Summary
Ce document décrit comment un poisson zèbre adulte peut être immobilisé, intubé, et utilisé pour des expériences électrophysiologiques in vivo pour permettre des enregistrements et de la manipulation de l'activité neuronale chez un animal intact.
Abstract
Auparavant, les études électrophysiologiques chez le poisson zèbre adulte ont été limitées à trancher préparations ou de préparations de la Coupe des yeux et des enregistrements electrorentinogram. Ce document décrit comment un poisson zèbre adulte peut être immobilisé, intubé, et utilisé pour des expériences électrophysiologiques in vivo, permettant l'enregistrement de l'activité neuronale. Immobilisation de l'adulte nécessite un mécanisme pour fournir de l'oxygène dissous, les branchies à la place du mouvement buccale et operculaire. Avec notre technique, les animaux sont immobilisés et perfusés avec de l'eau de l'habitat à satisfaire à cette exigence. Une crâniotomie est effectuée sous méthanesulfonate de tricaïne (MS-222; tricaïne) anesthésie pour fournir l'accès au cerveau. L'électrode primaire est ensuite positionné à l'intérieur de la fenêtre de la craniotomie pour enregistrer l'activité cérébrale extracellulaire. Grâce à l'utilisation d'un système de perfusion multitubulaire, une variété de composés pharmacologiques peut être administrée à des poissons adultes et des modifications dans l'activité neuronalepeut être observée. La méthodologie permet non seulement d'observations à faire concernant les changements dans l'activité neurologique, mais il permet également d'effectuer des comparaisons entre les larves de poisson zèbre et des adultes. Ceci donne aux chercheurs la capacité à identifier des altérations de l'activité neurologique due à l'introduction de divers composés à différents stades de la vie.
Introduction
Dans cet article, un protocole est décrit pour l'obtention des enregistrements in vivo de l'activité neuronale chez le poisson zèbre adulte. Méthodes d'enregistrement extracellulaires sont utilisées, fournissant des mesures de tension de l'activité électrique à l'intérieur d'une petite région de tissu neural. Cette méthode d'investigation implique le suivi d'un grand nombre de cellules chez un animal à se comporter 1. Auparavant, les enregistrements de tranches ont été réalisées dans les deux adultes et les larves, comme l'ont fait les préparatifs de la Coupe des yeux et des enregistrements électrorétinogramme. Ces expériences ont été en grande partie réalisée au détail des réponses physiologiques des différents systèmes sensoriels 2-5. Jusqu'à récemment, les préparatifs du cerveau intactes ne sont disponibles pour effectuer l'électrophysiologie avec le poisson zèbre 3,6,7 larve, où la respiration et la diffusion d'oxygène peut se produire à travers la peau. Notre préparation permet l'activité neurologique native d'un poisson zèbre adulte à mesurer alors que l'animal reste pleinement conscient et of ses environs.
Poisson zèbre (Danio rerio) jouent actuellement un rôle fondamental en tant que modèle pour les études génétiques, toxicologiques, pharmacologiques et physiopathologiques 3. Poisson zèbre ont gagné en visibilité dans le domaine des neurosciences, car ils partagent une homologie avec des mammifères aux génétique, neuronaux et endocriniens niveaux 8. Au cours de la dernière décennie, les techniques neuroanatomiques et immunohistochimiques standard ont été utilisées pour déterminer l'organisation caractéristique détaillée du système nerveux poisson zèbre 9-12 et de la distribution des différents neurotransmetteurs 3,8,13. Plus récemment, les chercheurs ont déplacé leur attention à des études fonctionnelles 14,15, dont beaucoup centrées sur les processus comportementaux 16-19 et les caractéristiques électrophysiologiques des systèmes sensoriels 2,13,20. Un petit nombre de ces études se sont concentrées sur l'activité électrique des zones spécifiques de l'adult cerveau du poisson zèbre 21-23, mais n'ont pas été effectuées en utilisant une approche in vivo.
Ce protocole peut être adapté pour les études électrophysiologiques à la fois de l'activité spontanée et provoquée dans le système nerveux du poisson zèbre pour décrire les modèles de l'activité dans des régions cérébrales spécifiques. L'utilisation de cette technique permet d'effectuer des comparaisons entre l'activité neurologique des jeunes stades larvaires et les adultes. En outre, notre protocole permet des comparaisons entre les altérations génétiques ou pharmacologiques. Ensemble avec d'autres approches, telles que le génie génétique ou les tests pharmacologiques, cette méthode offre une nouvelle possibilité pour l'analyse fonctionnelle de la communication neuronale et la plasticité dans l'animal adulte intact ainsi que pour des applications potentielles, telles que l'étude de l'épilepsie de l'arrivée tardive ou processus neurodégénératifs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en stricte conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et suivies protocole # A2011 09-003, qui a été examiné, approuvé et supervisé par l'Université de Géorgie institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité.
Une. Installation du matériel
- système de perfusion pour craniotomie
L'immobilisation de l'adulte nécessite un système d'intubation à fournir de l'oxygène dissous pour les poissons. Une variété de systèmes peut être utilisée, mais un système à gravité simple, constitué d'une seringue de 60 ml est utilisé. Élever la tête de pression à une hauteur constante qui produit un débit de ~ 1 ml / min. Cette seringue peut être placée en série avec les seringues qui sont ensuite utilisés pour le système de perfusion électrophysiologique.- Obtenir un 60 ml luer lock tube de seringue et retirer le piston.
- Suspendre la seringue environ 8 &# 160; dessus de la base d'un anneau-support à l'aide d'une pince.
- Connectez un robinet à une voie à l'extrémité de la seringue. À l'extrémité opposée du robinet d'arrêt, connecter un morceau de tube, de 2 mm de diamètre, ce qui est assez longue pour s'étendre jusqu'à la base de l'intubation.
- Système de perfusion pour l'électrophysiologie
Pour les expériences électrophysiologiques, il est souvent nécessaire d'introduire une variété de composés au cours d'une expérience. Une variété de systèmes sont disponibles, mais un système à gravité comprenant des seringues de 60 ml en série peut être utilisé. Cette configuration permet d'introduction simple, série de solutions à réaliser en ouvrant le robinet correspondant.- Obtenir deux ou plusieurs seringues de 60 ml Luer lock et retirer les pistons de chacun. Une seringue est nécessaire d'administrer de l'eau à l'habitat du poisson tandis que chaque tube subséquent peut être utilisée pour administrer une grande variété de composés pharmacologiques pour le poisson.
- Connectez chaque seringue pour un 3 -robinet chemin avec une connexion Luer.
- Utilisation ⅛ de diamètre externe (OD) des tubes pour raccorder les seringues en série avec un verrou Luer mâle à une extrémité.
- Fixer le dispositif de telle sorte que la tête de pression est élevée à une hauteur de 27 à au-dessus de la base, ou une hauteur constante qui produit un débit de ~ 1 ml / min.
- Canule d'intubation
La canule d'intubation facilite l'introduction de fluide vers le poisson. Cette installation fournit la flexibilité et la fermeté de mieux positionner la canule dans la bouche de l'animal.- L'utilisation d'un paire de ciseaux général (par exemple. Fiskars) ou une lame de rasoir, supprimer une section de 1,5 cm de l'extrémité large de la pointe de la pipette P-200.
- Insérer un morceau de tuyau mm 6 cm x 1 dans un détendeur avec un capuchon Luer femelle de verrouillage et le manchon silicone, à savoir un adaptateur Tuohy Borst, et insérer cette canule dans l'embout de pipette modifié. Maintenez la pointe de la pipette en position avec le luer lock en utilisant une courte portion de ⅛ en tube de diamètre.
Figure 1
- base de l'intubation
Ce plat est utilisé pour maintenir l'animal immobilisé dans une position verticale stable, et pour faciliter le retrait du fluide entrant dans l'animal à travers l'intubation. Si ce n'est pas établie correctement, la mise en commun peut se produire, conduisant à des signaux vibratoires intrusives dans l'enregistrement électrophysiologique.- Obtenir le plat de base d'une boîte de Pétri de 100 mm x 15 mm en plastique.
- L'utilisation d'un outil de soudure, faire fondre un trou de 6 mm de diamètre et de 7,5 mm en dessous de la lèvre de la jante, dans le côté de l'assiette. En utilisant le même outil, faire fondre un trou de 10 mm de diamètre et de 11 mm en dessous de la lèvre de la coupelle ~ 74 ° dans le sens antihoraire à partir de la petit trou. Ce trou servira le trou de drainage.
- Insérer un tube de 1 cm de diamètre, dans le trou avec l'extrémité soulevés de telle sorte que l'extrémité ne peut pas être bloqué. Ensuite, insérez une pointe P-200 pipetteman dans le petit trou, ce qui servira de canule factice.
- Avec la boîte de Pétri légèrement surélevée sur le côté du plus grand trou, verser de la cire fondue de la conserve dans le moule de telle sorte que le trou de la canule est juste recouverte. La région servira de butée, ce qui permet à la canule insérée ~ 3 mm dans la bouche du poisson. Cette mise en place devrait être autorisé à se solidifier.
- L'utilisation d'un bord en métal de flamme chauffé, se tailler un canal de tenir le poisson de sorte que la chaîne commence à partir de la pointe de la canule et s'étend sur environ 1-2 po
- Des précautions doivent être prises pour assurer que l'angle vers le bas en continu à partir de la zone de la canule à l'orifice de drainage est formé.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Figure 2
- Des précautions doivent être prises pour assurer que l'angle vers le bas en continu à partir de la zone de la canule à l'orifice de drainage est formé.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- configuration de la perfusion
- Avant de commencer, rincer les perfusion set-up avec de l'eau de l'habitat, veiller à ce que toutes les bulles d'air sont éliminées.
- Ajouter ~ 30 ml de 0,016% (630 M) solution de tricaïne à la configuration craniotomie de perfusion et permettent ~ 2 ml à courir à travers les tuyaux pour tricaine sera livré à l'animal sur la perfusion initiation. Voir l'étape 2.2 pour la dilution.
- À la configuration principale de perfusion, ajouter ~ 50 ml d'eau de l'habitat dans le premier tube. Ajouter tous les composés expérimentaux désirées à chacun des tubes restants.
- Placer la configuration de la canule dans le petit trou de la base de l'intubation.
- Twist un 1 dans une large bande de 42 cm Kimwipe dans une spirale serrée et l'insérer dans le tube de drainage de telle sorte que la Kimwipe s'étend sur les deux extrémités. Ce tissu servira de mèche pour éliminer le liquide perfusé et pour éviter l'accumulation de fluide dans til intubation base, ce qui pourrait interférer avec l'enregistrement électrophysiologique.
- Insérer une extrémité du tuyau dans le grand trou de la boîte de Petri, ce qui permet à l'extrémité inférieure s'étend dans un plat inerte qui est assez grand pour recueillir tous les déchets de perfusion. Ce plat servira de réservoir de sortie pour la configuration. Positionner le tissu de telle sorte que l'une des extrémités se trouvera à proximité de la région de l'abdomen de l'animal et de l'extension inférieure peut goutter dans le plat.
- Placez cette base d'intubation terminée près de la loupe binoculaire. Connectez le verrou Luer de la canule à la tubulure de perfusion tricaine.
- aiguille capillaire et les électrodes
- Obtenir une électrode primaire constitué de 2,5 à 0,010 en fil d'argent et une électrode secondaire qui devrait être composé de 15 du même fil à la terre de l'installation. Pour l'électrode secondaire, utiliser un 15 dans la section de 0,010 en fil d'argent avec une pointe soudée, qui lui permet de s'adapterà l'arrière d'une tête-scène.
- Galvaniser les conseils des deux primaires et secondaires fils d'argent avec des ions de chlorure.
- Aide d'un extracteur micropipette, tirer, une aiguille capillaire de borosilicate à paroi mince avec une résistance de <15 mQ.
- Remplir l'aiguille capillaire avec 2-3 ul de 2 M de chlorure de potassium, ou suffisamment pour couvrir partiellement la pointe de chlorure revêtu du fil d'argent.
- Insérer l'électrode primaire dans la tête de capillaire et de le monter dans le porte-électrode.
- Montez la tête-étape dans un micromanipulateur et puis montez l'électrode secondaire dans un deuxième micromanipulateur. Avec la mise en place, première position de chaque électrode et puis monter la pointe soudée de l'électrode secondaire à l'arrière de la tête-scène.
- Obtenir une électrode primaire constitué de 2,5 à 0,010 en fil d'argent et une électrode secondaire qui devrait être composé de 15 du même fil à la terre de l'installation. Pour l'électrode secondaire, utiliser un 15 dans la section de 0,010 en fil d'argent avec une pointe soudée, qui lui permet de s'adapterà l'arrière d'une tête-scène.
2. Préparation des solutions, système de perfusion, et électrophysiologique Matériel d'enregistrement
- Obtenir 1 L d'eau de l'habitatde l'aquarium de poissons.
- 0,016% T] méthanesulfonate de tricaïne (tricaine) (50 ml de 630 uM) 24.
- Décongeler une aliquote de 0,4% tricaïne tamponnée au Tris, pH 7,2.
- Ajouter 2,1 ml de 0,4% tricaine tampon Tris à 47,9 ml d'eau de l'habitat et mélanger.
- Décongeler concentration du stock de composé désiré soluble dans l'eau expérimentale (par exemple mM pentylenetetrazol 300, un chemoconvulsant commun).
- Dégeler une partie aliquote de 1 pg / pl de bromure de pancuronium dans une solution de Ringer.
- Remplissez la fois anesthésiant et systèmes d'intubation expérimentales avec de l'eau de l'habitat et de vidange au moins assez pour enlever toutes les bulles de tubes. Ceci doit être fait parce que les bulles obstruent l'écoulement du fluide, conduisant à l'asphyxie de l'animal.
- Vider complètement les tubes de perfusion qui tiendra médicaments sans permettre à l'air dans le tube de raccordement.
- Remplir le tube anesthésiant avec 0,016% (630 M) solution de tricaine et placer une expertiseimental composé (s) dans le tube (s) supplémentaire sur le système de perfusion expérimentale.
- Le premier tube de perfusion expérimentale devrait contenir de l'eau de l'habitat seulement.
- Humidifiez la petite éponge de pores avec de l'eau de l'habitat et mettre dans un 60 mm x 15 mm boîte de Petri vide. Ce plat sera utilisé pour maintenir le poisson tandis que l'anesthésique est injecté.
3. Craniotomie
- Ajouter suffisamment de la solution de tricaine 630 uM à une boîte de Pétri de 15 x 60 mm pour le remplir environ les trois-quarts du chemin. Peser le plat rempli. Ceci sera utilisé pour immobiliser l'animal de telle sorte que plus de l'anesthésie peuvent être injectés par voie intrapéritonéale.
- Immerger l'animal dans le plat contenant tricaine et peser à nouveau le plat.
- Soustraire la différence entre les poids des étapes 1 et 2 pour obtenir le poids du poisson.
- Laisser l'animal de rester dans la solution de tricaine que le calme et la plupart mouvement a cessé.
- En utilisant une paire de grandes pinces, transférer le poisson à l'éponge préhumidifié et positionner latéralement. Transfert du poisson par la queue fonctionne bien pour ce processus.
- Placez l'éponge et le poisson sous le microscope de dissection.
- Avec une seringue contenant Nanofil une aiguille 34 G, doser suffisamment bromure de pancuronium telle qu'il y ait 1 ug / g de poids du poisson.
- L'utilisation d'un bâton de popsicle le long de la face dorsale du poisson pour le maintenir stable, administrer le bromure de pancuronium par voie intrapéritonéale en utilisant la seringue Nanofil.
- En utilisant les fines pinces, saisir le poisson par la mâchoire inférieure et rapidement transférer l'animal à la base de l'intubation.
- Placer l'animal de sorte qu'il est rapproché dorsal sur la forme de cire et de telle sorte que la canule de 1 mm peut être inséré dans la bouche. Utilisez les pinces fines pour manœuvrer le poisson et ouvrir la bouche autour de la canule. En raison de la composition du plateau d'intubation, une butée a été conçue dans la base, permettant à l'canule à insérer 3 mm dans la bouche du poisson.
- Une fois en position, tourner sur le tube de perfusion par gravité contenant tricaine.
- Coupez une section de 3 cm 2 de tissu Kimqipe et mouiller avec de l'eau de l'habitat.
- Placez le tissu sur l'animal pour éviter la dessiccation. La section Kimwipe peut également être positionné afin d'aider à la tenue de l'animal dorsal-up.
- Sous le microscope de dissection, utiliser vanna ciseaux à ressort pour enlever ~ 2 mm 2 section du crâne recouvrant le toit optique. Cette zone ressemble à une plaque osseuse sombre qui se trouve derrière l'œil.
Figure 3- Insérez une lame de ciseaux vanna au bord de la plaque et pousser avec assez de force pour la pénétrationTE l'os, sans percer le cerveau. Fermez les ciseaux pour couper l'os.
- Retirez le morceau d'os.
- Si du sang est présent, retirez utilisant le bord d'un Kimwipe. Saignement s'arrête généralement peu de temps après l'exécution de la craniotomie.
4. Électrophysiologie
- Coupez l'intubation robinet d'arrêt et débranchez le luer lock reliant la base d'intubation à la goutte de tricaine rapidement.
- Déplacez la configuration d'intubation intact au microscope d'électrophysiologie et se connecter au système de perfusion.
- Tournez sur l'eau de l'habitat et perfuser à un débit de 1 ml / min pendant environ 1 heure, afin de laver l'tricaine.
- L'utilisation d'un micromanipulateur sous contrôle visuel, la position de l'électrode secondaire, de sorte que la pointe de l'électrode peut être insérée dans la narine de l'animal ou dans le creux derrière la mâchoire supérieure.
- Insérer l'aiguille d'électrode primaire dans l'ouverture de la craniotomie. Insérez leaiguille dans le tissu, de telle sorte que la pointe est positionnée à l'intérieur de la assez superficielle toit optique.
- Si l'électrode est trop profonde, le signal électrique peut être petit.
- Recueillir et analyser la différence électrique enregistrée entre les électrodes de référence primaires et secondaires. Ce processus permettra d'enregistrements extracellulaires être obtenus.
- Recueillir les données en mode sans jeu à un taux d'échantillonnage de 5 kHz, avec un filtre passe-bas de 0,1 kHz et un filtre passe-haut de 1 Hz.
- Ne pas commencer l'enregistrement de l'activité électrophysiologique que l'eau de l'habitat a perfusé pour un minimum de 45 min.
- Enregistrer une ligne de base de l'activité native à au moins 15 min avant l'addition de médicaments expérimentaux. Commencez perfusion avec des médicaments expérimentaux de choix et record pour la durée souhaitée. Dans les préparations en bonne santé, il est possible d'enregistrer l'activité neurologique de 2 à 3 h.
5. Clean Up
- Euthanasier l'animal par une surdose de drogue en utilisant tricaine conformément aux pratiques acceptées, comme indiqué par l'American Veterinary Medical Association (AVMA) Lignes directrices pour l'euthanasie des animaux (2013).
- Poisson zèbre à être euthanasié doit être placé dans une solution de tricaïne à 200-500 mg / L. Les poissons sont à gauche dans la solution pendant un minimum de 10 minutes après l'arrêt de l'activité operculaire rythmique, après quoi ils sont soumis à un moyen physique d'euthanasie (de résection du col utérin) pour s'assurer de la mort.
- Faites couler l'eau DI à travers tous les tubes et relever pour la disposition appropriée, si dangereux.
- Laisser les robinets d'arrêt pour chaque tube dans la position ouverte pour faciliter le séchage de l'air.
- Faire tremper les électrodes dans 70% d'éthanol et laisser sécher à l'air.
- Nettoyer chaque pièce avec 70% d'éthanol et laisser sécher à l'air.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ce protocole a été utilisé pour mesurer l'activité neuronale de poisson zèbre adulte in vivo. Ces enregistrements électrophysiologiques sont systématiquement et de façon reproductible obtenus. Figure 5 montre un exemple représentatif de modifications indigènes et induits de l'activité neuronale d'un poisson zèbre adulte quand pentylenetetrazol (PTZ), une chemoconvulsant commun 6,7,25,26, est introduit dans l'intubation configuration.
L'activité neurologique natif du poisson zèbre adulte a été suivie pour chaque expérience (figure 5A). On a constamment observé que cette activité est spontanée et de petite amplitude pendant la durée de l'enregistrement. Après l'introduction du PTZ mM 15 au système, décharges épileptiformes comme spontanées ont commencé à développer environ 5 min. après l'introduction. Cette activité a d'abord été brève, de faible amplitude et s'est fréquemment, semblable à ce qui a été observé dans z larvaireebrafish 6,7. Avec une exposition continue au PTZ, un modèle cohérent de grandes décharges d'amplitude développés qui ont été suivies par de petits éclats, plus fréquentes de l'activité et une période de calme ultérieure (figure 5B).
Cette technique a été utilisée avec succès pour introduire d'autres chemoconvulsants à travers le système d'intubation. Avec ces composés, les changements dans l'activité neurologique maternelle ont également été évoqués de manière efficace. Pentylenetetrazol a été utilisée ici comme exemple du fait qu'il capacité à modifier l'activité neuronale robuste originaire du poisson zèbre de façon stéréotypée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole a été utilisé pour mesurer l'activité neuronale de poisson zèbre adulte in vivo. Avec la pratique, l'activité neuronale peut être observée régulièrement, bien que les caractéristiques (amplitude et la forme des événements) de l'activité enregistrée peuvent varier entre individus. L'utilisation de la technique d'enregistrement extracellulaire peut expliquer cette observation. Le procédé permet la surveillance simultanée d'un grand nombre de cellules au sein d'une région 1, de sorte que les variations dans le positionnement de l'électrode primaire peut jouer un rôle dans l'activité observée. Profondeur de l'électrode primaire modifie également la région qui est mesuré. Si la pointe de l'électrode est positionné trop bas dans une région, le signal observé sera plus faible que prévu et les altérations de l'activité seront plus difficiles à observer, si cela se produit, il suffit de retirer l'électrode primaire de sorte que la pointe est assis plus superficiellement . Prenez note que cette caractéristique du toit optique et a ne pas êtrefr regardé en profondeur dans d'autres régions du cerveau. Toutefois, cette procédure peut être effectuée dans une autre région du cerveau. Si l'activité neuronale observée diminue à des niveaux de référence au cours de l'expérience et il est incertain si le poisson est encore vivant, enlever les électrodes du crâne et vérifier pour voir si il ya encore le flux sanguin dans l'animal. Ceci peut être vérifié en observant les gros vaisseaux dans la lèvre ou de la zone nasale du poisson. Le flux sanguin peut être facilement vu dans ces régions. Si les électrodes sont retirées pour vérifier le débit sanguin dans le milieu d'un enregistrement, lors du repositionnement des électrodes, ils seront dans un endroit légèrement différent que ce qu'ils étaient au départ, niant la possibilité de comparer directement cette partie de l'enregistrement de la référence d'origine .
Avant de commencer cette procédure, il faut veiller à ce que les tubes d'intubation ainsi que les tubes de perfusion à la fois pour la craniotomie et les configurations d'électrophysiologie sontsans les bulles. Si les bulles ne perçoivent, ils peuvent être exécutés sur le système en ouvrant le robinet d'arrêt et permettant à certains de l'eau de l'habitat à courir à travers. Si cela n'élimine pas le problème, d'une petite seringue peut être attachée à l'extrémité du tube, où la canule serait placé, et la lumière d'aspiration appliqué pour éliminer tout air restant dans le système. Pour bulles persistantes, l'eau de l'habitat peut être forcé à travers le tube. Aussi, assurez-vous que les tubes de perfusion sont amorcées et dégoulinant avant intubation du poisson. Si un taux de ~ 1 ml / min n'est pas atteinte, la hauteur de la tête de pression peut être modifiée dans le but d'y parvenir. Cela permettra d'assurer que le poisson a accès à débit d'eau suffisant. Lorsque la configuration électrophysiologie de perfusion est configuré avec de nombreux tubes en série, il a été déterminé que cela a pris environ ~ 1 min de la nouvelle solution d'être présenté à l'animal, bien que des changements résultant de l'activité neurologique enregistrée dépendaient le bein composég introduit. Il est conseillé que ce débit est mesuré avant d'effectuer des expériences. Des travaux antérieurs ont montré que tricaine peut atténuer l'activité neuronale, l'obligeant à être retiré du système afin d'obtenir des enregistrements précis 27,28. Grâce à un travail précédent, il a été déterminé qu'une période de 45-60 min de l'intubation avec de l'eau de l'habitat est nécessaire pour laver le tricaine et pour l'activité de neurones pour atteindre des niveaux indigènes. De même, lavage de pentylènetétrazole a également été réalisée, et il a été déterminé qu'une période de 20 minutes a été nécessaire de retourner l'activité neuronale au niveau de base. Par conséquent, les expérimentateurs doivent compléter des essais pour déterminer les temps de lessivage pour chaque composé d'intérêt est introduit dans le système.
Cette technique nécessite un peu de pratique. Lors de la craniotomie, des précautions supplémentaires doivent être prises pour veiller à ce que une petite région de la plaque osseuse qui recouvre la tête peut être percé et enlevé sans endommagerle cerveau. Ceci peut être réalisé en introduisant les ciseaux vanna à un angle aigu par rapport à la tête. La zone osseuse couvrant le toit optique a fusions près du centre qui sont faibles et servent de bons points pour les ciseaux d'entrée. Une fois une petite pause a été faite dans la plaque, utiliser des ciseaux pour couper une petite zone de l'os, et de supprimer l'aide d'une paire de pinces fines. Poissons plus jeunes ont souvent plus douces, plus souples crânes, si les poissons qui sont âgés de 1 an ou moins sont proposés pour une utilisation pendant l'apprentissage de cette technique. Parfois, le sang commence à s'accumuler autour de la région de la craniotomie, mais cela peut être retiré en tamponnant un Kimwipe doucement autour de la zone. Avec cette procédure, la craniotomie est très faible, étant d'environ 2 mm 2 de surface. En raison de cette petite taille, la dessiccation de la région crânienne n'a pas eu lieu. Cependant, si la craniotomie est de plus grande taille, il est possible d'appliquer la gélose ou d'un autre matériau afin d'éviter la perte d'humidité à partir du cerveau si cela ne devienne un problème.
Un point d'intérêt est l'utilisation du bromure de pancuronium. Ce produit chimique est stocké dans des aliquotes de 10 pl pour empêcher la congélation et la décongélation répétitive. Le volume suggéré pour être utilisé dans une expérience, étant de 1 ul par gramme de poids, est généralement suffisant pour immobiliser un poisson de l'adulte. À l'occasion, cependant, ce volume n'est pas adéquate. Lorsque cela se produit et la paralysie n'est pas obtenue, le bromure de pancuronium plus peut être administrée par voie intrapéritonéale à des poissons, aussi longtemps que l'enregistrement n'a pas commencé. Lors de l'injection, ne pas essayer d'injecter à travers les échelles difficiles secondaires; injecter le poisson dans la région de l'abdomen plus doux, près de l'évent. Si le poisson commence à se déplacer une fois l'électrode primaire a été placé, il ya une bonne chance que l'aiguille a été interrompue sur la craniotomie, et la procédure doit être répétée en utilisant un nouvel animal. Grâce à ces travaux, il a été déterminé que le bromure de pancuronium peut réduire le neuronal enregistréactivité larvaire chez le poisson zèbre (≤ 50% de l'amplitude de référence) et il est supposé que la même chose vaut pour les adultes. Toutefois, l'expérience récente, l'activité neuronale chez un adulte est suffisamment robuste que les effets modérateurs attribués au bromure de pancuronium ne semblent pas nuire à la capacité de recueillir et d'analyser les données. En revanche, les facteurs de confusion liés à la motion peuvent être importantes. Pour cette procédure, les avantages de l'immobilité complète de l'animal est de valeur au-delà de cette limite et les changements neuronaux qui sont introduits sont assez solides pour persister au-delà des effets d'amortissement. En outre, tout mouvement de l'animal peut déplacer l'électrode, être enregistré par l'équipement d'enregistrement d'électrophysiologie et mettre en danger l'animal.
Les limites de cette technique se situent principalement dans le fait que l'enregistrement extracellulaire est le seul moyen possible d'enregistrer l'activité neurologique dans le poisson zèbre adulte intact. Lors du positionnement de la première ry électrode, l'aiguille doit être insérée dans la craniotomie, ce qui empêche de voir l'un exactement là où l'électrode est placée. Bien que, en pratique, il est possible de positionner l'électrode à l'intérieur de la même région et à la même profondeur constante.
En électrophysiologie in vivo a été largement limitée à larves de poisson zèbre. Cela est dû à la capacité d'immobiliser facilement les petits poissons et le fait qu'ils ne nécessitent pas l'intubation. Par conséquent, les études électrophysiologiques ont mis l'accent sur les stades larvaires et peu a été fait en ce qui concerne l'activité électrophysiologique dans le cerveau adulte. Cela a empêché toute comparaison entre des mineurs et de l'activité neurologique adulte à faire. L'utilisation du système d'intubation multitubulaire permet l'introduction aisée d'une variété de composés aux poissons. Cela permet aussi pour les effets de différents médicaments ou des drogues à étudier dans les deux systèmes larves et les adultes.
nt "fo: keep-together.within page =" always ">
Figure 1. Canule d'intubation. Supprimer une section de 1,5 cm de l'extrémité large de la pointe P-200 pipetteman jaune (A). Insérez une pièce de 6 cm mm x 1 tube (flèche) dans un Luer Lock réduire connecteur (B) et insérer cette canule dans la pointe de la pipette modifié. Maintenir l'embout de pipette en position à l'aide d'un verrouillage Luer courte portion de ⅛ en tube (C).
Figure 2. Fini la configuration de base de l'intubation. Une fois la cire du Golfe a refroidi, placer la configuration de la canule dans le petit trou de la intubation base de (A). Twist un 1 dans une large bande de 42 cm Kimwipe dans une spirale serrée et l'insérer dans le tube de drainage de telle sorte que la Kimwipe s'étend sur les deux extrémités. Insérer une extrémité du tube de drainage dans le grand trou de la boîte de Pétri (B), permettant à l'extrémité inférieure pour s'étendre dans une 30 mm x 100 mm cristallisoir (non visible). Placez le tissu de sorte qu'une extrémité se situera près de la région de l'estomac de l'animal (voir ci avec la ligne noire en pointillés) et l'extension inférieure peut couler dans le plat.
Figure 3. Craniotomie. Sous le microscope de dissection, utiliser vanna ciseaux à ressort pour enlever ~ 2 mm 2 section du crâne recouvrant le toit optique. Cette zone ressemble à une plaque osseuse trapézoïdale sombre que l'artson derrière l'œil. Le cercle en pointillé délimite où la craniotomie est positionné. La pointe de flèche indique qu'il y aura de l'aiguille de l'électrode primaire est positionné dans le trou de la craniotomie. L'électrode primaire est constitué d'une section de 2,5 à 0,010 en fil d'argent qui a été électrolytiquement avec les ions chlorure et insérée dans une aiguille capillaire borosilicate. L'aiguille capillaire est rempli avec 2-3 ul de 2 M de chlorure de potassium, ou suffisamment pour couvrir partiellement la pointe de chlorure revêtu du fil d'argent. L'électrode secondaire est constitué d'une section de 15 dans le même fil utilisé pour l'électrode primaire, sauf que la pointe est soudée à une extrémité, ce qui lui permet d'être inséré dans le dos de la tête étapes. L'extrémité du fil secondaire qui doit être positionné de toucher le poisson doit aussi être électrolytiquement avec les ions chlorure. La flèche indique l'endroit où l'électrode secondaire a été placé à l'intérieur de la narine droite de poissons adultes.
Figure 4. Le programme d'installation pour la collecte de l'activité électrophysiologique. L'installation d'intubation intact est déplacé vers le microscope d'électrophysiologie et la canule est connectée au système de perfusion (A). L'eau du système doit être activée, ce qui permet de démarrer immédiatement la perfusion. Utilisation du micromanipulateur, positionner l'électrode secondaire (B) de sorte que la pointe de l'électrode est insérée dans la narine de l'animal ou dans le creux derrière la mâchoire supérieure (flèche). Insérer l'aiguille d'électrode primaire (C) dans l'ouverture de la craniotomie. Insérer l'aiguille de telle sorte qu'il est positionné assez superficielle au sein du toit optique. Le grand tube de drainage (D) s'étend à partir du plat d'intubation, en dehors du champ de vue, et dont l'autre extrémité débouche en til plat de collection.
Figure 5. Des enregistrements électrophysiologiques dans le toit optique. (A) On a toujours observé que l'activité native dans le toit optique du poisson zèbre adulte est stéréotypée spontanée, montrant faible amplitude (2-10 mV) activité pendant toute la durée de l'enregistrement. (B) Après l'introduction du PTZ mM 15 au système, décharges épileptiformes comme spontanées ont commencé à développer environ 5 min après l'introduction. Cette activité a d'abord été brève, de faible amplitude. Avec une exposition continue à l'PTZ, un modèle cohérent de grande amplitude (jusqu'à 15 mV) rejets développés qui ont été suivies par de petits éclats, plus fréquentes d'activité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH / NINDS Grant R01NS070159 (à la DGT, JDL et ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M.
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
