Summary
Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo per permettere registrazioni e manipolazione di attività neurale in un animale intatto.
Abstract
In precedenza, studi elettrofisiologici in zebrafish adulto si sono limitati a tagliare i preparativi o alle preparazioni oculare e registrazioni electrorentinogram. Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo, che permette la registrazione di attività neurale. Immobilizzazione dell'adulto richiede un meccanismo per fornire ossigeno disciolto alle branchie al posto di movimento buccale e opercolare. Con la nostra tecnica, gli animali vengono immobilizzati e perfusi con acqua habitat per soddisfare questo requisito. Una craniotomia viene eseguita sotto tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anestesia per fornire l'accesso al cervello. L'elettrodo primario viene quindi posizionato all'interno della finestra craniotomia per registrare l'attività cerebrale extracellulare. Attraverso l'uso di un sistema di perfusione multitube, una varietà di composti farmacologici può essere somministrato ai pesci adulti e eventuali alterazioni nell'attività neuralepuò essere osservato. La metodologia permette non solo per le osservazioni devono essere fatte per quanto riguarda i cambiamenti di attività neurologica, ma permette anche di effettuare confronti tra larvale e zebrafish adulto. Questo dà ricercatori la capacità di identificare le alterazioni dell'attività neurologica dovuta all'introduzione di vari composti a differenti stadi di vita.
Introduction
In questo articolo, un protocollo è descritto per ottenere le registrazioni in vivo di attività neurale in zebrafish adulto. Metodi di registrazione extracellulari sono utilizzati, fornendo misure di tensione di attività elettrica all'interno di una piccola regione del tessuto neurale. Questo metodo di indagine comporta monitorare un gran numero di cellule in un animale comportarsi 1. In precedenza, le registrazioni fetta sono stati effettuati sia negli adulti e larve, come hanno fatto i preparativi oculare e registrazioni elettroretinogramma. Questi esperimenti sono stati eseguiti in gran parte al dettaglio risposte fisiologiche dei vari sistemi sensoriali 2-5. Fino a poco tempo, preparazioni cerebrali intatti sono stati disponibili per eseguire elettrofisiologia con zebrafish 3,6,7 larva, dove la respirazione e ossigeno diffusione può avvenire attraverso la pelle solo. La nostra preparazione consente l'attività neurologica nativo di zebrafish adulto da misurare, mentre l'animale rimane pienamente cosciente e consapevole of dintorni.
Zebrafish (Danio rerio) attualmente gioca un ruolo fondamentale come modello per studi genetici, tossicologici, farmacologici e fisiopatologici 3. Zebrafish hanno guadagnato visibilità all'interno del campo delle neuroscienze perché condividono ampia omologia con i mammiferi a livello genetico, nervosi ed endocrini livelli 8. Negli ultimi dieci anni, sono state utilizzate tecniche di neuroanatomici e immunoistochimica standard per determinare l'organizzazione caratteristici dettagliata del sistema nervoso zebrafish 9-12 e della distribuzione di diversi neurotrasmettitori 3,8,13. Più di recente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per studi funzionali 14,15, molti dei quali si incentrano sui processi comportamentali 16-19 e le caratteristiche elettrofisiologiche dei sistemi sensoriali 2,13,20. Un piccolo numero di questi studi si sono concentrati sull'attività elettrica di specifiche aree del adult cervello zebrafish 21-23, ma non sono stati eseguiti utilizzando un approccio in vivo.
Questo protocollo può essere adattato per studi elettrofisiologici sia attività spontanea ed evocata all'interno del sistema nervoso zebrafish per descrivere i modelli di attività in specifiche regioni cerebrali. L'uso di questa tecnica permette di effettuare confronti tra l'attività neurologica dei giovani stadi larvali e adulti. Inoltre, il nostro protocollo consente confronti tra alterazioni genetiche o farmacologici. Insieme ad altri approcci, come l'ingegneria genetica o prove farmacologiche, questo metodo offre una nuova possibilità per l'analisi funzionale di comunicazione neuronale e la plasticità nel intatta animali adulti, nonché per potenziali applicazioni, come studiare epilessia insorgenza tardiva o processi neurodegenerativi.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e seguiti protocollo # A2011 09-003, che è stato esaminato, approvato e supervisionato dalla University of Georgia Institutional Animal Care ed uso Comitato.
1. Setup Equipaggiamento
- Sistema di perfusione per la craniotomia
Immobilizzazione dell'adulto richiede un sistema intubazione per fornire ossigeno disciolto ai pesci. Una varietà di sistemi può essere utilizzato, ma viene utilizzato un sistema a gravità semplice costituito da una siringa da 60 ml. Elevare la testa pressione ad un'altezza che produce costantemente una portata di ~ 1 ml / min. Questa siringa può essere posto in serie con le siringhe che vengono poi utilizzati per il sistema di perfusione elettrofisiologico.- Ottenere una singola 60 ml Luer Lock tubo siringa e rimuovere il pistone.
- Sospendere la siringa circa 8 in &# 160; sopra la base di un anello-supporto usando un morsetto.
- Collegare un senso unico rubinetto alla fine della siringa. All'estremità opposta del rubinetto, collegare un pezzo di tubo, 2 mm di diametro, che è abbastanza lungo per estendere alla base intubazione.
- Sistema di perfusione per elettrofisiologia
Per gli esperimenti elettrofisiologici, è spesso necessario introdurre una varietà di composti nel corso di un esperimento. Una varietà di sistemi sono disponibili, ma un sistema di gravità composta di 60 ml siringhe in serie può essere utilizzata. Questa configurazione consente di semplice, l'introduzione di serie di soluzioni che devono essere effettuati aprendo il rubinetto corrispondente.- Ottenere due o più di 60 ml siringhe Luer lock e rimuovere gli stantuffi da ciascuno. Una siringa deve somministrare acqua habitat per i pesci mentre ciascuna provetta successiva può essere utilizzato per somministrare una varietà di composti farmacologici per il pesce.
- Collegare ogni siringa per un 3 -modo rubinetto con una connessione Luer.
- Utilizzare ⅛ di diametro esterno (OD) tubo per collegare le siringhe in serie con un blocco Luer maschio da un lato.
- Fissare il dispositivo in modo tale che la testa di pressione è elevata ad una altezza di 27 sopra la base, o un'altezza che produce costantemente una portata di ~ 1 ml / min.
- Cannula per intubazione
La cannula facilita l'introduzione del fluido ai pesci. Questa configurazione offre flessibilità e fermezza al meglio la posizione della cannula all'interno della bocca dell'animale.- L'utilizzo di qualsiasi paio di forbici generale (ad es. Fiskars) o una lama di rasoio, rimuovere una sezione di 1,5 centimetri dalla vasta fine di un puntale P-200.
- Inserire un pezzo di tubo mm 6 cm x 1 in una valvola di riduzione con un cappuccio femmina Luer Lock e puntale silicone, cioè un adattatore Tuohy Borst, e inserire questo cannula nella punta della pipetta modificato. Tenere la punta della pipetta in posizione con il Luer lOCK con una breve porzione di ⅛ in tubo di diametro.
Figura 1
- Base di intubazione
Questo piatto è utilizzato per contenere l'animale immobilizzato in una posizione eretta stabile e per facilitare la rimozione del fluido che entra attraverso l'animale intubazione. Se questo non viene stabilita correttamente, il pool può verificarsi, portando a segnali vibrazionali intrusive nella registrazione elettrofisiologica.- Avere il piatto base di una piastra di Petri di 100 mm x 15 millimetri plastica.
- Utilizzando un saldatore, fondere un foro, 6 mm di diametro e 7,5 mm sotto il bordo del cerchione, nel lato del piatto. Utilizzando lo stesso strumento, fondere un foro, 10 mm di diametro e 11 mm sotto il labbro del piatto ~ 74 ° in senso antiorario dalla piccolo foro. Questo foro servirà come il foro di scarico.
- Inserire un tubo, 1 cm di diametro, nel foro con la fine alzato in modo tale che alla fine non può essere bloccato. Quindi inserire una punta P-200 pipetteman nel piccolo foro, questo servirà come una cannula fittizio.
- Con la piastra di Petri leggermente elevata sul lato del foro più grande, versare cera conserviera fusa nello stampo in modo che il foro cannula sia appena coperto. La regione fungerà da arresto, consentendo la cannula da inserire ~ 3 mm nella bocca del pesce. Questo set up dovrebbe essere permesso di solidificare.
- Utilizzando un bordo metallico riscaldato fiamma, intagliare un canale per tenere il pesce in modo che il canale inizia dalla punta della cannula e si estende approssimativamente 1-2 trovi
- Occorre fare attenzione a garantire che un angolo verso il basso continua dalla zona cannula alla porta di scarico è formato.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Figura 2
- Occorre fare attenzione a garantire che un angolo verso il basso continua dalla zona cannula alla porta di scarico è formato.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Installazione di perfusione
- Prima di iniziare, lavare la perfusione set-up con acqua habitat, garantendo che tutte le bolle d'aria vengono rimossi.
- Aggiungere ~ 30 ml di 0,016% (630 mM) soluzione tricaine alla configurazione craniotomia perfusione e consentono ~ 2 ml di scorrere attraverso tubi per garantire che tricaine sarà trasportato all'animale upon perfusione iniziazione. Vedere il punto 2.2 per la diluizione.
- Per il setup perfusione principale, aggiungere ~ 50 ml di acqua habitat al primo tubo. Aggiungere eventuali composti sperimentali desiderati per ciascuno dei rimanenti tubi.
- Posizionare il setup cannula nel piccolo foro della base intubazione.
- Torcere un 1 nella striscia larga 42 cm Kimwipe in una spirale stretto e inserirlo nel tubo di scarico in modo che il Kimwipe estende su entrambe le estremità. Questo tessuto servirà come stoppino per rimuovere il liquido perfuso e per prevenire l'accumulo di liquido all'interno tegli intubazione base, che potrebbe interferire con la registrazione elettrofisiologica.
- Inserire un'estremità del tubo nel foro grande della scatola di Petri, consentendo l'estremità inferiore di estendere in un piatto inerte che è abbastanza grande per raccogliere tutti i rifiuti perfusione. Questo piatto servirà come il serbatoio di deflusso per l'installazione. Posizionare il tessuto in modo che una estremità si trovano vicino ventrale dell'animale e l'estensione inferiore può gocciolare nel piatto.
- Collocare questa base intubazione completato nei pressi del microscopio da dissezione. Collegare il blocco Luer della cannula al tubo tricaine perfusione.
- Capillare aghi ed elettrodi
- Ottenere un elettrodo primario costituito da 2.5 in su 0.010 in filo d'argento e un elettrodo secondario che dovrebbe essere composto da 15 dello stesso filo a terra l'installazione. Per l'elettrodo secondario, utilizzare un 15 nella sezione di 0.010 in filo d'argento con una punta saldata, che gli consente di adattarsinel retro di una testa stadi.
- Placcano le punte di entrambi i fili d'argento primari e secondari con ioni cloruro.
- Utilizzando un estrattore micropipetta, tirare una, borosilicato capillare ago parete sottile con una resistenza di <15 mW.
- Riempire l'ago capillare con 2-3 ml di cloruro di 2 M di potassio, o abbastanza per coprire parzialmente la punta cloruro rivestita con del filo d'argento.
- Inserire l'elettrodo primario nella testa capillare e montarlo nel supporto dell'elettrodo.
- Montare la testa palco in un micromanipolatore e poi montare l'elettrodo secondario in un secondo micromanipolatore. Con la configurazione, prima posizione ogni elettrodo e quindi montare la punta saldato dell'elettrodo secondario nella parte posteriore della testa stadi.
- Ottenere un elettrodo primario costituito da 2.5 in su 0.010 in filo d'argento e un elettrodo secondario che dovrebbe essere composto da 15 dello stesso filo a terra l'installazione. Per l'elettrodo secondario, utilizzare un 15 nella sezione di 0.010 in filo d'argento con una punta saldata, che gli consente di adattarsinel retro di una testa stadi.
2. Preparazione di soluzioni, sistema di perfusione, e elettrofisiologico Registrazione
- Ottenere 1 L di acqua habitatda acquario di pesci.
- 0,016% T] tricaine methanesulfonate (tricaine) (50 ml di 630 mM) 24.
- Scongelare una aliquota dello 0,4% tricaine tamponata con Tris, pH 7,2.
- Aggiungere 2.1 ml di 0,4% tricaine tamponata con Tris di 47.9 ml di acqua habitat e mescolare.
- Scongelare concentrazione scorta di solubile in acqua desiderata composto sperimentale (ad esempio pentylenetetrazol 300 mm, un chemoconvulsant comune).
- Scongelare una aliquota di 1 mg / mL pancuronio bromuro in soluzione di Ringer.
- Riempire entrambi i sistemi di intubazione sperimentali con acqua e habitat anestetizzante e svuotare almeno abbastanza per rimuovere tutte le bolle dai tubi. Questo deve essere fatto perché bolle ostruiscono il flusso del fluido, con conseguente asfissia dell'animale.
- Completamente drenare i tubi di perfusione che conterrà i farmaci senza che l'aria nel tubo di collegamento.
- Riempire il tubo anestetizzante con il 0,016% (630 micron), soluzione tricaine e collocare compecomposto imental (s) in ulteriore tubo (s) sul sistema di perfusione sperimentale.
- Il primo tubo di perfusione sperimentale dovrebbe contenere solo acqua habitat.
- Inumidire la piccola spugna pori con acqua habitat e collocare in un 60 millimetri x 15 mm piastra di Petri vuota. Questo piatto verrà utilizzato per tenere il pesce mentre l'anestetico viene iniettato.
3. Craniotomy
- Aggiungere abbastanza della soluzione tricaine 630 micron per una capsula di Petri 15 x 60 mm per riempirlo circa tre quarti del percorso. Pesare il piatto pieno. Questo verrà utilizzato per immobilizzare l'animale in modo che ulteriori anestesia possono essere iniettate per via intraperitoneale.
- Immergere l'animale nel piatto contenente tricaine e pesare di nuovo il piatto.
- Sottrarre la differenza tra i pesi da passaggi 1 e 2 per ottenere il peso del pesce.
- Lasciare l'animale a rimanere nella soluzione tricaine fino calmo e più movimento è cessato.
- Utilizzando un paio di larghe pinze, trasferire il pesce alla spugna impregnate e posizionare lateralmente. Trasferire il pesce per la coda funziona bene per questo processo.
- Posizionare la spugna e il pesce sotto il microscopio da dissezione.
- Con una siringa Nanofil contenente un ago G 34, dosare abbastanza bromuro di pancuronio tale che vi è 1 ug / g di peso pesce.
- Usando un bastone ghiacciolo lungo il lato dorsale del pesce per tenerla ferma, amministrare il bromuro di pancuronio per via intraperitoneale con la siringa Nanofil.
- Utilizzando le belle pinze, afferrare il pesce dalla mandibola e trasferire rapidamente l'animale alla base intubazione.
- Posizionare l'animale in modo che sia dorsale-up della maschera cera e tale che la cannula 1 mm può essere inserita nella bocca. Utilizzare le belle pinze per manovrare il pesce e aprire la bocca intorno alla cannula. A causa della composizione del vassoio intubazione, un arresto è stato progettato nella base, consentendocannula da inserire 3 millimetri nella bocca del pesce.
- Una volta in posizione, accendere il tubo di perfusione per gravità contenenti tricaine.
- Tagliare una sezione di 3 centimetri 2 del tessuto Kimqipe e bagnarlo con acqua habitat.
- Posizionare il tessuto sopra l'animale per prevenire l'essiccamento. La sezione Kimwipe può essere posizionato anche per aiutare a tenere l'animale dorsale-up.
- Sotto il microscopio dissezione, usare le forbici a molla vanna per rimuovere ~ 2 millimetri 2 sezione del cranio che copre il tetto ottico. Questa zona si presenta come una piastra ossea scuro che si trova dietro l'occhio.
Figura 3- Inserire una lama delle forbici vanna sul bordo del piatto e spingere con forza sufficiente a penetrazioneTe l'osso, senza perforare il cervello. Chiudere le forbici per tagliare l'osso.
- Rimuovere il pezzo di osso.
- Se è presente del sangue, rimuovere utilizzando il bordo di un Kimwipe. Bleeding generalmente si arresta poco dopo l'esecuzione del craniotomia.
4. Elettrofisiologia
- Spegnere l'intubazione rubinetto e rapidamente scollegare il blocco Luer collegamento della base intubazione per la flebo tricaine.
- Spostare il setup intubazione intatta al microscopio elettrofisiologia e connettersi al sistema di perfusione.
- Accendere l'acqua habitat e perfusione ad una velocità di 1 ml / min per ~ 1 ora, per lavare la tricaine.
- Utilizzando un micromanipolatore sotto controllo visivo, posizionare l'elettrodo secondario in modo che la punta dell'elettrodo può essere inserito nella narice dell'animale o nel tuffo dietro la mascella superiore.
- Inserire l'ago elettrodo primario nell'apertura craniotomia. Inserire ilago nel tessuto, in modo che la punta è posizionata abbastanza superficiale nel tetto ottico.
- Se l'elettrodo è troppo profonda, il segnale elettrico può essere piccola.
- Raccogliere e analizzare la differenza elettrica registrata tra gli elettrodi di riferimento primari e secondari. Questo processo consentirà di registrazioni extracellulari essere ottenuti.
- Raccogliere i dati in modalità free-Gap a una frequenza di campionamento 5 kHz, con un filtro passa-basso di 0,1 kHz e un filtro passa alto di 1 Hz.
- Non iniziare a registrare l'attività elettrofisiologica finché l'acqua habitat è perfuso per un minimo di 45 min.
- Registrare una linea di base dell'attività nativo per almeno 15 minuti prima dell'aggiunta di farmaci sperimentali. Inizia perfusione con farmaci sperimentali di scelta e record per la quantità di tempo desiderato. Nelle preparazioni sani, è possibile registrare l'attività neurologica per 2-3 ore.
5. Clean Up
- Euthanize l'animale da overdose utilizzando tricaine in conformità con le pratiche accettate, come indicato dalla American Veterinary Medical Association (AVMA) Linee guida per l'eutanasia degli animali (2013).
- Zebrafish essere eutanasia deve essere posto in una soluzione tricaine a 200-500 mg / L. Pesci devono essere lasciati nella soluzione per almeno 10 min dopo la cessazione dell'attività dell'opercolo ritmica, dopo di che vengono sottoposti a un mezzo fisico di eutanasia (recisione cervicale) per assicurare la morte.
- Esegui DI acqua attraverso tutti i tubi e raccogliere per lo smaltimento, se pericolosi.
- Lasciare i rubinetti per ogni provetta in posizione aperta per facilitare l'asciugatura all'aria.
- Immergere gli elettrodi nel 70% di etanolo e lasciare asciugare all'aria.
- Pulire ogni pezzo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare all'aria.
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Representative Results
Questo protocollo è stato utilizzato per misurare l'attività neurale di zebrafish adulti in vivo. Queste registrazioni elettrofisiologiche sono costantemente e riproducibile ottenuti. Figura 5 mostra un esempio rappresentativo di alterazioni nativi e indotti dell'attività neurale di zebrafish adulto quando pentylenetetrazol (PTZ), una chemoconvulsant comune 6,7,25,26, è stato introdotto in intubazione setup.
L'attività neurologica nativo del zebrafish adulti è stata monitorata per ciascun esperimento (Figura 5A). Si è costantemente osservato che questa attività è spontaneo e piccola ampiezza durante la durata della registrazione. Dopo l'introduzione di 15 mM PTZ al sistema, scarichi epilettiformi simile spontanee cominciato a svilupparsi circa 5 min. dopo l'introduzione. Questa attività è stata inizialmente breve, piccola ampiezza e si è verificato frequentemente, simile a quanto osservato nel z larvaleebrafish 6,7. Con la continua esposizione al PTZ, un modello coerente di grandi scariche di ampiezza sviluppati che sono stati seguiti da piccoli, più frequenti esplosioni di attività e di un periodo tranquillo successivo (Figura 5B).
Questa tecnica è stata utilizzata con successo per introdurre altre chemoconvulsants attraverso il sistema intubazione. Con questi composti, cambiamenti di attività neurologica nativo sono stati evocati in modo efficace. Pentylenetetrazol stato qui utilizzato come esempio capacità dovuto alterare robustamente l'attività neurale nativo del zebrafish in maniera stereotipata.
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Discussion
Questo protocollo è stato utilizzato per misurare l'attività neurale di zebrafish adulti in vivo. Con la pratica, l'attività neurale può essere osservato in modo coerente, anche se le caratteristiche (ampiezza e forma degli eventi) dell'attività registrata possono variare tra individui. L'utilizzo della tecnica di registrazione extracellulare può spiegare questa osservazione. Il metodo fornisce il monitoraggio simultaneo di un numero elevato di celle all'interno di una regione 1, quindi variazioni di posizionamento dell'elettrodo primario può svolgere un ruolo nella attività osservata. Profondità dell'elettrodo primaria cambia anche la regione da misurare. Se la punta dell'elettrodo è posizionato troppo in profondità all'interno di una regione, il segnale osservato sarà più piccolo del previsto e alterazioni nell'attività sarà più difficile da osservare, se questo si verifica, è sufficiente tirare indietro l'elettrodo primario in modo che la punta è seduto più superficialmente . Prendere atto che questa è la caratteristica del tetto ottico e non è essereen guardò in modo approfondito in altre regioni del cervello. Tuttavia, questa procedura può essere eseguita all'interno di una regione diversa del cervello. Se l'attività neurale osservata diminuisce a livelli di base durante l'esperimento, ed è incerto se il pesce è ancora vivo, rimuovere gli elettrodi dal cranio e controllare per vedere se c'è ancora il flusso di sangue in tutto l'animale. Questo può essere verificato osservando le grandi vasi nel labbro o area nasale del pesce. Il flusso di sangue può essere facilmente visto in queste regioni. Se gli elettrodi vengono rimossi per controllare il flusso di sangue nel mezzo di una registrazione, riposizionamento degli elettrodi, saranno in una posizione leggermente differenti che erano inizialmente, negando la possibilità di confrontare direttamente questa parte della registrazione alla linea di base originale .
Prima di procedere, si deve garantire che i tubi di intubazione così come i tubi di perfusione sia per la craniotomia e le configurazioni sono elettrofisiologiaprivo di bolle. Se bolle si raccolgono, possono essere eseguiti dal sistema aprendo il rubinetto e consentendo una parte dell'acqua di habitat attraversano. Se questo non elimina il problema, una piccola siringa può essere fissata all'estremità del tubo, in cui la cannula sarebbe posto, e la luce di aspirazione applicata per rimuovere l'aria rimasta all'interno del sistema. Per le bolle resistenti, acqua habitat può essere forzato attraverso il tubo. Inoltre, assicurarsi che i tubi di perfusione sono pronti e grondante prima di intubare il pesce. Se una portata di ~ 1 ml / min non si ottiene, l'altezza della testa di pressione può essere modificata al fine di raggiungere questo obiettivo. Questo farà sì che il pesce ha accesso al flusso d'acqua sufficiente. Quando l'impostazione elettrofisiologia perfusione è configurato con numerose tubi in serie, è stato stabilito che ci sono voluti circa ~ 1 min per la nuova soluzione da introdurre per l'animale, anche se conseguenti modifiche dell'attività neurologica registrata dipendevano la bein compoundg introdotto. E 'consigliabile che tale portata si misura prima di effettuare eventuali esperimenti. Lavoro precedente ha indicato che tricaine può attenuare attività neurale, impone di essere rimosso dal sistema per ottenere registrazioni accurate 27,28. Attraverso il lavoro precedente, si è stabilito che un periodo di 45-60 min di intubazione con acqua habitat è necessaria per lavare la tricaine e per l'attività neurale di raggiungere livelli nativi. Allo stesso modo, washout di pentilentetrazolo stata inoltre effettuata, e si è stabilito che un periodo di 20 minuti è stato tenuto a restituire l'attività neurale ai livelli di base. Pertanto, gli sperimentatori dovrebbero completare gli studi per determinare i tempi di wash-out per ciascun composto di interesse introdotti nel sistema.
Questa tecnica richiede una certa pratica. Nell'effettuare la craniotomia, particolare attenzione deve essere presa per assicurare che una piccola regione della piastra ossea che copre la testa può essere forato e rimosso senza danneggiareil cervello. Questo può essere fatto introducendo le forbici vanna ad angolo acuto rispetto alla testa. La zona ossea che copre il tetto ottico ha fusioni vicino al centro che sono deboli e servire come buoni punti di ingresso per le forbici. Dopo una piccola pausa è stato fatto all'interno della piastra, usare le forbici per tagliare una piccola area dell'osso, e rimuovere con un paio di pinze sottili. Esemplari più giovani hanno spesso più morbide, crani più flessibili, in modo da pesci che sono di 1 anno di età uguale o inferiore sono suggeriti per l'uso, mentre l'apprendimento di questa tecnica. Occasionalmente, sangue inizierà a raccogliere intorno alla regione della craniotomia, ma questo può essere rimosso tamponando un Kimwipe delicatamente intorno alla zona. Con questa procedura, la craniotomia è molto piccola, essendo circa 2 mm 2 in zona. A causa di questa piccola taglia, non si è verificato disseccamento della regione cranica. Tuttavia, se la craniotomia è di dimensioni maggiori, è possibile applicare agar o qualche altro materiale per evitare la perdita di umidità dal cervello se ciò diventa problema.
Un punto di interesse è l'uso del bromuro di pancuronio. Questo prodotto chimico è memorizzato in aliquote di 10 microlitri per evitare il congelamento e scongelamento ripetitivo. Il volume ottimizzato per essere usato in un esperimento, essendo 1 ml per grammo di peso, è generalmente sufficiente per immobilizzare un pesce adulto. A volte, tuttavia, questo volume non è sufficiente. Quando ciò si verifica e paralisi non si ottiene, più pancuronio bromuro può essere somministrato per via intraperitoneale ai pesci, fintanto che la registrazione non è iniziato. Nell'effettuare l'iniezione, non cercare di iniettare attraverso le scale laterali difficili, iniettare il pesce nella regione addominale più morbida, vicino alla ventola. Se il pesce comincia a muoversi volta l'elettrodo primario è stato posizionato, c'è una buona probabilità che l'ago è stato interrotto nel craniotomia, e la procedura deve essere ripetuta utilizzando un nuovo animale. Attraverso questo lavoro, è stato determinato che il bromuro di pancuronio può ridurre l'neurale registrataattività in zebrafish larvale (≤ 50% di ampiezza basale) e si presume che lo stesso vale per gli adulti. Tuttavia, nella recente esperienza, l'attività neurale in un adulto è abbastanza robusto che gli eventuali effetti frenanti attribuiti al pancuronio bromuro non sembrano influenzare negativamente la capacità di raccogliere e analizzare i dati. Al contrario, confonde associati movimento può essere significativo. Per questa procedura, i benefici di completa immobilità dell'animale è di valore oltre questo limite e dei cambiamenti neurali che vengono introdotti sono abbastanza robusti di persistere al di là di qualsiasi grado d'ammortizzazione. Inoltre, qualsiasi movimento dall'animale può spostare l'elettrodo, essere registrata dalle apparecchiature di registrazione elettrofisiologia ed eventualmente mettere in pericolo l'animale.
I limiti di questa tecnica consiste principalmente nel fatto che la registrazione extracellulare è l'unico modo possibile di registrare attività neurologica nel zebrafish adulto intatto. Quando si posiziona la prima elettrodo RY, l'ago deve essere inserito nel craniotomia, non si rischia di vedere esattamente dove viene posizionato l'elettrodo. Anche se, con la pratica, è possibile posizionare l'elettrodo all'interno della stessa regione e alla stessa profondità costante.
In vivo elettrofisiologia è stato in gran parte limitato a larve di zebrafish. Ciò è dovuto alla capacità di immobilizzare facilmente il piccolo pesce e il fatto che non richiedono intubazione. Pertanto, studi elettrofisiologici sono concentrati sugli stadi larvali e poco è stato fatto per quanto riguarda l'attività elettrofisiologica all'interno del cervello adulto. Questo ha impedito qualsiasi confronto tra minori e adulti attività neurologica da effettuare. L'utilizzo del sistema di intubazione multitube permette una facile introduzione di una varietà di composti ai pesci. Questo permette anche per gli effetti di diverse sostanze chimiche o farmaci da studiare all'interno di entrambi i sistemi di larve e adulti.
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Figura 1. Intubazione cannula. Rimuovere una sezione di 1,5 centimetri dalla vasta fine di un giallo P-200 pipetteman punta (A). Inserire un pezzo di tubo mm 6 centimetri x 1 (freccia) in un blocco Luer ridurre connettore (B) e inserire questo cannula nella punta della pipetta modificato. Tenere la punta della pipetta in posizione con il blocco Luer con una breve porzione di ⅛ in tubo (C).
Figura 2. Finito l'installazione base di intubazione. Volta Golfo Cera si è raffreddato, mettere il setup cannula nel foro più piccolo del intBase ubation (A). Torcere un 1 nella striscia larga 42 cm Kimwipe in una spirale stretto e inserirlo nel tubo di scarico in modo che il Kimwipe estende su entrambe le estremità. Inserire un'estremità del tubo di drenaggio nel foro grande della scatola di Petri (B), permettendo l'estremità inferiore di estendere in 30 mm x 100 mm cristallizzando piatto (non in vista). Posizionare il tessuto in modo che una estremità si trovano vicino zona dello stomaco dell'animale (indicato con linea nera tratteggiata) e l'estensione inferiore può gocciolare nel piatto.
Figura 3. Craniotomia. Sotto il microscopio dissezione, usare le forbici a molla vanna per rimuovere ~ 2 millimetri 2 sezione del cranio che copre il tetto ottico. Questa zona si presenta come una lastra trapezoidale ossea scuro che ssua dietro l'occhio. Il cerchio tratteggiata delimita dove la craniotomia è posizionato. La freccia mostra che l'ago dell'elettrodo primario è posizionato all'interno del foro della craniotomia. L'elettrodo primario è costituito da un 2,5 nella sezione di 0.010 in filo d'argento che è stato placcato con ioni cloruro e inserite in un ago borosilicato capillare. L'ago capillare è riempito con 2-3 ml di 2 M di cloruro di potassio, o sufficiente a coprire parzialmente la punta cloruro rivestita del filo d'argento. L'elettrodo secondario è costituito da un 15 nella sezione dello stesso filo utilizzato per l'elettrodo primario tranne che una punta è saldato ad una estremità, permettendo così di essere inserito nella parte posteriore della testa stadi. L'estremità del filo secondario che deve essere posizionato toccare il pesce deve essere placcato con ioni cloruro. La freccia mostra dove l'elettrodo secondario è stato posizionato all'interno della narice destra del pesce adulto.
Figura 4. Configurazione per raccolta di attività elettrofisiologica. L'impostazione intubazione intatto viene spostato al microscopio elettrofisiologia e la cannula è collegata al sistema di perfusione (A). L'acqua sistema deve essere acceso, permettendo perfusione per iniziare immediatamente. Utilizzando il micromanipolatore, posizionare l'elettrodo secondario (B) in modo che la punta dell'elettrodo è inserito nella narice dell'animale o nel tuffo dietro la mascella superiore (freccia). Inserire l'ago elettrodo primario (C) nell'apertura craniotomia. Inserire l'ago in modo che sia posizionato abbastanza superficiale all'interno del tetto ottico. Il grande tubo di scarico (D) si estende dal piatto intubazione, fuori dal campo visivo, e l'altra estremità sfocia tegli piatto di raccolta.
Figura 5. Registrazioni elettrofisiologiche all'interno del tetto ottico. (A) Si è costantemente osservato che l'attività nativo nel tetto ottico del zebrafish adulto è stereotypically spontaneo, mostrando piccola ampiezza (2-10 mV) attività per tutta la durata della registrazione. (B) A seguito dell'introduzione dei 15 PTZ mM al sistema, gli scarichi epilettiformi-come spontanee hanno iniziato a sviluppare circa 5 minuti dopo l'introduzione. Questa attività è stata inizialmente breve, piccola ampiezza. Con l'esposizione continua alla PTZ, un modello coerente di grande ampiezza (fino a 15 mV) scarichi sviluppati che sono stati seguiti da piccoli, più frequenti scoppi di attività.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NINDS di Grant R01NS070159 (a TMD, JDL e ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M.
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
