucht drogen te vergemakkelijken.
- Week de elektroden in 70% ethanol en aan de lucht laten drogen.
- Reinig elk stuk met 70% ethanol en aan de lucht laten drogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is gebruikt om de neurale activiteit van volwassen zebravissen in vivo meten. Deze elektrofysiologische opnames zijn consistent en reproduceerbaar verkregen. Figuur 5 toont een representatief voorbeeld van aangeboren en geïnduceerde veranderingen van de neurale activiteit van een volwassen zebravissen bij pentyleentetrazol (PTZ), een gemeenschappelijke chemoconvulsant 6,7,25,26, wordt geïntroduceerd in de intubatie setup.
De natieve neurologische activiteit van de volwassen zebravissen werd gedurende elke proef (figuur 5A). Er werd consistent waargenomen dat deze activiteit spontaan en kleine amplitude gedurende de duur van de opname. Na de introductie van 15 mM PTZ het systeem, spontane epileptische-achtige ontladingen begon ongeveer 5 minuten ontwikkelen. na de invoering. Deze activiteit was aanvankelijk kort kleine amplitude en kwamen vaak voor, vergelijkbaar met wat werd waargenomen binnen larvale zebrafish 6,7. Bij voortzetting van de blootstelling aan de PTZ, een consistent patroon van grote amplitude lozingen ontwikkeld die werden gevolgd door kleinere, meer frequente uitbarstingen van activiteit en een daaropvolgende rustige periode (Figuur 5B).
Deze techniek is met succes gebruikt om andere chemoconvulsants voeren via intubatie systeem. Met deze verbindingen, werden veranderingen in de inheemse neurologische activiteit ook effectief opgeroepen. Pentylenetetrazol werd hier als voorbeeld vanwege het vermogen om krachtig veranderen de natieve neurale activiteit van de zebravis een stereotiepe wijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is gebruikt om de neurale activiteit van volwassen zebravissen in vivo meten. Met de praktijk, kunnen neurale activiteit consequent worden nageleefd, hoewel de kenmerken (amplitude en de vorm van gebeurtenissen) van de opgenomen activiteit kan variëren tussen individuele vissen. Benutting van de extracellulaire techniek kan deze waarneming verklaren. De methode omvat gelijktijdige controle van een groot aantal cellen in een gebied 1, waardoor de verschillen in de positionering van de primaire elektrode kan een rol spelen bij de waargenomen activiteit. Diepte van de primaire elektrode verandert ook het gebied gemeten. Als de punt van de elektrode te diep is gepositioneerd binnen een regio, zal het waargenomen signaal kleiner dan verwacht en veranderingen in activiteit zal moeilijker worden om te observeren, als dit gebeurt, gewoon trek de primaire elektrode, zodat de tip meer oppervlakkig zit . Let op dat dit kenmerkend is voor de optische tectum en heeft nieten keek in de diepte in andere gebieden van de hersenen. Echter, deze procedure kan worden uitgevoerd in een ander gebied van de hersenen uitgevoerd. Als de waargenomen neurale activiteit afneemt tot de uitgangswaarden tijdens het experiment en het is onzeker of de vis nog in leven is, verwijdert u de elektroden van de schedel en controleren om te zien of er nog bloedstroom door het hele dier. Dit kan worden gecontroleerd door de grote schepen in de lip of neus-gebied van de vissen observeren. De bloedstroom kan gemakkelijk worden gezien in deze gebieden. Als de elektroden worden verwijderd om te controleren bloedstroom in het midden van een opname waarbij herpositionering van de elektroden, zullen zij in een iets andere plaats dan zij aanvankelijk waren, ontkennen de mogelijkheid om rechtstreeks vergelijk van de vastlegkop om de oorspronkelijke basislijn .
Voordat deze procedure begint, moet ervoor worden gezorgd dat de intubatie buizen evenals de perfusie buizen voor zowel de craniotomie en de elektrofysiologie opstellingen zijnvrij van luchtbellen. Als er bellen niet verzamelen, kunnen ze uit het systeem worden uitgevoerd door het openen van de kraan en waardoor een deel van het leefgebied water doorlopen. Als dit niet het probleem te verhelpen, kan een kleine spuit worden bevestigd aan het uiteinde van de buis, waarin de canule worden geplaatst, en het zuigen toegepast resterende lucht in het systeem te verwijderen. Voor hardnekkige bellen, kan leefgebied water worden gedwongen door de slang. Zorg er ook voor dat de perfusie buizen zijn voorbereid en druipen voordat intubating de vis. Indien een debiet van ~ 1 ml / min is verkregen, kan de hoogte van de drukhoogte om dit te bereiken worden gewijzigd. Dit zorgt ervoor dat de vis heeft toegang tot voldoende water stromen. Wanneer de elektrofysiologie perfusie setup is ingesteld met tal buizen in serie werd vastgesteld dat het duurde ongeveer ~ 1 min voor de nieuwe oplossing te voeren aan het dier, maar daaruit voortvloeiende veranderingen in het opgenomen neurologische activiteit was afhankelijk van de samenstelling being geïntroduceerd. Het is aangeraden dat dit debiet worden gemeten vóór u begint met welke experimenten. Eerder werk heeft aangetoond dat tricaïne neurale activiteit kan verminderen, waarbij zij worden verwijderd uit het systeem om nauwkeurige opnames 27,28 verkrijgen. Door eerdere werk, werd vastgesteld dat een periode van 45-60 minuten van intubatie met leefgebied water nodig te spoelen de tricaïne en neurale activiteit inheemse niveaus te bereiken. Evenzo, wash-out van pentyleentetrazol werd ook uitgevoerd, en werd vastgesteld dat een periode van 20 minuten was nodig om neurale activiteit terug te keren naar de uitgangswaarden. Daarom moeten onderzoekers onderzoeken uitvoeren om washout maal bepalen voor elke van belang zijnde verbinding wordt in het systeem.
Deze techniek vergt enige oefening. Bij het uitvoeren van de craniotomie, moet extra zorg worden genomen om ervoor te zorgen dat een klein gebied van de benige plaat die het hoofd bedekt kan worden doorboord en verwijderd zonder beschadigingde hersenen. Dit kan door de invoering van Vanna schaar onder een scherpe hoek ten opzichte van de weg. De benige gebied dat de optische tectum heeft fusies in de buurt van het centrum die zwak zijn en dienen als goede instap punten voor de schaar. Zodra een kleine pauze is gedaan binnen de plaat, met een schaar tot een klein gebied van het bot trimmen en te verwijderen met een paar fijne pincet. Jongere vissen hebben vaak zachter, soepeler craniums, zodat vis die 1 jaar of minder worden voorgesteld voor gebruik tijdens het leren van deze techniek. Af en toe zal bloed beginnen te verzamelen rond de regio van de craniotomie, maar dit kan worden verwijderd door deppen een Kimwipe zachtjes rond het gebied. Met deze procedure de craniotomie is zeer klein, die ongeveer 2 mm 2 in het gebied. Door deze kleine formaat, heeft uitdrogen van de craniale regio niet voorgedaan. Indien de craniotomie groter in omvang, is het mogelijk om agar of een ander materiaal toegepast om te voorkomen vochtverlies uit de hersenen als dit wordt een probleem.
Een bezienswaardigheid is het gebruik van de pancuroniumbromide. Deze chemische stof wordt opgeslagen in aliquots van 10 pl teneinde herhaalde bevriezen en ontdooien te voorkomen. De voorgestelde volume worden gebruikt in een experiment, wordt 1 pi per gram gewicht, is meestal voldoende om een volwassen vissen immobiliseren. Soms echter, dit volume is niet voldoende. Wanneer dit gebeurt en verlamming niet verkregen, kunnen veel pancuroniumbromide intraperitoneaal worden toegediend aan de vis, zolang opname niet begonnen. Bij het uitvoeren van de injectie, niet proberen te injecteren door de taaie kant schalen; injecteren de vis in de zachtere buik regio, in de buurt van de vleugel. Als de vis begint te bewegen zodra de primaire elektrode is geplaatst, is er een goede kans dat de naald is afgebroken in de craniotomie, en moet de procedure worden herhaald met een nieuw dier. Door dit werk, is bepaald dat pancuroniumbromide de opgenomen neurale kan verminderenactiviteit larvale zebravis (≤ 50% van de uitgangswaarde amplitude) en wordt aangenomen dat hetzelfde geldt voor volwassenen. In recente ervaringen de neurale activiteit in een volwassen robuust genoeg dat temperende rechtsgevolgen die pancuroniumbromide lijken niet in staat om gegevens te verzamelen en te analyseren kunnen aantasten. Daarentegen kan verwart geassocieerd met beweging aanzienlijk zijn. Voor deze procedure, de voordelen van volledige immobiliteit van het dier is van waarde buiten deze beperking en de neurale wijzigingen die worden geïntroduceerd zijn robuust genoeg om te blijven staan na enig dempend effect. Ook kan een beweging van het dier de elektrode verplaatsen door de elektrofysiologie controleapparaat geregistreerd en eventueel gevaar het dier.
De beperkingen van deze techniek vooral liggen in het feit dat extracellulaire is de enige mogelijke manier van het opnemen van neurologische activiteit in de intacte volwassen zebravissen. Bij het plaatsen van de eerste ry elektrode, moet de naald worden ingebracht in de craniotomie, waardoor een uit zien precies waar de elektrode wordt geproduceerd. Hoewel, met de praktijk, is het mogelijk de elektrode te positioneren binnen dezelfde regio en op dezelfde diepte consistent.
In vivo elektrofysiologie grotendeels beperkt tot zebravis larven. Dit komt door de mogelijkheid om eenvoudig immobiliseren kleine vissen en het feit dat ze niet intubatie vereisen. Daarom zijn elektrofysiologische studies gericht op de larvale stadia en weinig gedaan over de elektrofysiologische activiteit in de hersenen. Dit verhinderde vergelijkingen tussen juveniele en volwassen neurologische activiteit te maken. Het gebruik van het multitube intubatie systeem maakt eenvoudig invoeren van verschillende verbindingen om de vis. Dit maakt ook de effecten van verschillende chemicaliën of geneesmiddelen te bestuderen in zowel de larven en volwassen systemen.
nt "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 1. Intubatiecanule. Verwijder een 1,5 cm doorsnede van het brede uiteinde van een gele P-200 pipetteman tip (A). Plaats een 6 cm x 1 mm stuk slang (pijl) in een Luer Lock verminderen connector (B) en plaats deze canule in de gewijzigde pipet tip. Houd de pipet tip in positie met de Luer slot met behulp van een kort gedeelte van ⅛ in buis (C).
Figuur 2. Afgewerkt intubatie basis setup. Zodra de Golf Wax is afgekoeld, plaatst u de canule setup in de kleinere opening van de intubation base (A). Draai een 1 in brede strook van 42 cm Kimwipe in een strakke spiraal en steek deze in de drainage buis zodanig dat de Kimwipe uitstrekt aan beide uiteinden. Steek een uiteinde van de draineerbuis in het grote gat van de petrischaal (B), zodat de onderkant uitstrekken in een 30 mm x 100 mm kristallisatieschaal (niet weergeven). Plaats het weefsel, zodat het ene uiteinde in de buurt van buik van het dier (omlijnd met zwarte stippellijn) komt te liggen en de onderste uitbreiding kan druppelen in de schotel.
Figuur 3. Craniotomie. Onder de dissectie microscoop, gebruik Vanna lente schaar om ~ 2 mm 2 sectie van de schedel die de optische Tectum verwijderen. Dit gebied lijkt op een donkere, trapeziumvormige benige plaat dat iszijn achter het oog. De gestippelde cirkel markeert waar de craniotomie wordt geplaatst. De pijlpunt geeft daar de naald van de primaire elektrode geplaatst in het gat van de craniotomie. De primaire elektrode bestaat uit een 2.5 in doorsnede van 0.010 in zilverdraad die is gegalvaniseerd met chloride-ionen en ingevoegd in een borosilicaat capillairnaaldspanning. De capillaire naald is gevuld met 2-3 ul van 2 M kaliumchloride, of genoeg om gedeeltelijk de-chloride gecoate uiteinde van de zilveren draad. De secundaire elektrode bestaat uit een 15 in doorsnede van dezelfde draad voor de primaire elektrode behalve dat een tip is gesoldeerd aan een uiteinde, zodat deze in de achterkant van het hoofd-fase worden opgenomen. Het einde van de tweede draad die moet worden geplaatst aanraken van de vis moet worden gegalvaniseerd met chloorionen. De pijl geeft aan waar de tweede elektrode is gepositioneerd binnen het rechter neusgat van de volwassen vissen.
Figuur 4. Configuratie voor het verzamelen van elektrofysiologische activiteit. De intacte intubatie opstart verplaatst naar de elektrofysiologie microscoop en de canule is verbonden met het perfusie systeem (A). Het systeem water moet worden ingeschakeld, waardoor perfusie om onmiddellijk te beginnen. De micromanipulator Plaats de secundaire elektrode (B) zodat de elektrode in neusgat van het dier of in de dip achter de bovenkaak (pijl) wordt ingevoegd. Steek de primaire elektrode naald (C) in de craniotomie opening. Steek de naald zodat het vrij oppervlakkige geplaatst in het optische tectum. De grote afvoerbuis (D) zich uitstrekt vanaf de intubatie schaal, van het gezichtsveld, en het andere uiteinde uitmondt in thij opvangschaaltje.
Figuur 5. Elektrofysiologische registraties binnen de optische tectum. (A) Er werd consistent waargenomen dat de inheemse activiteit in de optiek tectum van de volwassen zebravissen is stereotypically spontaan tonen van een kleine amplitude (2-10 mV) activiteit gedurende de duur van de opname. (B) Na de invoering van 15 mM PTZ aan het systeem, spontane epileptische-achtige ontladingen begon te ontwikkelen ongeveer 5 minuten na de invoering. Deze activiteit was aanvankelijk korte, kleine amplitude. Bij voortzetting van de blootstelling aan de PTZ, een consistent patroon van grote amplitude (tot 15 mV) lozingen ontwikkeld, die werden gevolgd door kleinere, meer frequente uitbarstingen van activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH / NINDS Grant R01NS070159 (tot TMD, JDL en ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M.
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
