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Neuroscience

बरकरार वयस्क zebrafish के मस्तिष्क में electrophysiological रिकॉर्डिंग

Published: November 19, 2013 doi: 10.3791/51065
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 2
1Department of Genetics, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia, 3College of Engineering, Architecture and Technology, Oklahoma State University, 4University of Georgia, 5Department of Mathematics, University of California, Davis

Summary

इस पत्र में एक वयस्क zebrafish, immobilized intubated, और रिकॉर्डिंग और एक अक्षुण्ण जानवर में तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर की अनुमति के लिए vivo में electrophysiological प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता कैसे करें.

Abstract

इससे पहले, वयस्क zebrafish में electrophysiological पढ़ाई की तैयारी या आंख कप की तैयारियों और electrorentinogram रिकॉर्डिंग करने के लिए टुकड़ा करने के लिए सीमित किया गया है. इस पत्र में तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति, एक वयस्क zebrafish, immobilized intubated, और vivo में electrophysiological प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता कैसे करें. वयस्क का स्थिरीकरण मुख और opercular आंदोलन के एवज में गहरे नाले में भंग ऑक्सीजन देने के लिए एक तंत्र की आवश्यकता है. हमारे तकनीक के साथ, जानवरों स्थिर रहे हैं और इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए निवास के जल के साथ perfused. एक कपाल - उच्छेदन tricaine methanesulfonate तहत किया जाता है (एमएस-222; tricaine) संज्ञाहरण मस्तिष्क के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए. प्राथमिक इलेक्ट्रोड तो बाह्य मस्तिष्क गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए कपाल - उच्छेदन खिड़की के भीतर तैनात है. एक multitube छिड़काव प्रणाली के उपयोग के माध्यम से, औषधीय यौगिकों की एक किस्म तंत्रिका गतिविधि में वयस्क मछली और किसी भी परिवर्तन करने के लिए प्रशासित किया जा सकता हैदेखा जा सकता है. कार्यप्रणाली मस्तिष्क संबंधी गतिविधियों में परिवर्तन के बारे में किए जाने की टिप्पणियों के लिए अनुमति देता है, न केवल लेकिन तुलना लार्वा और वयस्क zebrafish के बीच किए जाने के लिए भी अनुमति देता है. यह शोधकर्ताओं के कारण विभिन्न जीवन चरणों में विभिन्न यौगिकों की शुरुआत करने के लिए मस्तिष्क संबंधी गतिविधि में परिवर्तन की पहचान करने की क्षमता देता है.

Introduction

इस अनुच्छेद में, एक प्रोटोकॉल वयस्क zebrafish में तंत्रिका गतिविधि के vivo रिकॉर्डिंग में प्राप्त करने के लिए वर्णित है. कोशिकी रिकॉर्डिंग तरीकों तंत्रिका ऊतक के एक छोटे से क्षेत्र के भीतर बिजली की गतिविधि का वोल्टेज माप उपलब्ध कराने, उपयोग किया जाता है. जांच का यह तरीका एक बर्ताव पशु 1 में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की निगरानी शामिल है. इससे पहले, टुकड़ा रिकॉर्डिंग आंख कप की तैयारियों और electroretinogram रिकॉर्डिंग के रूप में, वयस्क और लार्वा दोनों में प्रदर्शन किया गया है. इन प्रयोगों से काफी हद तक विभिन्न संवेदी प्रणाली 2-5 की शारीरिक प्रतिक्रियाओं विस्तार करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. अभी हाल तक बरकरार मस्तिष्क की तैयारी ही श्वसन और ऑक्सीजन प्रसार त्वचा के माध्यम से हो सकता है, जहां zebrafish लार्वा 3,6,7, साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रदर्शन के लिए उपलब्ध किया गया है. हमारी तैयारी जानवर ओ पूरी तरह सचेत और जागरूक रहता है, जबकि एक वयस्क zebrafish के मूल निवासी मस्तिष्क संबंधी गतिविधि मापा जा करने की अनुमति देताच उसके आसपास.

Zebrafish (Danio rerio) वर्तमान में, आनुवंशिक विषाक्तता, औषधीय, और physiopathological पढ़ाई 3 के लिए एक मॉडल के रूप में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं. वे आनुवंशिक, तंत्रिका और अंत: स्रावी स्तर 8 में स्तनधारियों के साथ व्यापक अनुरूपता साझा क्योंकि Zebrafish तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में दृश्यता प्राप्त की है. पिछले दशक के दौरान, मानक neuroanatomic और immunohistochemical तकनीक zebrafish तंत्रिका तंत्र 9-12 से और अलग न्यूरोट्रांसमीटर 3,8,13 के वितरण की विस्तृत विशेषता संगठन का निर्धारण किया गया है. अभी हाल ही में शोधकर्ताओं व्यवहार प्रक्रियाओं 16-19 और संवेदी प्रणाली 2,13,20 के electrophysiological विशेषताओं पर केंद्र, जिनमें से कई कार्यात्मक अध्ययन 14,15, के लिए उनके ध्यान स्थानांतरित कर दिया है. इन अध्ययनों की एक छोटी संख्या Adul के विशिष्ट क्षेत्रों की विद्युत गतिविधि पर ध्यान केंद्रित किया हैzebrafish मस्तिष्क 21-23 टी, लेकिन एक में विवो दृष्टिकोण का उपयोग कर बाहर नहीं किया गया.

इस प्रोटोकॉल विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में गतिविधि के पैटर्न का वर्णन करने के लिए zebrafish तंत्रिका तंत्र के भीतर दोनों सहज और पैदा की गतिविधि के electrophysiological अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता. इस तकनीक का उपयोग तुलना युवा लार्वा चरणों और वयस्कों के मस्तिष्क संबंधी गतिविधि के बीच किए जाने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल आनुवंशिक या औषधीय परिवर्तन के बीच तुलना परमिट. साथ में इस तरह के जेनेटिक इंजीनियरिंग या औषधीय परीक्षण के रूप में अन्य तरीकों के साथ, इस विधि इस तरह देर से शुरू होने मिर्गी या neurodegenerative प्रक्रियाओं का अध्ययन के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के लिए neuronal संचार और plasticity बरकरार वयस्क जानवर में के रूप में भी कार्य से विश्लेषण के लिए एक नई संभावना प्रदान करता है.

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ सख्त अनुसार आयोजित की और, की समीक्षा की मंजूरी दे दी है, और जॉर्जिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग विश्वविद्यालय की देखरेख कर रहा था जो प्रोटोकॉल # A2011 09-003, पीछा किया गया था समिति.

1. उपकरण सेटअप

  1. कपाल - उच्छेदन के लिए छिड़काव प्रणाली
    वयस्क का स्थिरीकरण मछली को भंग ऑक्सीजन देने के लिए एक इंटुबैषेण प्रणाली जरूरी है. प्रणालियों की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक 60 मिलीलीटर सिरिंज से मिलकर एक साधारण गुरुत्वाकर्षण प्रणाली प्रयोग किया जाता है. लगातार ~ 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर है कि पैदावार ऊंचाई तक दबाव सिर को ऊपर उठाना. इस सिरिंज तो electrophysiological छिड़काव प्रणाली के लिए उपयोग किया जाता है कि सीरिंज के साथ श्रृंखला में रखा जा सकता है.
    1. एक एकल 60 मिलीलीटर luer ताला सिरिंज ट्यूब प्राप्त करें और सवार को हटा दें.
    2. लगभग 8 & में सिरिंज निलंबित# 160; एक क्लैंप का उपयोग कर एक अंगूठी स्टैंड के आधार से ऊपर.
    3. सिरिंज के अंत करने के लिए एक तरह से पानी निकलने की टोंटी से कनेक्ट करें. पानी निकलने की टोंटी के विपरीत अंत करने के लिए, इंटुबैषेण आधार का विस्तार करने के लिए लंबे समय पर्याप्त है जो टयूबिंग की एक टुकड़ा, व्यास में 2 मिमी, कनेक्ट.
  2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए छिड़काव प्रणाली
    Electrophysiological प्रयोगों के लिए, यह एक प्रयोग के दौरान यौगिकों की एक किस्म शुरू करने की अक्सर आवश्यक है. प्रणालियों की एक किस्म उपलब्ध हैं, लेकिन इस श्रृंखला में 60 मिलीलीटर सीरिंज से मिलकर एक गुरुत्वाकर्षण प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है. इस सेटअप इसी पानी निकलने की टोंटी खोलकर बाहर ले जाने के समाधान के सरल, धारावाहिक परिचय के लिए अनुमति देता है.
    1. दो या दो से अधिक 60 मिलीलीटर luer ताला सीरिंज प्राप्त करें और प्रत्येक से plungers हटा दें. एक सिरिंज प्रत्येक बाद ट्यूब मछली को औषधीय यौगिकों की एक किस्म के प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि मछली के लिए वास पानी प्रशासन के लिए आवश्यक है.
    2. एक 3 करने के लिए प्रत्येक सिरिंज कनेक्ट -जिस तरह से एक Luer कनेक्शन के साथ पानी निकलने की टोंटी.
    3. एक छोर पर एक पुरुष luer ताला के साथ श्रृंखला में सीरिंज कनेक्ट करने के लिए बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) ट्यूबिंग में ⅛ का प्रयोग करें.
    4. दबाव सिर आधार से ऊपर में 27 की ऊंचाई, या लगातार ~ 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर है कि पैदावार ऊंचाई से ऊपर उठाया है कि ऐसी डिवाइस सुरक्षित.
  3. इंटुबैषेण प्रवेशनी
    इंटुबैषेण प्रवेशनी मछली के लिए तरल पदार्थ की शुरूआत की सुविधा. इस सेटअप सबसे अच्छी स्थिति पशु के मुंह के भीतर प्रवेशनी के लिए लचीलापन और दृढ़ता दोनों प्रदान करता है.
    1. कैंची की किसी भी सामान्य जोड़ी (जैसे. Fiskars) या एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, एक पी 200 पिपेट टिप के व्यापक अंत से 1.5 सेमी अनुभाग हटा दें.
    2. एक Tuohy Borst एडाप्टर यानी एक महिला luer ताला टोपी और सिलिकॉन सामी के साथ एक कम करने के वाल्व में टयूबिंग की एक 6 सेमी x 1 मिमी टुकड़ा डालें, और संशोधित पिपेट टिप में इस प्रवेशनी डालें. Luer एल के साथ स्थिति में पिपेट टिप पकड़ोव्यास ट्यूबिंग में ⅛ की एक छोटी हिस्से के प्रयोग ock.

      चित्रा 1
      चित्रा 1

  4. इंटुबैषेण आधार
    यह पकवान एक स्थिर, ईमानदार स्थिति में स्थिर पशु पकड़ लिए और इंटुबैषेण के माध्यम से पशु में प्रवेश तरल पदार्थ को हटाने की सुविधा के लिए प्रयोग किया जाता है. यह सही ढंग से स्थापित नहीं है, तो पूलिंग electrophysiological रिकॉर्डिंग में दखल देने से कंपन संकेत करने के लिए अग्रणी हो सकता है.
    1. एक 100 मिमी x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के आधार पकवान प्राप्त करते हैं.
    2. एक टांका उपकरण का उपयोग, पकवान के पक्ष में एक छेद, व्यास में 6 मिमी और रिम के होंठ के नीचे 7.5 मिमी, पिघला. एक ही उपकरण का उपयोग, एक छेद, व्यास में 10 मिमी और पकवान के होंठ के नीचे 11 मिमी ~ से 74 डिग्री वामावर्त पिघला छोटे छेद. इस छेद जल निकासी छेद के रूप में काम करेगा.
    3. एक ट्यूब डालें, अंत के साथ छेद में व्यास में 1 सेमी, अंत अवरुद्ध नहीं किया जा सकता कि इस तरह उठा लिया. फिर छोटे छेद में एक पी 200 pipetteman टिप डालने, यह एक डमी प्रवेशनी के रूप में काम करेगा.
    4. थोड़ा बड़ा छेद की ओर बुलंद पेट्री डिश के साथ, प्रवेशनी छेद सिर्फ कवर किया जाता है कि इस तरह के पकवान में पिघल डिब्बाबंदी मोम डालना. क्षेत्र प्रवेशनी मछली के मुंह में ~ 3 मिमी सम्मिलित करने के लिए अनुमति देता है, एक को रोकने के रूप में काम करेगा. इस सेट अप दृढ़ करने की अनुमति दी जानी चाहिए.
    5. एक लौ गर्म धातु धार का प्रयोग, चैनल प्रवेशनी की नोक से शुरू होती है और अंदर लगभग 1-2 फैली इतना है कि मछली पकड़ने के लिए एक चैनल बनाना
      1. सावधानी जल निकासी बंदरगाह के लिए प्रवेशनी क्षेत्र से एक निरंतर नीचे कोण बनाई है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए.065fig2.jpg "चौड़ाई =" 400px "/>
        चित्रा 2
  5. छिड़काव सेटअप
    1. शुरुआत से पहले, सभी हवाई बुलबुले को हटा रहे हैं, यह सुनिश्चित करने वास पानी के साथ छिड़काव सेट अप फ्लश.
    2. कपाल - उच्छेदन छिड़काव सेटअप करने के लिए ~ 30 मिलीलीटर 0.016 से% (630 माइक्रोन) tricaine समाधान जोड़ें और ~ 2 मिलीलीटर कि tricaine छिड़काव दीक्षा पर पशु के लिए दिया जाएगा सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबिंग के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति देते हैं. कमजोर पड़ने के लिए 2.2 कदम देखें.
    3. मुख्य छिड़काव सेटअप करने के लिए, पहले ट्यूब वास पानी की ~ में 50 मिलीलीटर जोड़ें. शेष ट्यूबों में से प्रत्येक को किसी भी वांछित प्रयोगात्मक यौगिकों जोड़ें.
    4. इंटुबैषेण बेस के छोटे से छेद में प्रवेशनी सेटअप रखें.
    5. एक तंग सर्पिल में 42 सेमी Kimwipe की चौड़ी पट्टी में एक 1 ट्विस्ट और Kimwipe दोनों सिरों पर फैली हुई है कि इस तरह की जल निकासी ट्यूब में डालें. इस ऊतक perfused तरल निकालने के लिए एक बाती के रूप में काम करेगा और टी के भीतर तरल buildup को रोकने के लिएवह electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो आधार इंटुबैषेण.
    6. कम अंत सब छिड़काव अपशिष्ट इकट्ठा करने के लिए काफी बड़ी है कि एक आभ्यांतरिक डिश में विस्तार करने के लिए अनुमति देता है, पेट्री डिश के बड़े छेद में टयूबिंग के एक छोर डालें. यह पकवान सेटअप के लिए बहिर्वाह जलाशय के रूप में काम करेगा. एक छोर पशु के पेट क्षेत्र के आसपास झूठ होगा कि इतना ऊतक स्थिति और कम विस्तार पकवान में ड्रिप कर सकते हैं.
    7. विदारक माइक्रोस्कोप के पास यह पूरा इंटुबैषेण आधार जगह. Tricaine छिड़काव ट्यूबिंग को प्रवेशनी की luer ताला कनेक्ट करें.
  6. केशिका सुई और इलेक्ट्रोड
    1. चांदी के तार और सेटअप भूमि पर एक ही तार से में 15 के ऊपर बनाया जाना चाहिए जो एक माध्यमिक इलेक्ट्रोड में 0.010 के में 2.5 से मिलकर प्राथमिक इलेक्ट्रोड प्राप्त करते हैं. माध्यमिक इलेक्ट्रोड के लिए, इसे फिट करने के लिए अनुमति देता है एक soldered टिप, साथ चांदी के तार में 0.010 की धारा में एक 15 का उपयोगएक सिर में मंच के पीछे.
      1. क्लोराइड आयनों के साथ दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक चांदी के तारों के सुझावों बिजली से.
      2. एक micropipette खींचने का उपयोग, <15 mΩ का एक प्रतिरोध के साथ एक पतली दीवारों, borosilicate केशिका सुई खींच.
        1. 2-3 2 एम पोटेशियम क्लोराइड के μl, या आंशिक रूप से चांदी के तार से क्लोराइड लेपित टिप को कवर करने के लिए पर्याप्त के साथ केशिका सुई भरें.
        2. केशिका सिर में प्राथमिक इलेक्ट्रोड डालने और इलेक्ट्रोड धारक में माउंट.
        3. एक micromanipulator में सिर चरण माउंट और फिर एक दूसरे micromanipulator में माध्यमिक इलेक्ट्रोड माउंट. प्रत्येक इलेक्ट्रोड सेटअप, पहले की स्थिति के साथ और फिर सिर में मंच के पीछे में माध्यमिक इलेक्ट्रोड के soldered टिप फिट.

2. समाधान की तैयारी, छिड़काव प्रणाली, और electrophysiological रिकॉर्डिंग उपकरण

  1. वास पानी का 1 एल प्राप्तमछली का एक्वेरियम से.
  2. 0.016% टी] tricaine methanesulfonate (tricaine) (630 माइक्रोन के 50 एमएल) 24.
    1. 0.4% Tris बफर tricaine, 7.2 पीएच के एक विभाज्य पिघलना.
    2. वास पानी की 47.9 मिलीलीटर के लिए 0.4% Tris बफर tricaine की 2.1 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण.
  3. वांछित पानी में घुलनशील प्रायोगिक यौगिक (जैसे 300 मिमी pentylenetetrazol, एक आम chemoconvulsant) के शेयर एकाग्रता पिघलना.
  4. घंटी समाधान में 1 ग्राम / μl pancuronium ब्रोमाइड के एक विभाज्य पिघलना.
  5. Anesthetizing और वास पानी के साथ प्रयोगात्मक इंटुबैषेण सिस्टम दोनों भरें और ट्यूब से सभी बुलबुले को दूर करने के लिए कम से कम पर्याप्त नाली. बुलबुले जानवर की asphyxiation करने के लिए अग्रणी, द्रव का प्रवाह में बाधा डालती है क्योंकि यह किया जाना चाहिए.
    1. पूरी तरह से जोड़ने ट्यूबिंग में हवा की अनुमति के बिना दवाओं का आयोजन करेगा कि छिड़काव ट्यूब नाली.
    2. 0.016% (630 माइक्रोन) tricaine समाधान के साथ anesthetizing ट्यूब भरें और किसी भी अनुभव जगहप्रयोगात्मक छिड़काव प्रणाली पर अतिरिक्त ट्यूब (ओं) में imental यौगिक (ओं).
      1. प्रयोगात्मक छिड़काव की पहली ट्यूब ही वास पानी को शामिल करना चाहिए.
  6. एक खाली 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में वास पानी और जगह के साथ छोटे छेद के स्पंज को गीला. संवेदनाहारी इंजेक्शन है, जबकि यह पकवान मछली पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

3. कपाल - उच्छेदन

  1. यह रास्ता के बारे में तीन - चौथाई को भरने के लिए एक 15 x 60 मिमी पेट्री डिश के लिए 630 माइक्रोन tricaine समाधान के लिए पर्याप्त जोड़ें. भरा पकवान वजन. आगे संज्ञाहरण intraperitoneally इंजेक्ट किया जा सकता है, ताकि इस जानवर को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. पकवान युक्त tricaine में पशु विसर्जित कर दिया और फिर से पकवान तौलना.
    1. मछली का वजन प्राप्त करने के लिए चरण 1 और 2 से वजन के बीच के अंतर को घटाना.
    2. पशु शांत और सबसे आंदोलन नहीं रह गया है जब तक tricaine समाधान में रहने की अनुमति.
  3. व्यापक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, premoistened स्पंज के लिए मछली हस्तांतरण और laterally यह स्थिति. पूंछ से मछली के हस्तांतरण इस प्रक्रिया के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
    1. विदारक खुर्दबीन के नीचे स्पंज और मछली रखें.
  4. एक 34 जी सुई युक्त Nanofil सिरिंज के साथ, मछली के वजन के 1 ग्राम / जी ऐसी है कि वहाँ पर्याप्त pancuronium ब्रोमाइड बाहर उपाय.
  5. Intraperitoneally Nanofil सिरिंज का उपयोग pancuronium ब्रोमाइड प्रशासन, स्थिर इसे पकड़ने के लिए मछली के पृष्ठीय पक्ष के साथ एक popsicle छड़ी का उपयोग करना.
  6. ठीक संदंश का प्रयोग, निचले जबड़े से मछली ले लो और जल्दी इंटुबैषेण आधार करने के लिए पशु हस्तांतरण.
  7. यह मोम फार्म और 1 मिमी प्रवेशनी मुंह में डाला जा सकता है कि इस तरह के पर पृष्ठीय हुआ है कि इतने जानवरों की स्थिति. मछली पैंतरेबाज़ी और प्रवेशनी चारों ओर मुंह खोलने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें. कारण इंटुबैषेण ट्रे के श्रृंगार के लिए, एक को रोकने की अनुमति, बेस में इंजीनियर थाप्रवेशनी मछली के मुंह में 3 मिमी डाला जाएगा.
    1. एक बार स्थिति में, tricaine युक्त गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव ट्यूब पर बारी.
  8. Kimqipe ऊतक का एक 3 सेमी 2 अनुभाग में कटौती और वास पानी से गीला.
    1. शुष्क्ीकरण को रोकने के लिए पशु से अधिक ऊतक रखें. Kimwipe खंड भी पशु पृष्ठीय को धारण करने में सहायता करने के लिए तैनात किया जा सकता है.
  9. विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, ऑप्टिक tectum कवर कपाल की ~ 2 मिमी 2 खंड को दूर करने के लिए Vanna वसंत कैंची का उपयोग करें. इस क्षेत्र आँख के पीछे बैठता है कि एक काले, बोनी थाली की तरह दिखता है.

    चित्रा 3
    चित्रा 3

    1. थाली के किनारे पर Vanna कैंची की एक ब्लेड डालें और penetra करने के लिए पर्याप्त बल के साथ धक्कामस्तिष्क भेदी के बिना, हड्डी ते. हड्डी कटाव को कैंची बंद करें.
    2. हड्डी का टुकड़ा निकालें.
    3. किसी भी रक्त मौजूद है, तो एक Kimwipe के किनारे का उपयोग कर हटा दें. आम तौर पर खून बह रहा है शीघ्र ही कपाल - उच्छेदन से बाहर ले जाने के बाद बंद हो जाता है.

4. विद्युतशरक्रिया विज्ञान

  1. इंटुबैषेण बंद मुर्गा बंद करो और जल्दी से tricaine ड्रिप को इंटुबैषेण आधार जोड़ने luer ताला काट.
    1. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माइक्रोस्कोप को बरकरार इंटुबैषेण सेटअप ले जाएँ और छिड़काव प्रणाली से कनेक्ट.
    2. वास पानी पर मुड़ें और tricaine बाहर धोने के क्रम में, ~ 1 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम / मिनट की दर से छिड़कना.
  2. इलेक्ट्रोड टिप जानवर नथुने में या ऊपरी जबड़े के पीछे डुबकी में डाला जा सकता है, ताकि दृश्य नियंत्रण के तहत एक micromanipulator का प्रयोग, माध्यमिक इलेक्ट्रोड स्थिति.
  3. कपाल - उच्छेदन खोलने में प्राथमिक इलेक्ट्रोड सुई डालें. डालेंटिप ऑप्टिक tectum भीतर काफी सतही तैनात है, ऐसी है कि ऊतक में सुई.
    1. इलेक्ट्रोड भी गहरी है, तो बिजली के संकेत छोटा हो सकता है.
  4. लीजिए और प्राथमिक और माध्यमिक संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच दर्ज की गई बिजली के अंतर का विश्लेषण. इस प्रक्रिया से प्राप्त किया जा करने के लिए बाह्य रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देगा.
    1. 0.1 kHz के एक कम पास फिल्टर और 1 हर्ट्ज की एक उच्च मार्ग फिल्टर के साथ, एक 5 kHz नमूना दर पर गैप मुक्त मोड में डेटा ले लीजिए.
    2. वास पानी 45 मिनट की एक न्यूनतम के लिए perfused है जब तक electrophysiological गतिविधि की रिकॉर्डिंग शुरू न करें.
    3. पूर्व प्रयोगात्मक दवाओं के अलावा करने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए देशी गतिविधि का एक आधारभूत रिकार्ड. समय के वांछित राशि के लिए विकल्प और रिकॉर्ड की प्रयोगात्मक दवाओं के साथ छिड़काव शुरू करो. स्वस्थ तैयारी में, यह 2-3 घंटे के लिए मस्तिष्क संबंधी गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए संभव है.

5. क्लीन अप

  • प्रयोग के अंत में, कपाल और नथुने से इलेक्ट्रोड हटाने और इंटुबैषेण सेटअप हटा दें.
    1. पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन (AVMA) पशु की इच्छामृत्यु (2013) के लिए दिशानिर्देश द्वारा उल्लिखित के रूप में स्वीकार किए जाते हैं प्रथाओं के अनुसार tricaine का उपयोग दवा ज्यादा से पशु euthanize.
    2. Euthanized किया जाना है Zebrafish 200-500 मिलीग्राम / एल पर एक tricaine समाधान में रखा जाना चाहिए मछली वे मौत सुनिश्चित करने के लिए इच्छामृत्यु (ग्रीवा transection) के एक भौतिक साधन के अधीन हैं जिसके बाद लयबद्ध opercular गतिविधि की समाप्ति के बाद 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए समाधान में नहीं छोड़ा जा सकता है.
  • छिड़काव सेटअप करने के लिए इंटुबैषेण आधार जोड़ने luer ताला डिस्कनेक्ट. उचित निपटान के लिए छिड़काव प्रणाली में किसी भी शेष तरल लीजिए.
    1. सभी ट्यूबों के माध्यम से डि पानी चलाने के लिए और खतरनाक है, तो उचित निपटान के लिए इकट्ठा.
  • छिड़काव प्रणाली को स्वच्छ बनाना, आरसंयुक्त राष्ट्र के 70% इथेनॉल के सभी ट्यूबों के माध्यम से और उचित निपटान के लिए इकट्ठा.
    1. हवा सुखाने की सुविधा के लिए खुले स्थान में प्रत्येक ट्यूब के लिए stopcocks छोड़ दें.
    2. 70% इथेनॉल में इलेक्ट्रोड भिगोएँ और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं.
  • एक sharps कंटेनर में प्राथमिक इलेक्ट्रोड के लिए इस्तेमाल किया केशिका सुई के निपटान के.
  • इंटुबैषेण सेटअप को नष्ट और पानी के साथ सभी टुकड़े कुल्ला.
    1. 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक टुकड़ा साफ और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं.

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    Representative Results

    इस प्रोटोकॉल विवो में वयस्क zebrafish के तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये electrophysiological रिकॉर्डिंग लगातार और reproducibly प्राप्त कर रहे हैं. Pentylenetetrazol (PTZ), एक आम chemoconvulsant 6,7,25,26, इंटुबैषेण में पेश किया है जब 5 चित्रा एक वयस्क zebrafish के तंत्रिका गतिविधि के मूल निवासी और प्रेरित परिवर्तन का एक प्रतिनिधि उदाहरण से पता चलता है सेटअप.

    वयस्क zebrafish के मूल निवासी मस्तिष्क संबंधी गतिविधि प्रत्येक प्रयोग (चित्रा 5A) के लिए नजर रखी थी. यह लगातार इस गतिविधि रिकॉर्डिंग की अवधि के दौरान आयाम में सहज और छोटा है कि मनाया गया. व्यवस्था करने के लिए 15 मिमी PTZ की शुरूआत के बाद, सहज epileptiform तरह निर्वहन के बारे में 5 मिनट का विकास शुरू किया. शुरूआत के बाद. इस गतिविधि शुरू में संक्षिप्त, छोटे आयाम था और लार्वा Z भीतर मनाया गया के समान, बार हुआebrafish 6,7. PTZ, गतिविधि के छोटे, अधिक अक्सर फटने और बाद में एक शांत अवधि (चित्रा 5 ब) द्वारा पीछा किया गया था कि विकसित बड़े आयाम निर्वहन का एक सुसंगत पैटर्न को निरंतर संपर्क में हैं.

    इस तकनीक इंटुबैषेण प्रणाली के माध्यम से अन्य chemoconvulsants पेश करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. इन यौगिकों के साथ, देशी मस्तिष्क संबंधी गतिविधि में परिवर्तन भी प्रभावी ढंग से पैदा किया गया. Pentylenetetrazol मजबूती के साथ एक टकसाली ढंग से zebrafish के मूल निवासी तंत्रिका गतिविधि में परिवर्तन करने के लिए एक उदाहरण की वजह से यह क्षमता के रूप में यहां इस्तेमाल किया गया था.

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    Discussion

    इस प्रोटोकॉल विवो में वयस्क zebrafish के तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. दर्ज की गई गतिविधि की विशेषताओं (आयाम और घटनाओं की आकृति) व्यक्तिगत मछली के बीच भिन्न हो सकते हैं, हालांकि अभ्यास के साथ, तंत्रिका गतिविधि, लगातार मनाया जा सकता है. कोशिकी रिकॉर्डिंग तकनीक के उपयोग के इस अवलोकन की व्याख्या कर सकते हैं. विधि एक क्षेत्र 1 के भीतर कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का एक साथ निगरानी प्रदान करता है, ताकि प्राथमिक इलेक्ट्रोड की स्थिति में बदलाव मनाया गतिविधि में एक भूमिका निभा सकते हैं. प्राथमिक इलेक्ट्रोड की गहराई भी मापा जा रहा है क्षेत्र बदलता है. इलेक्ट्रोड की नोक एक क्षेत्र के भीतर भी गहरी तैनात है, तो मनाया संकेत की उम्मीद है और गतिविधि में परिवर्तन का पालन करने के लिए कठिन हो जाएगा की तुलना में छोटा होगा, यदि ऐसा होता है टिप अधिक अल्पज्ञता बैठा है, इसलिए है कि बस प्राथमिक इलेक्ट्रोड वापस खींच . इस ऑप्टिक tectum की विशेषता है और नहीं हो गया है कि ध्यान रखनाएन मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों में गहराई में देखा. हालांकि, इस प्रक्रिया मस्तिष्क के एक अलग क्षेत्र के भीतर बाहर किया जा सकता है. मनाया तंत्रिका गतिविधि प्रयोग के दौरान आधारभूत स्तर पर कम हो जाती है और मछली अभी भी जिंदा है अगर यह अनिश्चित है, तो कपाल से इलेक्ट्रोड हटाने और रक्त प्रवाह जानवर भर में अभी भी वहाँ है देखने के लिए जाँच. इस होंठ या मछली की नाक क्षेत्र में बड़े जहाजों देख द्वारा जाँच की जा सकती. रक्त प्रवाह आसानी से इन क्षेत्रों में देखा जा सकता है. इलेक्ट्रोड एक रिकॉर्डिंग के बीच में रक्त के प्रवाह के लिए जाँच करने के लिए निकाल रहे हैं तो इलेक्ट्रोड repositioning, जब वे सीधे मूल आधारभूत की रिकॉर्डिंग के इस भाग की तुलना करने की क्षमता नकार, वे शुरू में थे की तुलना में थोड़ा अलग स्थान में हो जाएगा .

    इस प्रक्रिया के शुरू करने से पहले, यह इंटुबैषेण ट्यूबों के साथ ही कपाल - उच्छेदन और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी setups दोनों के लिए छिड़काव ट्यूब हैं कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिएकिसी भी बुलबुले से मुक्त. बुलबुले एकत्रित करते हैं, तो वे पानी निकलने की टोंटी खोलने और वास पानी की कुछ के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति देकर सिस्टम से बाहर चला जा सकता है. इस समस्या को खत्म नहीं करता है, तो एक छोटा सा सिरिंज प्रवेशनी रखा जाएगा जहां ट्यूब, के अंत में संलग्न किया जा सकता है, और प्रकाश सक्शन प्रणाली के भीतर किसी भी शेष हवा निकालने के लिए आवेदन किया. जिद्दी बुलबुले के लिए, वास पानी ट्यूबिंग के माध्यम से मजबूर किया जा सकता है. इसके अलावा, छिड़काव ट्यूब primed और मछली intubating पहले टपकता रहे हैं सुनिश्चित करें. ~ 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर / मिनट प्राप्त नहीं है, तो दबाव सिर की ऊंचाई इस लक्ष्य को हासिल करने के क्रम में बदला जा सकता है. इस मछली पर्याप्त जल प्रवाह करने के लिए उपयोग किया है कि यह सुनिश्चित करेंगे. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी छिड़काव सेटअप श्रृंखला में कई ट्यूबों के साथ सेटअप है, यह दर्ज स्नायविक गतिविधि में परिणामी परिवर्तन परिसर बेन पर निर्भर थे, हालांकि यह जानवर को पेश करने के लिए नए समाधान के बारे में ~ 1 मिनट लिया कि निर्धारित किया गया थाजी शुरुआत की. यह इस प्रवाह की दर पहले किसी भी प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए मापा जा सलाह दी है. पिछला काम tricaine सटीक रिकॉर्डिंग 27,28 प्राप्त करने के लिए सिस्टम से हटा दिया जाना यह आवश्यकता होती है, तंत्रिका गतिविधि attenuate कर सकते हैं दिखाया गया है. पिछले काम के माध्यम से, यह वास पानी के साथ इंटुबैषेण के 45-60 मिनट की अवधि tricaine बाहर धोने के लिए और तंत्रिका गतिविधि के लिए देशी स्तर तक पहुँचने के लिए आवश्यक है कि निर्धारित किया गया था. इसी तरह, pentylenetetrazole की वार्शआउट भी बाहर किया गया था, और यह 20 मिनट की अवधि के आधारभूत स्तर पर तंत्रिका गतिविधि लौटने के लिए आवश्यक था कि निर्धारित किया गया था. इसलिए, प्रयोगकर्ताओं प्रणाली में शुरू की जा रही ब्याज की प्रत्येक परिसर के लिए वार्शआउट बार निर्धारित करने के लिए परीक्षण पूरा करना चाहिए.

    इस तकनीक को कुछ अभ्यास की आवश्यकता है. कपाल - उच्छेदन बाहर ले जाने, अतिरिक्त देखभाल सिर को शामिल किया गया है कि बोनी थाली के एक छोटे से क्षेत्र को नुकसान पहुँचाए बिना हवा निकाल दी और हटाया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिएमस्तिष्क. यह सिर के लिए सम्मान के साथ एक तीव्र कोण पर Vanna कैंची शुरू करने से किया जा सकता है. ऑप्टिक tectum कवर बोनी क्षेत्र कमजोर हैं और कैंची के लिए अच्छा के रूप में प्रवेश बिंदुओं की सेवा है कि केंद्र के पास fusions है. एक छोटा सा ब्रेक प्लेट के भीतर कर दिया गया है, हड्डी के एक छोटे से क्षेत्र ट्रिम करने के लिए कैंची का उपयोग, और ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर हटा दें. छोटी मछली अक्सर नरम, अधिक लचीला craniums है, तो इस तकनीक सीखने जबकि उम्र या उससे कम 1 साल हैं कि मछली के उपयोग के लिए सुझाव दिया है. कभी कभी, रक्त कपाल - उच्छेदन के क्षेत्र के आसपास एकत्र करने के लिए शुरू हो जाएगा, लेकिन यह धीरे आसपास के क्षेत्र एक Kimwipe dabbing द्वारा हटाया जा सकता है. इस प्रक्रिया के साथ, कपाल - उच्छेदन क्षेत्र में लगभग 2 मिमी 2 जा रहा है, बहुत छोटा है. इस वजह से यह छोटे आकार के, कपाल क्षेत्र की सुखाना नहीं हुई है. कपाल - उच्छेदन आकार में बड़ा है, तो हालांकि, यह इस एक समर्थक बन जाता है, तो मस्तिष्क से नमी नुकसान को रोकने के लिए अगर या कुछ अन्य सामग्री को लागू करने के लिए संभव हैblem.

    ब्याज की एक बिंदु pancuronium ब्रोमाइड का इस्तेमाल होता है. इस रसायन दोहराए ठंड और विगलन को रोकने के क्रम में 10 μl की aliquots में संग्रहित है. वजन के प्रति ग्राम 1 μl जा रहा है, एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा करने के लिए सुझाव दिया मात्रा एक वयस्क मछली स्थिर आमतौर पर पर्याप्त है. इस अवसर पर, हालांकि, यह मात्रा पर्याप्त नहीं है. यह तब होता है और पक्षाघात प्राप्त नहीं होता है, तो अधिक pancuronium ब्रोमाइड के रूप में लंबे समय रिकॉर्डिंग शुरू नहीं हुई है, के रूप में मछली के लिए intraperitoneally प्रशासित किया जा सकता है. इंजेक्शन बाहर ले जाने, कठिन पक्ष तराजू के माध्यम से इंजेक्षन करने की कोशिश नहीं करते, वेंट के पास, नरम पेट क्षेत्र में मछली इंजेक्षन. मछली प्राथमिक इलेक्ट्रोड तैनात किया गया है एक बार स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है, सुई कपाल - उच्छेदन के भीतर बंद टूट गया है, और प्रक्रिया एक नए जानवर का उपयोग दोहराया जाना चाहिए कि वहाँ एक अच्छा मौका है. इस काम के माध्यम से, यह pancuronium ब्रोमाइड दर्ज तंत्रिका को कम कर सकते हैं कि निर्धारित किया गया हैलार्वा zebrafish (≤ आधारभूत आयाम का 50%) में गतिविधि और यह एक ही वयस्कों के लिए सच है कि माना जाता है. हालांकि, हाल के अनुभव में, एक वयस्क में तंत्रिका गतिविधि pancuronium ब्रोमाइड के लिए जिम्मेदार ठहराया किसी भी dampening प्रभाव प्रतिकूल डेटा इकट्ठा करने और विश्लेषण करने की क्षमता को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं है कि काफी मजबूत है. इसके विपरीत, गति के साथ जुड़े घालमेल महत्वपूर्ण हो सकता है. इस प्रक्रिया के लिए, पशु की पूरी गतिहीनता का लाभ इस सीमा से परे मूल्य का है और पेश कर रहे हैं कि तंत्रिका परिवर्तन किसी भी dampening प्रभाव से परे जारी रहती है काफी मजबूत कर रहे हैं. इसके अलावा, पशु से किसी भी प्रस्ताव, इलेक्ट्रोड विस्थापित कर सकते हैं इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग उपकरण द्वारा पंजीकृत किया और संभवतः पशु जोखिम में डालना.

    इस तकनीक की सीमाओं को मुख्य रूप से कोशिकी रिकॉर्डिंग बरकरार वयस्क zebrafish भीतर मस्तिष्क संबंधी गतिविधि की रिकॉर्डिंग के ही संभव तरीका है कि वास्तव में झूठ बोलते हैं. प्राइमा जब स्थिति RY इलेक्ट्रोड, सुई इलेक्ट्रोड रखा जा रहा है वास्तव में, जहां देखने से एक को रोकने, कपाल - उच्छेदन में डाला जाना चाहिए. हालांकि, अभ्यास के साथ, यह एक ही क्षेत्र के भीतर और लगातार एक ही गहराई में इलेक्ट्रोड की स्थिति के लिए संभव है.

    विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में काफी हद तक zebrafish लार्वा को सीमित किया गया है. यह आसानी से छोटी मछली और वे इंटुबैषेण की आवश्यकता नहीं है कि इस तथ्य को स्थिर करने की क्षमता की वजह से है. इसलिए, electrophysiological पढ़ाई लार्वा चरणों पर ध्यान केंद्रित किया है और थोड़ा वयस्क मस्तिष्क के भीतर electrophysiological गतिविधि के संबंध में किया गया है. यह किए जाने के लिए किशोर और वयस्क मस्तिष्क संबंधी गतिविधि के बीच कोई तुलना नहीं रोका गया है. multitube इंटुबैषेण प्रणाली का उपयोग करने के लिए मछली यौगिकों की एक किस्म के लिए आसान परिचय के लिए अनुमति देता है. यह भी विभिन्न रसायनों या दोनों लार्वा और वयस्क प्रणालियों के भीतर अध्ययन किया जाना दवाओं के प्रभाव के लिए अनुमति देता है.

    NT "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 1
    चित्रा 1. इंटुबैषेण प्रवेशनी. एक पीले पी -200 pipetteman टिप (ए) के व्यापक अंत से 1.5 सेमी अनुभाग निकालें. कनेक्टर (बी) को कम करने के लिए एक luer ताला में टयूबिंग की एक 6 सेमी x 1 मिमी टुकड़ा (तीर) डालें और संशोधित पिपेट टिप में इस प्रवेशनी डालें. ट्यूबिंग (सी) में ⅛ की एक छोटी हिस्से के प्रयोग luer ताला के साथ स्थिति में पिपेट टिप पकड़ो.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. इंटुबैषेण आधार स्थापना रु. खाड़ी वैक्स ठंडा है, int के छोटे से छेद में प्रवेशनी सेटअप जगहubation आधार (ए). एक तंग सर्पिल में 42 सेमी Kimwipe की चौड़ी पट्टी में एक 1 ट्विस्ट और Kimwipe दोनों सिरों पर फैली हुई है कि इस तरह की जल निकासी ट्यूब में डालें. कम अंत पकवान (नहीं देखने में) crystallizing एक 30 मिमी x 100 मिमी में विस्तार करने की इजाजत दी, पेट्री डिश (बी) के बड़े छेद में जल निकासी ट्यूबिंग के एक छोर डालें. एक छोर (काले धराशायी लाइन के साथ रेखांकित) जानवर के पेट क्षेत्र के आसपास झूठ होगा कि इतना ऊतक स्थिति और कम विस्तार पकवान में ड्रिप कर सकते हैं.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. कपाल - उच्छेदन. विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, ऑप्टिक tectum कवर कपाल की ~ 2 मिमी 2 खंड को दूर करने के लिए Vanna वसंत कैंची का उपयोग करें. इस क्षेत्र कि यह एक अंधेरे, समलम्बाकार बोनी थाली की तरह दिखता हैअपनी आंख के पीछे. कपाल - उच्छेदन तैनात है जहां डॉटेड सर्कल सीमांकित करता है. Arrowhead प्राथमिक इलेक्ट्रोड की सुई कपाल - उच्छेदन के छेद के भीतर तैनात है वहाँ से पता चलता है. प्राथमिक इलेक्ट्रोड क्लोराइड आयनों के साथ electroplated और एक borosilicate केशिका सुई में डाला गया है कि चांदी के तार में 0.010 की धारा में एक 2.5 के होते हैं. केशिका सुई 2-3 2 एम पोटेशियम क्लोराइड के μl, या आंशिक रूप से चांदी के तार से क्लोराइड लेपित टिप को कवर करने के लिए पर्याप्त से भर जाता है. माध्यमिक इलेक्ट्रोड एक टिप यह सिर में मंच के पीछे में सम्मिलित करने के लिए अनुमति देता है, एक छोर पर soldered है, सिवाय इसके कि प्राथमिक इलेक्ट्रोड के लिए इस्तेमाल एक ही तार की धारा में एक 15 के होते हैं. मछली को छू तैनात किया जा रहा है कि माध्यमिक तार के अंत में भी क्लोराइड आयनों के साथ electroplated किया जाना चाहिए. माध्यमिक इलेक्ट्रोड वयस्क मछली की सही नथना के भीतर तैनात किया गया है जहां तीर से पता चलता है.


    चित्रा 4. Electrophysiological गतिविधि के संग्रह के लिए सेटअप. बरकरार इंटुबैषेण सेटअप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माइक्रोस्कोप के लिए ले जाया जाता है और प्रवेशनी छिड़काव प्रणाली (ए) से जुड़ा है. प्रणाली पानी छिड़काव तुरंत शुरू करने के लिए अनुमति देता है, पर कर दिया जाना चाहिए. इलेक्ट्रोड टिप जानवर नथुने में या ऊपरी जबड़े (तीर) के पीछे डुबकी में डाला जाता है ताकि micromanipulator का उपयोग, माध्यमिक इलेक्ट्रोड (बी) की स्थिति. कपाल - उच्छेदन खोलने में प्राथमिक इलेक्ट्रोड सुई (सी) डालें. यह ऑप्टिक tectum भीतर काफी सतही तैनात है कि इस तरह की सुई डालें. बड़ी जल निकासी ट्यूब (डी) देखने के क्षेत्र के बाहर, इंटुबैषेण पकवान से फैली, और दूसरे छोर टी में खालीवह संग्रह पकवान.

    चित्रा 5
    चित्रा 5. ऑप्टिक tectum भीतर electrophysiological रिकॉर्डिंग. (क) क्या यह लगातार वयस्क zebrafish का ऑप्टिक tectum भीतर देशी गतिविधि रिकॉर्डिंग की अवधि के दौरान छोटे आयाम (2-10 एम वी) गतिविधि दिखा, stereotypically सहज है कि मनाया गया. (बी) प्रणाली के लिए 15 मिमी PTZ की शुरूआत के बाद, सहज epileptiform तरह निर्वहन शुरूआत के बाद लगभग 5 मिनट का विकास शुरू किया. इस गतिविधि शुरू में संक्षिप्त, छोटे आयाम था. PTZ, बड़े आयाम की एक सुसंगत पैटर्न को निरंतर संपर्क के साथ (15 एम वी) गतिविधि के छोटे, अधिक अक्सर फटने से पीछा किया गया था कि विकसित निर्वहन.

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    Disclosures

    लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

    Acknowledgments

    यह काम (TMD, JDL और एटीएस को) एनआईएच / NINDS अनुदान R01NS070159 द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    70% Ethanol Decon Laboratories 2750HC Dilute 100% to 70% with DI water
    2 M Potassium Chloride J.T. Baker
    2 M Sodium Chloride J.T. Baker 3624-05
    0.4% Tris-Buffered Tricaine Sigma-Aldrich E10521 pH 7.2-7.4; stored at -20 oC
    Pancuronium Bromide Sigma-Aldrich P1918 Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline
    Habitat water pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate
    Pentylenetetrazol Sigma-Aldrich P6500 Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline
    Nanofil syringe World Precision Instruments, Inc. 06A
    34 G Beveled needle World Precision Instruments, Inc. NF34BV
    Sponge Small pore and chemical-free
    Foam-backed fine sand paper 5 x 5 cm2 is large enough
    9 V Battery
    Wires with alligator clips Need 2
    37 cm x 42 cm Kimwipe Kimberly-Clark Professional TW31KEM
    11 cm x 21 cm Kimwipe Kimberly-Clark Professional TW31KWP
    1/8 in diameter tube
    1 cm diameter tube
    1 mm diameter tube
    Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule Qosina 51505
    Microscope (Leica MZ APO) Another microscope can be used
    Vanna scissors Roboz Surgical Instruments Co., Inc. 15018-10
    60 ml Luer lock syringe tubes Becton, Dickinson and Company 309653
    3-way Stopcocks with Luer connections
    1-way Stopcock with Luer connection
    Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish Fisher Scientific NC9299146
    Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish Fisher Scientific S67961
    4 in Borosilicate capillary tube World Precision Instruments TW100F-4 Can contain a filament to aid in filling with solution
    P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co.
    Digidata 1440 Molecular Devices
    Axon Aloclamp 900A Molecular Devices
    Axoclamp software Molecular Devices
    HS-9Ax 1U headstage Molecular Devices
    0.010 in Silver wire A-M Systems, Inc.
    Q-series electrode holder Warner Instruments QSW-A10P
    10 ml Luer lock syringe
    1 mm x 15 in Tubing Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder
    Micromanipulator Warner Instruments Need 2
    Microsoft-based PC Dell
    Faraday Cage
    Air Table
    Dissecting Microscope

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    तंत्रिका विज्ञान अंक 81 zebrafish वयस्क इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कपाल - उच्छेदन छिड़काव तंत्रिका गतिविधि
    बरकरार वयस्क zebrafish के मस्तिष्क में electrophysiological रिकॉर्डिंग
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    Johnston, L., Ball, R. E., Acuff,… More

    Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065, doi:10.3791/51065 (2013).

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