Summary
이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
이전 성인 제브라 피쉬의 전기 생리학 연구는 준비 또는 아이 컵 준비 및 electrorentinogram 녹음에 슬라이스를 제한되었습니다. 이 논문은 신경 활동의 기록을 허용, 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 성인의 고정화는 구강 및 아가미 운동 대신 아가미로 용존 산소를 전달하는 메커니즘이 필요합니다. 우리의 기술로, 동물을 고정하고이 요구 사항을 충족하기 위해 서식지 물을 관류. 개두술은 tricaine 메탄하에 수행된다 (MS-222; tricaine) 마취는 뇌에 대한 액세스를 제공하기 위해. 주 전극이어서 세포 뇌 활동을 기록 개두 윈도우 내에 위치된다. multitube 관류 시스템의 사용을 통해, 약물 화합물의 다양한 신경 활동에 성어 및 변경에 투여 될 수있다관찰 할 수있다. 방법론은 신경 활동의 변화에 대하여 만들어 질 관측을 허용 할뿐만 아니라 비교는 유충 및 성인 zebrafish의 사이는 것이 또한 허용한다. 이는 연구자에게 인해 상이한 수명 단계에서의 다양한 화합물의 도입에 신경 활동의 변화를 식별 할 수있는 능력을 준다.
Introduction
이 글에서, 프로토콜은 성인 제브라 피쉬의 신경 활동의 생체 내 녹음에 얻기위한 설명되어 있습니다. 세포 외 기록 방법은 신경 조직의 소 영역 내의 전기적 활동의 전압 측정을 제공하는 데 사용된다. 조사의이 방법은 동물 행동 하나에 다수의 셀을 모니터링하는 것을 포함한다. 이전 슬라이스 녹음은 아이 컵 준비 및 전위도 녹음이로, 성인과 유충 모두에서 수행되었다. 이 실험은 대부분 다양한 감각 시스템 2-5의 생리적 반응은 세부 사항을 수행하고 있습니다. 최근까지 그대로 뇌의 준비는 호흡과 산소 확산이 피부를 통해 발생할 수있는 제브라 피쉬의 유충 3,6,7,와 전기 생리학을 수행 할 수 있었다. 우리의 준비는 동물이 O를 완전히 의식과 인식 남아있는 동안 성인 제브라 피쉬의 기본 신경 활동을 측정 할 수 있습니다F 그 주변.
제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 현재, 유전 독성, 약물 및 physiopathological 연구 3에 대한 모델로 기본적인 역할을한다. 그들은 유전, 신경 및 내분비 레벨 8의 포유 동물과 광범위한 동성을 공유하고 있기 때문에, 제브라 피쉬의 신경 과학 분야 내에서 가시성을 얻고있다. 지난 10 년간 표준 neuroanatomic과 면역 조직 화학 기술은 제브라 피쉬의 신경 9-12의 다른 신경 전달 물질 3,8,13의 분포의 상세한 특성 조직을 결정하는 데 사용되었다. 최근 연구자들은 행동 프로세스 16-19 감각 시스템 2,13,20의 전기 생리학 특성을 중심으로 많은 중 기능 연구 (14, 15), 자신의 포커스를 이동했다. 이러한 연구의 소수 Adul 5의 특정 영역의 전기적 활성도에 집중했다제브라 피쉬 뇌 21-23 톤 있지만 생체 내 접근법을 사용하여 수행되지 않았다.
이 프로토콜은 특정 뇌 영역에서 활동의 패턴을 설명하기 위해 제브라 신경계 내의 모두 자발적이고 유발 활성의 전기 생리학 연구에 적용 할 수있다. 이 기술의 사용은 비교가 젊은 유생 단계와 성인의 신경 활동 사이에 할 수 있습니다. 또한, 우리의 프로토콜은 유전자 또는 약물 학적 변화 사이의 비교를 허용합니다. 함께 같은 유전 공학 또는 약물 테스트와 같은 다른 접근 방법으로,이 방법은 늦게 발병 간질이나 신경 퇴행성 과정을 공부하는 등의 잠재적 인 응용 프로그램에 대한 신경 세포의 통신 및 소성 그대로 동물 성인뿐만 아니라의 기능 분석을위한 새로운 가능성을 제공합니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소와 엄격한에 따라 실시하고, 검토, 승인 및 조지아 기관 동물 관리 및 사용의 대학에 의해 우연히 목격 된 프로토콜 번호의 A2011 09-003을 관찰 하였다 위원회.
1. 장비 설치
- 개두술에 대한 재관류 시스템
성인의 고정화는 물고기에 용해 된 산소를 전달하는 삽관 시스템을 필요로한다. 시스템의 다양한 활용 될 수 있지만, 60 ㎖의 주사기로 이루어진 단순한 중력 시스템이 사용된다. 일관 ~ 1 ㎖ / 분의 유속을 산출 높이로 압력을 상승 헤드. 이 주사기는 전기 생리 관류 시스템에 사용되는 주사기와 직렬로 배치 될 수있다.- 하나의 60 ML 루어 락 주사기 튜브를 얻고 플런저를 제거합니다.
- 약 8 &에 주사기를 일시 중단# 160; 클램프를 사용하여 링 스탠드의베이스 위.
- 주사기의 끝 단방향 스톱 콕을 연결한다. 꼭지의 반대쪽에, 삽관 기지로 확장 할만큼 긴 튜브의 조각, 직경 2 ㎜를 연결합니다.
- 전기 생리학에 대한 재관류 시스템
전기 생리 실험의 경우, 실험 과정 동안 다양한 화합물을 도입하는 것이 필요하다. 시스템의 다양한 사용할 수 있지만, 시리즈 60 ㎖를 주사기로 이루어진 중력 시스템이 사용될 수있다. 이 설정은 해당 마개를 열어 수행 할 수있는 솔루션의 간단한 직렬 소개 할 수 있습니다.- 두 개 이상의 60 ML 루어 락 주사기를 확보하고 각에서 플런저를 제거합니다. 하나의 주사기는 이후의 각 튜브 물고기에 약물 다양한 화합물을 관리하는 데 사용할 수있는 반면, 물고기 서식지의 물을 관리하는 데 필요합니다.
- 3 각 주사기를 연결합니다 -방법 루어 연결 꼭지.
- 한쪽 끝에서 남성 루어 잠금 장치 시리즈에 주사기를 연결하는 외부 직경 (OD) 튜브의 ⅛를 사용합니다.
- 압력 헤드가 상기베이스 (27)의 높이, 또는 지속적 ~ 1 ㎖ / 분의 유속을 산출 높이까지 상승되도록 장치를 고정.
- 삽관 캐뉼라
삽관 정맥 물고기 유체의 도입을 용이하게한다. 이 설정은 가장 좋은 위치에 동물의 입 안에 정맥에 유연성과 탄력을 모두 제공합니다.- 가위의 일반 쌍 (예.는 Fiskars) 또는 면도날을 사용하여 P-200 피펫 팁의 넓은 끝에서 1.5 cm의 부분을 제거합니다.
- Tuohy BORST 어댑터 즉 여성 루어 잠금 캡과 실리콘 페룰와 감압 밸브에 튜브의 6cm X 1mm의 조각을 삽입하고 수정 피펫 팁으로이 캐 뉼러를 삽입합니다. 루어 L와 위치에 피펫 팁을 잡고직경의 튜브에 ⅛의 짧은 부분을 사용하여 옥토퍼스.
그림 1
- 삽관 법의 기본
이 접시는 안정된 직립 위치에 고정화 동물을 보유하고 삽관 통해 동물들이 유체의 제거를 용이하게하기 위해 사용된다. 이가 올바르게 설정되지 않은 경우, 풀링은 전기 생리학 녹음에 방해가 진동 신호로 이어지는 발생할 수 있습니다.- 100mm X 15mm 플라스틱 페트리 접시의 기본 요리를 얻습니다.
- 납땜 도구를 사용하여 접시의 측면에 구멍 직경 6mm와 림 립 아래 7.5 mm를 용융. 같은 도구를 사용하여, 구멍 직경 10 ㎜, 요리의 입술 아래 11mm ~ 74 ° 시계 반대 방향으로 녹아 작은 구멍. 이 구멍은 배수 구멍이 될 것입니다.
- 튜브 삽입 단부와 구멍에 직경 1cm는 끝이 차단 될 수 없다는 등을 해제. 그런 다음 작은 구멍에 P-200 Pipetteman 팁을 삽입,이 더미 정맥이 될 것입니다.
- 약간 큰 구멍의 측면에 상승 페트리 접시로, 정맥 구멍이 약간 덮여 있도록 접시에 녹은 통조림 왁스를 붓는다. 이 지역은 정맥이 물고기의 입으로 ~ 3mm 삽입 할 수 있도록 정지 될 것입니다. 이 세트의 최대 응고 허용되어야한다.
- 화염 가열 금속 가장자리를 사용하여, 채널이 캐뉼라의 선단에서 시작하여 약 1-2 인치 연장되도록 물고기를 보유하는 채널을 개척
- 주의 배수 포트에 캐 뉼러 영역으로부터 연속 하향 각이 형성되는 것을 보장하기 위해주의해야한다.065fig2.jpg "너비 ="400px "/>
그림 2
- 주의 배수 포트에 캐 뉼러 영역으로부터 연속 하향 각이 형성되는 것을 보장하기 위해주의해야한다.065fig2.jpg "너비 ="400px "/>
- 관류 설치
- 시작하기 전에 모든 기포를 제거하는 것을 보장, 서식지의 물을 살포 셋업을 세척하십시오.
- 개두술 관류 설정에 ~ 30 ㎖의 0.016 % (630 μM) tricaine 솔루션을 추가하고 ~ 2 ㎖ 그 tricaine이 관류 개시에 동물에 전달됩니다 보장하기 위해 튜브를 통해 실행할 수 있습니다. 희석 단계 2.2를 참조하십시오.
- 주요 관류 설치하려면 첫 번째 튜브에 서식지의 물 ~ 50 ㎖를 추가합니다. 나머지 튜브에 각각 원하는 실험 화합물을 추가합니다.
- 삽관베이스의 작은 구멍에 정맥 설치를 놓습니다.
- 단단한 나선형으로 42cm의 킴 와이프의 넓은 스트립에 1을 비틀 킴 와이프가 양쪽에 확장되도록 배수 튜브에 삽입합니다. 이 조직은 관류 액을 제거하는 심지 역할을하고 t 내 유체 상승을 방지하기 위해그는 전기 생리학 기록을 방해 할 수있는 기반을 삽관.
- 하단 모두 관류 폐기물을 수집 할만큼 큰 불활성 접시에 확장 할 수 있도록, 페트리 접시의 큰 구멍에 튜브의 한쪽 끝을 삽입합니다. 이 요리는 설치에 대한 유출 저수지 역할을합니다. 일단 동물의 복부 지역 근처에 거짓말을 할 수 있도록 조직을 배치하고 하단 확장은 접시에 똑 수 있습니다.
- 해부 현미경 근처에있는이 완료 삽관 법의 기초를 놓으십시오. tricaine 관류 튜브에 정맥의 루어 잠금 장치를 연결합니다.
- 모세관 바늘 전극
- 실버 와이어 및 설정을 접지 같은 와이어의 15으로 구성되어야한다 보조 전극에 0.010에서 2.5로 구성된 기본 전극을 얻습니다. 보조 전극의 경우, 적합 할 수있는 납땜 팁, 실버 와이어 0.010의 섹션 15를 사용머리 단계의 뒷면.
- 염화물 이온으로 기본 및 보조은 와이어 팁을 전기 도금을한다.
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여, <15 밀리 옴의 저항과 얇은 벽, 붕 규산염 모세관 바늘을 빼냅니다.
- 2-3 2 M 염화칼륨 μL, 또는 부분적으로 실버 와이어의 염화 코팅 끝을 커버하기에 충분한와 모세관 바늘을 입력합니다.
- 모세관 머리에 기본 전극을 삽입하고 전극 홀더에 장착.
- 미세 조작기로 머리 단계를 장착 한 다음 두 번째 미세 조작기에 보조 전극을 탑재합니다. 각 전극의 설치, 최초의 위치로 한 다음 머리 단계의 뒷면에 보조 전극의 납땜 끝을 맞습니다.
- 실버 와이어 및 설정을 접지 같은 와이어의 15으로 구성되어야한다 보조 전극에 0.010에서 2.5로 구성된 기본 전극을 얻습니다. 보조 전극의 경우, 적합 할 수있는 납땜 팁, 실버 와이어 0.010의 섹션 15를 사용머리 단계의 뒷면.
2. 솔루션의 제조, 관류 시스템, 전기 생리학 녹음 장비
- 서식지 물 1 L를 얻물고기 수족관에서.
- 0.016 %의 T] tricaine 메탄 (tricaine) (630 μM의 50 ㎖) 24.
- 0.4 % 트리스 버퍼 tricaine, 산도 7.2의 나누어지는 해동.
- 서식지의 물 47.9 ㎖의 0.4 % 트리스 버퍼 tricaine 2.1 mL를 넣고 섞는다.
- 원하는 수용성 실험 화합물 (예를 들어, 300 MM의 pentylenetetrazol, 일반적인 chemoconvulsant)의 주식 농도를 해동.
- 링거액 1 ㎍ / μL의 pancuronium 브로마이드 나누어지는을 녹여.
- 마취 및 서식지 물 실험 삽관 시스템을 모두 채우고 튜브에서 모든 거품을 제거하기 위해 적어도 충분히 배수. 거품이 동물의 질식을 선도, 유체의 흐름을 방해하기 때문에 수행해야합니다.
- 완전히 연결 튜브에 공기를 허용하지 않고 약물을 보유 할 관류 관 배수.
- 0.016 % (630 μM) tricaine 솔루션 마취 튜브를 기입하고 exper를 배치실험 관류 시스템에 추가 튜브 (들) imental 화합물 (들).
- 실험 관류의 첫 번째 관은 서식지의 물을 포함해야합니다.
- 빈 60mm X 15mm 페트리 접시에 서식지 물과 장소에 작은 구멍 스폰지 십니다. 마취제를 주입하는 동안이 요리는 생선을 보관하는 데 사용됩니다.
3. 개두
- 그것을하는 방식의 4 분의 3을 채우기 위해 15 X 60mm 페트리 접시에 630 μM의 tricaine 솔루션을 충분히 추가합니다. 채워진 접시의 무게를 측정. 상기 마취 복강 주입 될 수 있도록이 동물을 고정화하기 위해 사용된다.
- 접시 포함 tricaine에 동물을 담그고 다시 접시의 무게.
- 물고기의 중량을 구하는 단계 1과 2의 가중치의 차이를 뺀다.
- 동물이 조용하고 대부분의 동작이 정지 될 때까지 tricaine 솔루션에 남아 있습니다.
- 넓은 포셉 한 켤레를 사용하여 물기가 스펀지에 물고기를 전송하고 가로 방향으로 배치합니다. 꼬리 물고기를 전송하면이 프로세스에 대해 잘 작동합니다.
- 해부 현미경으로 스폰지와 물고기를 놓습니다.
- 34 G 바늘을 포함하는 Nanofil 주사기로, 물고기의 무게의 1 ㎍ / g이되도록 충분히 pancuronium 브로마이드를 측정합니다.
- 복강 Nanofil 주사기를 사용하여 pancuronium 브로마이드를 관리, 안정을 유지하는 물고기의 지느러미 측면을 따라 아이스 스틱을 사용.
- 미세 집게를 사용하여, 아래턱으로 물고기를 잡아 빠르게 삽관베이스에 동물을 전송합니다.
- 이 왁스 형태와 1mm 캐 뉼러가 입으로 삽입 될 수 있도록 등쪽에 근접되도록 동물을 배치. 물고기를 기동과 정맥 주위에 입을 열 미세 집게를 사용합니다. 때문에 삽관 트레이의 화장에, 정지가 가능, 기본으로 설계되었다정맥은 물고기의 입에 3mm를 삽입 할 수 있습니다.
- 일단 위치, tricaine을 포함하는 중력 공급 살포 튜브를 켭니다.
- Kimqipe 조직의 3cm 2 부분을 잘라 서식지 물을 적시고.
- 건조를 방지하기 위해 동물을 통해 조직을 놓습니다. 킴 와이프 섹션은 또한 동물 지느러미해서 들고 돕기 위해 위치 될 수있다.
- 해부 현미경, 광학 tectum을 덮고있는 두개골의 ~ 2mm 2 섹션을 제거하기 위해 베나 스프링 가위를 사용합니다. 이 지역은 눈 뒤에 앉아 어두운, 뼈 판처럼 보인다.
그림 3- 판의 가장자리에있는 베나 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고에 침투 할 수있을 정도의 충분한 힘으로 밀어뇌를 관통하지 않고, 뼈 테. 뼈를 싹둑 가위를 닫습니다.
- 뼈 조각을 제거합니다.
- 모든 혈액이 존재하는 경우에, 킴 와이프의 에지를 이용하여 제거한다. 일반적으로 출혈하는 것은 곧 뇌 수술을 수행 한 후 정지합니다.
4. 전기 생리학
- 삽관 스톱 콕을 차단하고 신속하게 tricaine 물방울에 삽관베이스를 연결하는 루어 잠금 장치를 분리합니다.
- 전기 생리학 현미경에 그대로 삽관 설정을 이동하고 관류 시스템에 연결합니다.
- 서식지의 물을 켜고 tricaine을 세척하기 위하여, ~ 1 시간 동안 1 ㎖ / 분의 속도로 perfuse.
- 전극 팁은 동물의 콧 구멍으로 또는 위턱 뒤에 딥에 삽입 될 수 있도록 카메라 제어 하에서 미세 조작기를 사용하여, 보조 전극을 위치.
- 개두술 개방에 기본 전극 바늘을 삽입합니다. 삽입팁은 광섬유 tectum 내의 상당히 피상적 위치하도록, 조직으로 바늘.
- 전극이 더 깊어 경우, 전기 신호가 작을 수있다.
- 상환과 주 및 보조 기준 전극 사이에 기록 된 전기 차를 분석한다. 이 프로세스는 얻어지는 세포 레코딩을 허용한다.
- 0.1 kHz의 로우 패스 필터 및 1 Hz의 고역 통과 필터와, 5 kHz 샘플 레이트에서 갭이없는 모드에서 데이터를 수집.
- 서식지의 물이 45 분의 최소 관류 때까지 전기 생리학 활동 기록을 시작하지 마십시오.
- 이전의 실험적인 약의 추가에 적어도 15 분 동안 기본 활동의 기준을 기록합니다. 원하는 시간에 대한 선택과 기록의 실험 약물 관류를 시작합니다. 건강한 제제에서는, 2-3 시간 동안 신경 활동을 기록 할 수있다.
5. 정리
- 미국 수의학 협회 (AVMA) 동물의 안락사 (2013)에 대한 지침에 의해 설명 된대로, 관습에 따라 tricaine를 사용하여 약물 과다 복용으로 동물을 안락사.
- 안락사 할 지브라 피쉬가 200-500 ㎎ / L.에서 tricaine 용액에 배치해야 물고기들이 죽음을 보장하기 위해 안락사 (자궁 절개)의 물리적 수단을 실시하고, 그 후에 리듬 아가미 활성의 정지 후 10 분간의 최소, 대 용액에 남아하여야한다.
- 모든 튜브를 통해 DI 물을 실행하고 위험한 경우, 적절한 처리를 위해 수집합니다.
- 공기 건조를 용이하게하기 위해 열린 위치에 각각의 튜브 스톱 코크를 남겨주세요.
- 70 % 에탄올에 전극을 담가 건조한 공기 수 있습니다.
- 70 % 에탄올로 각 조각을 청소하고 건조한 공기 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 생체 내 성인 지브라 피쉬의 신경 활동을 측정하는 데 사용되었다. 이러한 전기 생리학 기록은 일관되고 재현를 얻을 수있다. pentylenetetrazol (PTZ), 공통 chemoconvulsant 6,7,25,26가 삽관에 도입 될 때 그림 5는 성인 제브라 피쉬의 신경 활동의 기본 및 유도 변경의 대표적인 예를 보여줍니다 설치.
성인 제브라 피쉬의 기본 신경 활동은 각 실험 (그림 5A)을 감시했다. 그것은 지속적으로이 활동이 기록의 기간 동안 진폭이 자발적이고 작은 것이 관찰되었다. 시스템에 15 mM의 PTZ의 도입 후, 자발적인 간질 같은 방전은 약 5 분을 개발하기 시작 하였다. 소개 다음. 이 활동은 처음에 간단한, 작은 진폭이고 애벌레 Z에서 관찰 된 것과 유사한, 자주 발생ebrafish 6,7. PTZ, 활동의 작은, 더 자주 버스트 및 후속 조용한 기간 (그림 5B)에 의해 관찰 하였다 개발 된 큰 진폭 방전의 일관된 패턴에 계속 노출.
이 기술은 삽관 시스템을 통해 다른 chemoconvulsants을 소개하고 성공적으로 사용되어왔다. 이들 화합물로, 고유 신경 활동의 변화가 효과적으로 유발했다. Pentylenetetrazol는 견고하게 틀에 박힌 방식으로 제브라 피쉬의 기본 신경 활동을 변경하는 예를 들어 그것으로 인해 능력으로 여기에 사용되었다.
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Discussion
이 프로토콜은 생체 내 성인 지브라 피쉬의 신경 활동을 측정하는 데 사용되었다. 기록 된 활동의 특성 (진폭 및 이벤트의 모양) 개별 물고기에 따라 다를 수 있지만 연습으로, 신경 활동은 지속적으로 관찰 할 수있다. 세포 녹음 기술의 활용이 관찰을 설명 할 수 있습니다. 상기 방법은 제 1 지역 내의 다수의 셀의 동시 모니터링을 제공하므로 주 전극의 위치에서의 변화는 관찰 활동에 역할을 할 수있다. 주 전극의 깊이는 측정되는 영역을 변경합니다. 전극의 끝이 영역 내에서 너무 깊이에 위치하는 경우, 관측 된 신호는 예상과 활동의 변화가 관찰 어려울 것보다 작은 것,이 경우 끝이 더 피상적으로 앉아있다, 그래서 단순히 기본 전극을 철수 . 이 광학 tectum의 특성이며하지 않았 음을 유의EN은 뇌의 다른 지역에서 자세히 바라 보았다. 그러나,이 과정은 뇌의 다른 영역 내에서 수행 될 수있다. 관찰 된 신경 활동은 실험 기간 동안 기준선 수준으로 감소하고 물고기가 살아있는 경우가 불확실한 경우, 두개의 전극을 제거하고 혈액의 흐름이 동물을 통해 여전히이 있는지 확인합니다. 이 입술이나 물고기의 코 지역에 대형 선박을 관찰하여 확인할 수 있습니다. 혈류량은 쉽게 이들 영역에서 볼 수있다. 전극이 기록의 중간에 혈류를 확인하기 위해 제거되는 경우 전극을 재배치하면, 이들은 직접 일본어 기준선 기록의이 부분을 비교하는 기능을 무효화들이 처음되었습니다보다 약간 다른 위치에있을 것이다 .
이 절차를 시작하기 전에 삽관 튜브뿐만 아니라 개두술 및 전기 생리학 설정 모두에 대해 관류 튜브가 있는지를 확인해야합니다기포 무료. 기포가 상환 않으면, 그들이 스톱 콕을 열고 서식지 물의 일부를 통해 실행함으로써 시스템이 부족할 수있다. 이 문제를 제거하지 않으면 작은 주사기 뉼러가 배치 될 튜브의 단부에 부착 될 수 있고, 광 흡입 시스템 내에 남아있는 공기를 제거하기 위해 적용. 고집 거품의 경우, 서식지 물이 튜브를 통해 강제 할 수 있습니다. 또한, 관류 튜브가 초기화 및 물고기를 삽관 전에 떨어지는되어 있는지 확인하십시오. ~ 1 ㎖의 유속 / 분 수득되지 않은 경우, 압력 헤드의 높이가 이것을 달성하기 위해 변경 될 수있다. 이 물고기가 충분한 물 흐름에 액세스 할 수 있는지 확인합니다. 전기 생리학 관류 설정이 시리즈에서 수많은 튜브와 함께 설치되면, 그것은 기록 된 신경 활동의 결과로 변화가 복합 무관에 의존했다하더라도 그것은, 동물을 소개하는 새로운 솔루션에 대해 ~ 1 분 걸린 결정되었다G는 소개했다. 그것은이 흐름 속도는 이전의 모든 실험을 수행을 측정하는 것이 좋습니다. 이전 작업은 tricaine 정확한 기록 27,28을 얻기 위해 시스템에서 제거하기 위해 그것을 필요로하는, 신경 활동을 감쇠 할 수 있다는 것을 보여왔다. 이전의 연구를 통해, 그것은 서식지 물 삽관의 45 ~ 60 분 동안이 tricaine을 세척하고 신경 활동에 대한 네이티브 수준에 도달하기 위해 필요한 것으로 결정되었다. 마찬가지로 pentylenetetrazole의 유실도 실시하고,이를 20 분의 기간이 기준선 수준으로 신경 활동을 반환하는 데 필요한 것을 결정 하였다. 따라서, 실험자는 시스템에 도입되고 그 각각의 화합물에 대한 유실 시간을 결정하기 위해 시험을 완료해야합니다.
이 기술은 약간의 연습이 필요합니다. 개두술을 수행 할 때, 특별한주의가 헤드 커버 뼈 플레이트의 소 영역을 손상시키지 않고, 천공 및 제거 할 수 있도록주의해야뇌. 이것은 헤드에 대하여 예각 베나 가위를 도입함으로써 수행 될 수있다. 광학 tectum을 다루는 뼈 영역은 약한하고 가위 좋은 진입 점을 제공 중심 부근 융합되어 있습니다. 작은 휴식이 판 이내에되면, 뼈의 작은 영역을 잘라 가위를 사용하고, 미세 집게의 쌍을 사용하여 제거합니다. 어린 물고기들은보다 부드럽고 유연한 craniums이있다, 그래서이 기술을 배우면서 세 이하 1 년 어류는 사용을 위해 제안된다. 때때로, 혈액은 개두의 영역 주위를 수집하기 시작할 것이지만,이 부드럽게 지역 주위를 dabbing 킴 와이프에 의해 제거 될 수있다. 이 절차를, 개두술이 지역에서 약 2mm 2 인, 매우 작습니다. 이 때문에 작은 크기로 두개골 지역의 건조가 발생하지 않았습니다. 개두술의 크기가 큰 경우에는, 이것이 프로되기 않으면 뇌로부터 수분 손실을 방지하기 위해 한천 또는 다른 재료를 적용하는 것이 가능하다blem.
또한 포인트 pancuronium 브로마이드의 사용이다. 이 화학 물질은 반복적 인 동결 융해를 방지하기 위해, 10 μL의 분취 액에 저장된다. 체중 g 당 1 μL되고, 실험에 사용되는 제안 된 볼륨은 어른 물고기를 고정화하는 것이 충분하다. 그러나 때때로이 책은 적합하지 않습니다. 이런 마비가 획득되지 않을 때, 더 pancuronium 브로마이드만큼 기록이 시작되지 않은 것처럼, 생선에 복강 내 투여 할 수있다. 주사를 수행 할 때, 힘든 측면 비늘을 주입하려고하지 않습니다 통풍구 근처의 부드러운 복부 지역에서 물고기를 주입. 물고기가 주 전극이 배치 된 후에 이동하기 시작하면, 바늘 개두 이내에 해소되었으며, 절차는 새로운 동물을 사용하여 반복해야한다는 좋은 기회가있다. 본 연구를 통해, 그것은 pancuronium 브로마이드가 기록 신경을 줄일 수 있다고 판단 된애벌레 제브라 피쉬 (≤ 기준 진폭의 50 %)에서 활동하고는 같은 성인을위한 진정한 보유하고 있다고 가정한다. 그러나, 최근의 환경에서, 성인의 신경 활동은 pancuronium 브로마이드에 의한 임의의 완충 효과에 악영향 데이터를 수집 및 분석 할 수있는 능력에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다는 것을 충분히 견고하다. 반면, 운동과 관련된 혼동은 중요 할 수 있습니다. 이 절차는 동물의 완전한 부동의 장점은 이러한 제한을 넘어 가치가 도입 된 신경의 변화는 완충 효과를 지날 수있을만큼 강력합니다. 또한, 동물의 모든 운동은, 전극을 치환 할 수있는 전기 생리학 녹음 장비 등록 할 가능성이 동물을 위험.
이 기술의 한계는 주로 세포 외 기록은 그대로 성인 지브라 피쉬 내에 신경 활동의 기록 만 가능한 방법이라는 사실에 놓여. 주역을 배치 할 때 RY 전극은, 바늘은 전극이 배치되는 위치를 정확하게 보는 일을 방지 개두에 삽입되어야한다. 비록 연습, 동일 영역 내에서 일관되게 동일한 깊이에 전극을 배치하는 것이 가능하다.
생체 전기 생리학에서 주로 제브라 피쉬의 유충에 제한되었습니다. 이것은 쉽게 작은 물고기 그들이 삽관을 요구하지 않는다는 사실을 고정화 할 수있는 능력에 기인한다. 따라서, 전기 생리학 연구는 유충 단계에 초점을 맞추고있다 및 약간은 성인 뇌 내에서 전기 생리학 활동에 대한 수행되었습니다. 이 할 수있는 청소년 및 성인 신경 활동 사이의 비교를 방지하고있다. multitube 삽관 시스템의 사용은 물고기에 다양한 화합물을 쉽게 도입을 허용합니다. 이것은 또한 다른 화학 물질이나 모두 애벌레와 어른의 시스템 내에서 연구 할 수있는 약물의 효과에 대한 수 있습니다.
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그림 1. 삽관 캐 뉼러. 노란색 P-200 Pipetteman 팁 (A)의 넓은 끝에서 1.5 cm의 부분을 제거합니다. 커넥터 (B)를 감소 루어 잠금에 튜브의 6cm X 1mm의 조각을 (화살표)를 삽입하고 수정 된 피펫 팁으로이 캐 뉼러를 삽입합니다. 튜브 (C)의 ⅛의 짧은 부분을 사용하여 루어 잠금 위치에 피펫 팁을 잡고.
그림 2. 삽관 기본 설치를 완료했다. 걸프 왁스가 냉각되면, INT의 작은 구멍에 정맥 설치 장소ubation 기초 (A). 단단한 나선형으로 42cm의 킴 와이프의 넓은 스트립에 1을 비틀 킴 와이프가 양쪽에 확장되도록 배수 튜브에 삽입합니다. 하단 접시 (안보기)을 결정화 30mm X 100mm로 확장 할 수 있도록, 페트리 접시 (B)의 큰 구멍에 배출 호스의 한쪽 끝을 삽입합니다. 일단이 (검은 점선으로 설명) 동물의 위 지역 근처에 거짓말을 할 수 있도록 조직을 배치하고 하단 확장은 접시에 똑 수 있습니다.
그림 3. 개두. 해부 현미경, 광학 tectum을 덮고있는 두개골의 ~ 2mm 2 섹션을 제거하기 위해 베나 스프링 가위를 사용합니다. 이 지역은 그들 어두운, 사다리꼴 뼈 플레이트처럼 보이는그 눈 뒤에. 개두술가 위치하는 곳을 점선 원은 demarcates. 화살촉은 기본 전극의 바늘은 개두술의 구멍 내에 위치가 표시됩니다. 주 전극은 염소 이온과 전기 도금 및 붕규산 모세관 바늘에 삽입 된 실버 와이어 0.010의 섹션 2.5로 구성되어 있습니다. 모세관 바늘은 2-3 2 M 염화칼륨 μL, 또는 부분적으로 실버 와이어의 염화 코팅 끝을 커버하기에 충분한로 가득 차 있습니다. 보조 전극 팁은 그것이 헤드 단째의 뒷면에 삽입 될 수 있도록 일단에 납땜되는 것을 제외하고 주 전극에 사용 된 것과 동일한 와이어의 섹션에서 15으로 구성된다. 물고기 닿는 위치하도록 보조 와이어의 단부는 염화 이온으로 전기 도금되어야한다. 보조 전극이 성인 물고기의 오른쪽 콧 구멍 내에 배치 된 위치를 화살표가 표시됩니다.
그림 4. 전기 생리학 활동의 수집을위한 설정은. 그대로 삽관 설치는 전기 생리학 현미경으로 이동하고, 정맥은 재관류 시스템 (A)에 연결되어있다. 시스템 물 살포가 즉시 시작 할 수 있도록 설정되어 있어야합니다. 전극 팁은 동물의 콧 구멍으로 또는 위턱 (화살표) 뒤에 딥 삽입되도록 미세 조작기를 사용하여, 보조 전극 (B)을 배치. 개두술의 구멍에 기본 전극 침 (C)를 삽입합니다. 이 광학 tectum 내에서 상당히 표면에 위치하도록 바늘을 삽입합니다. 대형 배액관 (D)는 시야 중에 삽관 접시로부터 연장하고, 타단은 t 비운다그는 컬렉션 접시.
그림 5. 광학 tectum 내 전기 생리학 녹음. (A)이 지속적으로 성인 제브라 피쉬의 광학 tectum 내에서 기본 활동이 기록의 기간에 걸쳐 작은 진폭 (2-10 MV) 활동을 보여주는, 진부 자발적인 것이 관찰되었다. (B) 시스템에 15 mM의 PTZ의 도입 후, 자발적인 간질 같은 방전 도입 다음 약 5 분을 개발하기 시작 하였다. 이 활동은 처음에 간단한, 작은 진폭이었다. PTZ, 큰 진폭의 일관된 패턴에 계속 노출 (최대 15 MV) 활동의 작은, 더 자주 버스트 따랐다 개발 방전.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 (TMD, JDL 및 ATS에) NIH / NINDS 부여 R01NS070159에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
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