Summary
Dette dokumentet beskriver hvordan en voksen sebrafisk kan immobiliseres, intubert og anvendt for in vivo elektrofysiologiske eksperimenter for å tillate opptak og manipulering av nevral aktivitet i et intakt dyr.
Abstract
Tidligere har elektrofysiologiske studier i voksen sebrafisk vært begrenset til å skjære preparater eller til øye cup forberedelser og electrorentinogram innspillinger. Dette dokumentet beskriver hvordan en voksen sebrafisk kan immobiliseres, intubert og anvendt for in vivo elektrofysiologiske eksperimenter, slik at opptak av nevral aktivitet. Immobilisering av den voksne krever en mekanisme for å levere oksygen til gjellene i stedet for buccal og opercular bevegelse. Med vår teknikk, er dyr immobilisert og perfundert med habitat vann for å oppfylle dette kravet. En kraniotomi er utført under Tricaine methanesulfonate (MS-222; Tricaine) anestesi for å gi tilgang til hjernen. Den primære elektrode blir så plassert inne i kraniotomi-vinduet for å ta opp ekstracellulært hjerneaktivitet. Gjennom bruk av et multitube perfusjons-system, kan en rekke farmakologiske forbindelser administreres til en voksen fisk og eventuelle forandringer i nerveaktivitetkan observeres. Metodikken gir ikke bare en observasjonene skal gjøres om endringer i nevrologisk aktivitet, men det gir også mulighet for sammenligninger gjøres mellom larve og voksen sebrafisk. Dette gir forskerne mulighet til å identifisere forandringer i neurologisk aktivitet på grunn av innføring av forskjellige forbindelser på forskjellige stadier.
Introduction
I denne artikkelen, er en protokoll som er beskrevet for å skaffe in vivo innspillinger av nevral aktivitet i voksen sebrafisk. Ekstracellulære opptaksmetoder brukes, og gir spenningsmålinger av elektrisk aktivitet innenfor et lite område av nervevev. Denne metode for undersøkelse involverer å overvåke et stort antall celler i et dyr oppfører seg en. Tidligere har slice opptak utført i både voksne og larver, som har øye cup forberedelser og elektroretinogrammet innspillinger. Disse eksperimentene har i stor grad blitt utført på detaljer fysiologiske responser av ulike sensoriske systemer 2-5. Inntil nylig har intakte hjerne forberedelser kun vært tilgjengelig for å utføre elektrofysiologi med sebrafisk larve 3,6,7, hvor respirasjon og oksygen diffusjon kan skje gjennom huden. Våre forberedelser gjør at innfødte nevrologiske aktiviteten til en voksen sebrafisk som skal måles mens dyret fortsatt er fullt bevisst og klar of sine omgivelser.
Sebrafisk (Danio rerio) for tiden spiller en fundamental rolle som en modell for genetiske, toksikologiske, farmakologiske, og physiopathological studier tre. Sebrafisk har fått synlighet innen nevrovitenskap fordi de deler utstrakt homologi med pattedyr på genetisk, nevrale og hormonnivåer åtte. I løpet av det siste tiåret, har standard neuroanatomic og immunhistokjemiske teknikker blitt brukt til å bestemme detaljert karakteristisk organisering av sebrafisk nervesystemet 9-12 og av fordelingen av ulike nevrotransmittere 3,8,13. Mer nylig har forskere flyttet sitt fokus til funksjonelle studier 14,15, hvorav mange sentrumet på atferdsmessige prosesser 16-19 og elektrofysiologiske egenskapene av sensoriske systemer 2,13,20. Et lite antall av disse studiene har konsentrert seg om den elektriske aktiviteten i bestemte områder av adult sebrafisk hjerne 21-23, men ble ikke gjennomført ved hjelp av en in vivo tilnærming.
Denne protokollen kan tilpasses for elektrofysiologiske studier av både spontan og evoked aktivitet innenfor sebrafisk nervesystemet å beskrive mønstre av aktivitet i bestemte områder av hjernen. Bruken av denne teknikken tillater sammenligninger gjøres mellom den nevrologiske aktiviteten til unge larvestadier og voksne. Videre tillater vår protokoll sammenligninger mellom genetiske eller farmakologiske endringer. Sammen med andre metoder, som genteknologi eller farmakologiske tester, har denne metoden en ny mulighet for funksjonell analyse av neuronal kommunikasjon og plastisitet i intakt voksne dyr, så vel som for mulige anvendelser, for eksempel studerer sen debut epilepsi eller neurodegenerative prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og fulgte protokollen # A2011 09-003, som ble gjennomgått, godkjent og overvåket av University of Georgia Institutional Animal Care og bruk komiteen.
En. Oppsett utstyr
- Perfusjonssystem for kraniotomi
Immobilisering av den voksne nødvendiggjør en intubasjon system for å levere oksygen til fisken. En rekke systemer kan benyttes, men en enkel gravitasjonssystem bestående av en 60 ml sprøyte som brukes. Hev trykket hodet til en høyde som konsekvent gir en strømningshastighet på ~ 1 ml / min. Denne sprøyten kan plasseres i serie med sprøyter som deretter brukes for den elektro perfusjon system.- Skaff en singel 60 ml Luer lock sprøyte tube og fjerne stempelet.
- Suspendere sprøyten ca 8 i &# 160, over bunnen i en ring-stand ved hjelp av en klemme.
- Koble en en-veis stoppekran til enden av sprøyten. Til den motsatte ende av stoppekran, kobler et stykke rør, 2 mm i diameter, som er lang nok til å strekke seg til intubasjon basen.
- Perfusjonssystem for elektrofysiologi
For elektrofysiologiske eksperimenter, er det ofte nødvendig å innføre en rekke forbindelser i løpet av et eksperiment. En rekke systemer er tilgjengelige, men en tyngdekraft-system bestående av 60 ml sprøyter i serie kan benyttes. Dette oppsettet gir enkel, serie innføring av løsninger som skal utføres ved å åpne den tilsvarende stoppekran.- Få to eller flere 60 ml Luer lock sprøyter og fjerne stempler fra hver. En sprøyte er nødvendig for å administrere habitat vann til fisken, mens hver etterfølgende rør kan benyttes for å administrere en rekke farmakologiske forbindelser til fisken.
- Koble hver sprøyte til en 3 -veis kran med en Luer-tilkobling.
- Bruk ⅛ i ytre diameter (OD) slange til å koble sprøytene i serie med en mannlig Luer lock på den ene enden.
- Feste enheten slik at trykkhodet er hevet til en høyde på 27 i over bunnen, eller en høyde som konsekvent gir en strømningshastighet på ~ 1 ml / min.
- Intubasjon kanyle
Den intubasjon kanyle muliggjør innføring av fluidum til fisken. Dette oppsettet gir både fleksibilitet og fasthet til beste posisjon kanylen innenfor dyrets munn.- Ved hjelp av noen generell saks (f.eks. Fiskars) eller et barberblad, fjerne en 1,5 cm delen fra den brede enden av en P-200 pipettespissen.
- Sett inn en 6 cm x 1 mm stykke slangen inn en reduksjonsventil med en kvinnelig Luer lock og silikon hylse, dvs. en Tuohy Borst adapter, og sette inn denne kanyle i den modifiserte pipettespissen. Hold pipettespissen i posisjon med Luer lock ved hjelp av en kort del av ⅛ i diameter rør.
Figur 1
- Intubasjon basen
Denne tallerken blir brukt til å holde den immobiliserte dyret i en stabil, opprettstående stilling, og for å lette fjerningen av fluidet som kommer inn i dyret ved intubasjon. Hvis dette ikke er etablert på riktig måte, kan kontoforekomme, som fører til forstyrrende vibrasjons-signaler i den elektro opptaket.- Skaff basen rett av en 100 mm x 15 mm plast petriskål.
- Ved hjelp av et loddeverktøy, smelter et hull på 6 mm i diameter og 7,5 mm under kanten på felgen, inn i siden av fatet. Ved hjelp av samme verktøy, smelte et hull, 10 mm i diameter og 11 mm under kanten på fatet ~ 74 ° mot klokka fra mindre hull. Dette hullet vil fungere som dreneringshull.
- Før et rør, en cm i diameter, ned i hullet med enden løftes slik at enden ikke kan blokkeres. Deretter setter en P-200 pipetteman spissen inn i det lille hullet, dette vil fungere som en dummy kanyle.
- Med petriskål litt forhøyet på siden av det større hullet helle smeltet hermetikk voks i formen, slik at kanylen hullet er bare dekket. Regionen vil tjene som en stopper, slik at kanylen skal settes inn ~ 3 mm inn i munnen på fisken. Dette settet opp bør få lov til å stivne.
- Ved hjelp av en flamme-varmet metallkant, skjære en kanal for å holde fisken, slik at kanalen starter fra spissen av kanylen og strekker seg omtrent 1-2 i.
- Forsiktighet må utvises for å sikre at et kontinuerlig vinkel nedover fra kanylen området til drens port er dannet.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Fig. 2
- Forsiktighet må utvises for å sikre at et kontinuerlig vinkel nedover fra kanylen området til drens port er dannet.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Perfusjon setup
- Før du begynner, må du skylle perfusjon set-ups med habitat vann, slik at alle luftbobler fjernes.
- Til ~ 30 ml av 0,016% (630 mM) Tricaine løsning av kraniotomi perfusjon oppsett og tillate ~ 2 ml for å kjøre gjennom slangen for å sikre at Tricaine vil bli levert til dyret ved perfusjon initiering. Se trinn 2.2 for fortynning.
- Til de viktigste perfusjon oppsett, tilsett ~ 50 ml av habitat vann til det første røret. Tilføy eventuelle eksperimentelle forbindelser til hver av de gjenværende rør.
- Sett kanylen oppsettet i det lille hullet på intubasjon basen.
- Tvinn en 1 i bred stripe av 42 cm Kimwipe inn i en tett spiral og sett den inn i avløpsrøret slik at Kimwipe strekker seg på begge ender. Dette vevet vil tjene som en veke for å fjerne perfundert væske og for å hindre fluidoppbygning innen than intubasjon base, noe som kan forstyrre elektrofysiologisk registrering.
- Sett den ene ende av slangen inn i det store hullet i petriskålen, slik at den nedre ende for å strekke seg inn i en inert tallerken som er stor nok til å samle all perfusjon avfall. Denne retten vil tjene som utstrømningen reservoar for oppsettet. Plasser vevet slik at den ene ende vil ligge i nærheten av dyrets buk-regionen og den nedre forlengelse kan dryppe ned i fatet.
- Plasser dette gjennomført intubasjon base nær disseksjonsmikroskop. Koble Luer lock av kanylen til Tricaine Perfusjonsslangen.
- Kapillær nål og elektroder
- Skaff en primær elektrode som består av 2,5 i 0,010 i sølv wire og en sekundær elektrode som skal bestå av 15 i av den samme ledningen til jord oppsettet. For sekundær elektrode, bruker en 15 i seksjon av 0.010 i sølv wire med en loddet tips, noe som gjør at den passerpå baksiden av en hode-scenen.
- Electro tips av både primære og sekundære sølv ledninger med kloridioner.
- Ved hjelp av en mikropipette avtrekker, trekke en tynnvegget, borsilikat kapillær nål med en motstand på <15 mΩ.
- Fyll kapillær nål med 2-3 pl av 2 M kaliumklorid, eller tilstrekkelig til delvis dekning av den klorid-belagt spissen av sølvtråd.
- Før den primære elektrode inn i den kapillære hodet og montere den i elektrodeholderen.
- Monter hode-scenen i en micromanipulator og deretter montere den sekundære elektrode inn i en andre mikromanipulator. Med oppsettet, første posisjon hver elektrode og deretter passe loddet tuppen av den sekundære elektrode inn på baksiden av hodet-stadiet.
- Skaff en primær elektrode som består av 2,5 i 0,010 i sølv wire og en sekundær elektrode som skal bestå av 15 i av den samme ledningen til jord oppsettet. For sekundær elektrode, bruker en 15 i seksjon av 0.010 i sølv wire med en loddet tips, noe som gjør at den passerpå baksiden av en hode-scenen.
2. Utarbeidelse av løsninger, Perfusjons System, og Elektroopptaksutstyr
- Skaffe en L av habitat vannfra akvariet av fisk.
- 0.016% T] Tricaine methanesulfonate (Tricaine) (50 ml 630 mm) 24.
- Tin en alikvot av 0,4% Tris-bufret Tricaine, pH 7,2.
- Legg 2,1 ml 0,4% Tris-bufret Tricaine til 47,9 ml av habitat vann og bland.
- Tin lager konsentrasjon av ønskede vannoppløselige eksperimentell forbindelse (f. eks 300 mM pentylentetrazol, en vanlig chemoconvulsant).
- Tine opp en delmengde av 1 ug / mL pancuronium bromid i Ringers løsning.
- Fyll både bedøvelse og eksperimentelle intubasjon systemer med habitat vann og avløp i hvert fall nok til å fjerne alle bobler fra rørene. Dette må gjøres fordi boblene hindrer fluidstrømmen, noe som fører til kvelning av dyret.
- Helt avløp perfusjon rør som vil holde narkotika uten å tillate luft inn i kobler slangen.
- Fyll bedøvelse tube med 0,016% (630 mm) Tricaine løsning og plassere noen kompetanseimental forbindelse (r) i ytterligere rør (e) på eksperimentell perfusjon system.
- Det første rør på eksperimentell perfusjon bør inneholde bare habitat vann.
- Fukt den lille pore svamp med habitat vann og legg i en tom 60 mm x 15 mm petriskål. Denne retten vil bli brukt til å holde fisken mens bedøvelsen er injisert.
Tre. Craniotomy
- Legg nok av 630 mikrometer Tricaine løsning på en 15 x 60 mm petriskål for å fylle det om lag tre fjerdedeler av veien. Vei fylt fatet. Dette vil bli benyttet for å immobilisere dyret, slik at ytterligere anestesi kan injiseres intraperitonealt.
- Fordyp dyret i formen inneholder Tricaine og veie fatet igjen.
- Trekk fra forskjellen mellom vektene fra trinn 1 og 2 for å få vekten av fisken.
- Tillater dyret å stå i Tricaine løsning inntil rolig og mest bevegelsen har opphørt.
- Ved hjelp av et par brede tang, overføre fisken til premoistened svamp og plassere den sidelengs. Overføring av fisken ved halen fungerer godt for denne prosessen.
- Plasser svamp og fisken under disseksjonsmikroskop.
- Med en Nanofil sprøyte med en 34 G nål, måle ut nok pancuronium bromid slik at det foreligger 1 pg / g fiskevekt.
- Ved hjelp av en pinne popsicle langs ryggsiden av fisken for å holde den fast, administrere pancuronium bromid intraperitonealt ved hjelp av Nanofil sprøyten.
- Ved hjelp av fine pinsetter, ta tak i fisken ved den nedre kjeve og raskt å overføre dyret til intubasjon basen.
- Plasser dyret slik at det er dorsal-up på voks form og slik at den 1 mm kanylen kan føres inn i munnen. Bruk fin pinsett til å manøvrere fisken, og åpne munningen rundt kanylen. På grunn av sammensetningen av intubasjon skuffen, ble en stopp konstruert inn i sålen, slik atkanyle settes inn 3 mm inn i munnen på fisken.
- En gang i posisjon, skru på gravitasjon-matet perfusjon rør som inneholder Tricaine.
- Skjær en 3 cm 2 delen av Kimqipe vev og våt den med habitat vann.
- Plasser vevet over dyret for å forhindre uttørking. Den Kimwipe seksjonen kan også være plassert for å hjelpe til å holde dyret dorsal-up.
- Under disseksjon mikroskopet, bruker Vanna våren saks for å fjerne ~ 2 mm 2-delen av kraniet som dekker den optiske Tectum. Dette området ser ut som en mørk, benete plate som sitter bak øyet.
Figur 3- Sett ett blad av de Vanna saks på kanten av platen og presse med nok kraft til å gjennomtrengte ben, uten å stikke hull i hjernen. Lukk saksen til klipp beinet.
- Fjern stykke bein.
- Hvis noen blod er til stede, fjerne ved hjelp av kanten av en Kimwipe. Blødning vanligvis stopper kort tid etter gjennomføring av kraniotomi.
4. Elektrofysiologi
- Slå av intubasjon stop-kuk og raskt koble Luer lock kobler intubasjon basen til Tricaine drypp.
- Flytt intakt intubasjon oppsettet til elektromikroskop og koble til perfusjon system.
- Slå på habitat vann og perfuse med en hastighet på 1 ml / min for ~ 1 time, for å vaske ut Tricaine.
- Ved hjelp av en mikromanipulator i henhold til visuell kontroll, plasseres den sekundære elektrode, slik at elektrodespissen kan føres inn i dyrets neseboret, eller inn i dip bak den øvre kjeven.
- Sett det primære elektrode nål inn i craniotomy åpningen. Sett innnål inn i vevet, slik at spissen er posisjonert relativt overfladisk innenfor optikken Tectum.
- Hvis elektroden er for dypt, kan det elektriske signalet være liten.
- Samle inn og analysere den elektriske forskjellen er tatt mellom primære og sekundære referanseelektroder. Denne prosessen gjør det mulig for ekstracellulære opptak som kan oppnås.
- Samle inn data i Gap-fri modus på et 5 kHz samplingsfrekvens, og et lavpass-filter på 0,1 kHz og et høypassfilter på 1 Hz.
- Må ikke begynne å ta opp elektrofysiologisk aktivitet før habitat vann har perfundert i minst 45 min.
- Spill inn en baseline av innfødte aktivitet i minst 15 minutter før tilsetning av eksperimentelle narkotika. Begynn perfusjon med eksperimentelle narkotika av valget og rekord for den ønskede mengden av tid. Hos friske forberedelser, er det mulig å ta opp den nevrologiske aktiviteten for 2-3 hr.
5. Rydde opp
- Avlive dyret ved overdose hjelp Tricaine i samsvar med akseptert praksis, som skissert av American Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer for Avliving av dyr (2013).
- Sebrafisk avlives bør plasseres i en Tricaine oppløsningen ved 200 til 500 mg / L. Fisk er å stå i løsningen i minst 10 minutter etter opphør av rytmisk opercular aktivitet, hvoretter de utsettes for en fysisk middel for avlivning (cervikal tran) for å sikre at døden.
- Kjør DI vann gjennom alle rør og samle for korrekt avhending, dersom farlig.
- La stoppekranene for hvert rør i åpen stilling for å lette tørringen.
- Sug elektrodene i 70% etanol og la det lufttørke.
- Rengjør hver brikke med 70% etanol og la det lufttørke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokoll er blitt brukt for å måle neural aktivitet av voksne sebrafisk in vivo. Disse elektrofysiologiske målinger er konsekvent og reproduserbart oppnådd. Figur 5 viser et representativt eksempel på innfødte og induserte forandringer av nevral aktivitet hos en voksen sebrafisk når pentylentetrazol (PTZ), en felles chemoconvulsant 6,7,25,26, innføres i intubasjon setup.
De innfødte nevrologiske aktiviteten av den voksne sebrafisk ble overvåket for hvert forsøk (figur 5A). Det ble konsekvent observert at denne aktiviteten er spontan og små i amplitude i løpet av varigheten av opptaket. Etter innføring av 15 mM PTZ til systemet, begynte spontant epileptiske liknende utladninger til å utvikle ca 5 min. følgende innledning. Denne aktiviteten var i utgangspunktet kort, liten amplitude og forekom ofte, i likhet med det som ble observert i løpet av larve zebrafish 6,7. Med fortsatt eksponering for PTZ, et konsistent mønster av store amplitude utslipp utvikles som ble etterfulgt av mindre, mer hyppige utbrudd av aktivitet og en påfølgende rolig periode (Figur 5B).
Denne teknikken har blitt brukt med hell for å innføre andre chemoconvulsants via intubering system. Med disse forbindelser, ble forandringer i naturlig nevrologisk aktivitet også effektivt fremkalt. Pentylentetrazol ble her brukt som et eksempel på grunn av det evne til robust endre innfødte nevral aktivitet av sebrafisk i en stereotypisk måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokoll er blitt brukt for å måle neural aktivitet av voksne sebrafisk in vivo. I praksis kan nevral aktivitet observeres konsekvent, skjønt de egenskaper (amplitude og form av hendelser) av den innspilte aktivitet kan variere mellom de enkelte fisker. Utnyttelse av den ekstracellulære opptaksteknikk kan forklare denne observasjonen. Fremgangsmåten gir mulighet for samtidig overvåkning av et stort antall celler i en region 1, slik at variasjoner i posisjoneringen av den primære elektrode kan spille en rolle i den observerte aktivitet. Dybden av den primære elektrode endres også det området som måles. Hvis spissen av elektroden er plassert for dypt i et område, vil det observerte signalet være mindre enn forventet, og endringer i aktivitet vil være vanskeligere å overholde, og hvis dette skjer, er det bare å trekke tilbake den primære elektrode slik at spissen sitter mer overfladisk . Ta oppmerksom på at dette er karakteristisk for den optiske Tectum og har ikke væreno sett på i dybden i andre regioner av hjernen. Imidlertid kan denne framgangsmåten utføres i en annen region av hjernen. Hvis den observerte nevrale aktiviteten avtar til baseline nivå under forsøket, og det er usikkert om fisken er fortsatt i live, fjerne elektrodene fra kraniet og sjekke for å se om det er fortsatt blodstrøm gjennom dyret. Dette kan kontrolleres ved å observere de store beholdere i leppe-eller nese-området av fisken. Blodstrømmen kan lett sees i disse regionene. Hvis elektrodene er fjernet for å kontrollere blodstrømmen i midten av en innspilling, ved reposisjonering av elektrodene, vil de være i en litt annen plassering enn de var opprinnelig, eliminerer evnen til å direkte sammenligne denne del av opptaket til den opprinnelige utgangs .
Før du starter denne prosedyren, må det sikres at intubasjon rør samt perfusjon rør for både kraniotomi og elektrofysiologi oppsett erfri for bobler. Hvis bobler samler, kan de bli drevet ut av systemet ved å åpne hane og tillate noe av habitat vannet renne gjennom. Hvis dette ikke eliminere problemet kan en liten sprøyte festes til enden av røret, hvor kanylen ville være plassert, og lett suge anvendt for å fjerne gjenværende luft i systemet. For vanskelige bobler, kan habitat vann bli tvunget gjennom slangen. Sørg også for at perfusjon rørene er primet og drypper før intubering fisken. Ved en strømningshastighet på ~ 1 ml / min er ikke oppnås, kan høyden på trykkhodet forandres for å oppnå dette. Dette vil sikre at fisken har tilgang til tilstrekkelig vannføring. Når elektrofysiologi perfusjon oppsettet er satt opp med en rekke rør i serien, ble det fastslått at det tok ca ~ 1 min for den nye løsningen for å bli introdusert til dyret, men resulterende endringer i den registrerte nevrologiske aktiviteten var avhengig av forbindelsen er:g innført. Det anbefales at denne luftmengden måles før du utfører eventuelle eksperimenter. Tidligere arbeid har påvist at Tricaine kan svekke nevral aktivitet, krever å bli fjernet fra systemet for å oppnå nøyaktige opptak 27,28. Ved tidligere arbeider ble det fastslått at i en periode på 45-60 min for intubasjon med habitat vann er nødvendig for å vaske ut Tricaine og for nevral aktivitet for å nå opprinnelige nivåer. Tilsvarende, ble utvasket pentylenetetrazole ble også utført, og det ble fastslått at en periode på 20 minutter var nødvendig for å returnere nevral aktivitet til utgangsnivåer. Derfor bør experimenters gjennomføre forsøk for å bestemme utvaskingstider for hver forbindelse av interesse som blir introdusert inn i systemet.
Denne teknikken krever litt øvelse. Ved gjennomføringen av kraniotomi, må ekstra forsiktighet utvises for å sikre at et lite område av knokkelplaten som dekker hodet kan punkteres og fjernes uten å skadehjernen. Dette kan gjøres ved å innføre de Vanna saksen i en spiss vinkel i forhold til hodet. Den benete område som dekker den optiske Tectum har fusjoner nær sentrum som er svake og tjene som gode startpunkter for saksen. Når en liten pause har blitt gjort innenfor plate, bruke saks til å klippe et lite område av bein, og fjerne ved hjelp av et par fine tang. Yngre fisk har ofte mykere, mer smidig kranier, så fisk som er ett år eller mindre er foreslått for bruk mens du lærer denne teknikken. Av og til vil blodet begynner å samle seg rundt området av kraniotomi, men dette kan fjernes ved dabbing Kimwipe forsiktig rundt området. Med denne fremgangsmåten, er kraniotomi meget små, å være omtrent 2 mm 2 i området. På grunn av denne lille størrelsen, har uttørking av skallen ikke skjedd. Imidlertid, hvis den kraniotomi er større i størrelse, er det mulig å anvende agar eller et annet materiale for å hindre tap av fuktighet fra hjernen dersom dette blir et problem.
Et punkt av interesse er bruk av pancuronium bromide. Dette kjemikalie er lagret i aliquoter på 10 pl for å hindre gjentatt frysing og tining. Den foreslåtte volum for å bli brukt i et eksperiment, blir 1 mL per gram av vekt, er vanligvis tilstrekkelig til å immobilisere en voksen fisk. Noen ganger, derimot, er dette volumet ikke tilstrekkelig. Når dette skjer, og paralyse ikke er oppnådd, kan mer pancuronium bromid administreres intraperitonealt til fisken, så lenge opptaket ikke har begynt. Når du utfører injeksjon, ikke prøv å injisere gjennom tøffe side skalaer; injisere fisken i mykere magen regionen, nær et uttak. Dersom fisken begynner å bevege seg når den primære elektrode er anbragt, er det en god sjanse for at nålen er blitt brutt av i kraniotomi, og fremgangsmåten må gjentas ved bruk av et nytt dyr. Gjennom dette arbeidet har det blitt fastslått at pancuronium bromide kan redusere den innspilte nevraleaktivitet i larvesebrafisk (≤ 50% av baseline amplitude), og det antas at det samme gjelder for voksne. Men i siste erfaring, er den nevrale aktiviteten i en voksen robust nok til at noen dempende effekter tilskrives pancuronium bromide ikke synes å påvirke evnen til å samle inn og analysere data. I motsetning til dette kan confounds forbundet med bevegelses være betydelig. For denne prosedyren, fordelene med komplett immobilitet av dyret er av verdi utover denne begrensningen og de nevrale endringene som er innført er robust nok til å vedvare utover noen dempende effekter. Dessuten kan en hvilken som helst bevegelse fra dyret forskyve elektroden, registreres av elektroopptaksutstyr og muligens skade på dyret.
Begrensningene av denne teknikken først og fremst ligge i det faktum at ekstracellulære innspillingen er den eneste mulige måten å samle inn nevrologisk aktivitet innen intakt voksen sebrafisk. Ved plassering av prima ry elektrode, må nålen settes inn i kraniotomi, hindrer en i å se nøyaktig hvor elektroden blir plassert. Skjønt, med praksis, er det mulig å plassere elektroden i samme område og på samme dybde konsekvent.
In vivo elektrofysiologi har i stor grad vært begrenset til sebrafisk larver. Dette skyldes muligheten til enkelt å immobilisere småfisk og det faktum at de ikke krever intubering. Derfor har elektrofysiologiske studier fokusert på larvestadier og lite har blitt gjort angående elektrofysiologisk aktivitet i den voksne hjernen. Dette har hindret noen sammenligninger mellom juvenil og voksen nevrologiske aktiviteten skal gjøres. Bruken av multitube intubasjon system gjør det mulig for enkel innføring av en rekke forbindelser til fisken. Dette gir også mulighet for effekten av ulike kjemikalier eller medikamenter for å bli studert innenfor både larver og voksen systemer.
nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. Intubation kanyle. Fjern en 1,5 cm seksjon fra den brede enden av et gult P-200 pipetteman spissen (A). Sett inn en 6 cm x 1 mm stykke rør (pil) i en Luer Lock redusere kontakten (B) og sett denne kanyle i den modifiserte pipettespissen. Hold pipettespissen i stilling med Luer-lås ved hjelp av en kort del av ⅛ i rør (C).
Figur 2. Ferdig intubasjon basen oppsett. Når Gulf Wax er avkjølt, plassere kanylen oppsettet i det minste hullet av intubation sokkelen (A). Tvinn en 1 i bred stripe av 42 cm Kimwipe inn i en tett spiral og sett den inn i avløpsrøret slik at Kimwipe strekker seg på begge ender. Sett den ene ende av avløpsrøret inn i det store hullet i petriskålen (B), slik at den nedre ende for å strekke seg inn i en 30 mm x 100 mm krystallisasjon fatet (ikke vis). Plasser vevet slik at den ene ende vil ligge i nærheten av dyrets mage-området (skissert med svart-prikket linje), og den nedre forlengelse kan dryppe ned i fatet.
Figur 3. Kraniotomi. Under disseksjon mikroskopet, bruker Vanna våren saks for å fjerne ~ 2 mm 2-delen av kraniet som dekker den optiske Tectum. Dette området ser ut som en mørk, trapesformet benete plate som erdens bak øyet. Den stiplede sirkelen avgrenser hvor craniotomy er plassert. Den pilhode viser der nålen til den primære elektrode er anordnet inne i hullet av kraniotomi. Den primære elektrode består av en 2.5 i i 0.010 i sølvtråd som er blitt galvanisert med kloridioner og settes inn i en borsilikat kapillær nål. Den kapillære nålen er fylt med 2-3 pl av 2 M kaliumklorid, eller tilstrekkelig til delvis dekning av den klorid-belagt spissen av sølvtråd. Den sekundære elektrode består av et 15 i snitt av den samme tråden som brukes for den primære elektrode, bortsett fra at en spiss er loddet i den ene enden, slik at den kan settes inn i baksiden av hode-fasen. Den ende av den sekundære ledning som skal plasseres berører fisken må også være galvanisert med kloridioner. Pilen viser hvor den sekundære elektrode er blitt plassert inne i høyre nesebor av voksen fisk.
Figur 4. Oppsett for samling av elektrofysiologisk aktivitet Den intakte intubasjon oppsett beveges. Den elektromikroskop, og kanylen er koblet til perfusjon system (A). Systemet vann må være slått på, slik at perfusjon å starte umiddelbart. Ved hjelp av mikromanipulator, plassere sekundærelektrode (B), slik at elektrodespissen føres inn i dyrets neseboret, eller inn i dip bak den øvre kjeve (pil). Før den primære elektrode nål (C) inn i kraniotomi åpningen. Sett nålen slik at den er plassert ganske overfladisk innen syns Tectum. Den store avløpsrøret (D) strekker seg fra intubasjon fatet, ut av synsfeltet, og den andre enden munner ut i tHan samling fatet.
Figur 5. Elektrofysiologiske opptak innenfor syns Tectum. (A) Det ble konsekvent observert at den opprinnelige aktiviteten innenfor syns Tectum av den voksne sebrafisk er stereotypisk spontan, viser liten amplitude (2-10 mV) aktivitet under hele innspillingen. (B) Etter innføring av 15 mM PTZ til systemet, begynte spontant epileptiske liknende utladninger til å utvikle ca 5 min etter innledning. Denne aktiviteten var i utgangspunktet kort, liten amplitude. Med fortsatt eksponering for PTZ, et konsistent mønster av stor amplitude (opp til 15 mV) utslipp utviklet som ble etterfulgt av mindre, mer hyppige utbrudd av aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH / ninds Grant R01NS070159 (til TMD, JDL og ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M.
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
