Summary
Эта статья описывает, как взрослый данио может быть иммобилизован, интубировали, и используется для в естественных условиях электрофизиологических экспериментов, чтобы записи и манипуляции нейронной активности в интактного животного.
Abstract
Ранее электрофизиологические исследования в взрослых данио были ограничены нарезать препаратов или в глаз чашки препаратов и electrorentinogram записей. Эта статья описывает, как взрослый данио может быть иммобилизован, интубировали, и используется для в естественных условиях электрофизиологических экспериментов, позволяя запись нейронной активности. Иммобилизация взрослого необходим механизм для доставки растворенного кислорода в жабры вместо щечной и оперкулярной движения. С нашей техникой, животные обездвижены и перфузии водой обитания выполнить это требование. Краниотомия выполняется под Tricaine метансульфонат (MS-222; Tricaine) анестезии, чтобы обеспечить доступ к мозгу. Основной электрод затем устанавливают в пределах окна краниотомии записывать внеклеточную активность мозга. Благодаря использованию многотрубного перфузии системы, множество фармакологических соединений могут быть введены в взрослых рыб и любых изменений в нейронной активностиможно наблюдать. Методология позволяет не только для наблюдений, которые будут сделаны в отношении изменений в неврологическом деятельности, но она также позволяет проводить сравнения между личинок и взрослых данио. Это дает исследователям возможность определить изменения в неврологической деятельности в связи с введением различных соединений на разных этапах жизни.
Introduction
В этой статье, протокол описан для получения в естественных условиях записи нейронной активности в взрослых данио. Внеклеточные методов записи используются, обеспечивая измерения напряжения электрической активности в пределах небольшого региона нервной ткани. Этот метод исследования включает мониторинг большое количество клеток в животное ведет себя 1. Ранее ломтик записи были выполнены в обоих взрослых особей и личинок, а у глаз чашки препараты и электроретинограммы записи. Эти эксперименты были в значительной степени выполнены, чтобы подробно физиологические реакции различных сенсорных систем 2-5. До недавнего времени, неповрежденные препараты мозга не были доступны только для выполнения электрофизиологии с данио личинки 3,6,7, где дыхание и кислород диффузии может произойти через кожу. Наша подготовка позволяет родной неврологическое деятельность взрослого рыбок данио измерять в то время как животное остается в полном сознании и в курсе ое его окрестности.
Данио рерио (Danio рерио) в настоящее время играют фундаментальную роль в качестве модели для генетических, токсикологических, фармакологических и физиологических и патологических исследований 3. Данио рерио получили видимость в пределах области неврологии, потому что они разделяют обширные гомологию с млекопитающих на генетическом, нервных и эндокринных уровнях 8. За последние десять лет, стандартные Нейроанатомические и иммуногистохимические методы были использованы для определения подробная характеристика организации данио нервной системы 9-12 и распределения различных нейромедиаторов 3,8,13. Совсем недавно исследователи сосредоточили свое внимание на функциональных исследований 14,15, многие из которых центре на поведенческие процессы 16-19 и электрофизиологических характеристик сенсорных систем 2,13,20. Небольшое количество этих исследований были сосредоточены на электрической активности определенных областях Adulт данио мозг 21-23, но не были проведены с использованием естественных условиях подход.
Этот протокол может быть адаптирован для электрофизиологических исследований как спонтанной и вызванной активности в рамках данио нервной системы, чтобы описать закономерности деятельности в конкретных областях мозга. Использование этой техники позволяет проводить сравнения между неврологической активности молодых личиночной стадии и взрослых. Кроме того, наш протокол позволяет сравнение между генетическими или фармакологических изменений. Вместе с другими подходами, такими как генная инженерия или фармакологических тестов, этот метод предлагает новые возможности для функционального анализа нейронной связи и пластичности в неповрежденной взрослого животного, а также для потенциальных приложений, таких как изучение поздним началом эпилепсии или нейродегенеративных процессов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в строгом соответствии с Национальными Институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и последовал протокол # A2011 09-003, который был рассмотрен, утвержден и наблюдал Университет Грузии Уходу за животными и использованию Комитет.
1. Подготовка оборудования
- Перфузии система для трепанации черепа
Иммобилизация взрослого делает необходимым интубации систему выделения растворенного кислорода к рыбе. Разнообразные системы могут быть использованы, но простой гравитации систему, состоящую из 60 мл шприц используется. Поднимают голову давления на высоту, которая последовательно дает скорость потока ~ 1 мл / мин. Этот шприц может быть помещен в серии с шприцев, которые затем используются для электрофизиологического системы перфузии.- Получить один 60 мл Луер блокировки шприца трубку и снимите поршень.
- Приостановить шприц примерно 8 в &# 160; над основанием кольцевом стенде с помощью зажима.
- Подключите один конец кран на конце шприца. К противоположному концу краном, подключить кусок трубы, диаметром 2 мм, который достаточно долго, чтобы распространить на интубации базы.
- Перфузии система для электрофизиологии
Для электрофизиологических экспериментов, часто бывает необходимо ввести разнообразные соединения в ходе эксперимента. Разнообразные системы доступны, но сила тяжести систему, состоящую из 60 мл шприцев в серии могут быть использованы. Эта установка позволяет легко, серийный внедрения решений, которые будут осуществляться, открыв соответствующий кран.- Получить два или более 60 мл Luer блокировки шприцы и снимите поршни от каждого. Один шприц требуется вводить воду обитания для рыбы в то время как каждый последующий трубка может использоваться для введения различных фармакологических соединений к рыбе.
- Подключите каждый шприц к 3 -ходовой кран с подключением Luer.
- Используйте ⅛ внешним диаметром (OD) трубки для подключения шприцы в серии с мужским замком Luer на одном конце.
- Безопасность устройства таким образом, что головка давление повышено до высоты 27 в над основанием, или высоте, что последовательно приводит к скорости потока ~ 1 мл / мин.
- Интубации канюли
Интубации канюли облегчает введение жидкости к рыбе. Эта установка обеспечивает гибкость и стойкость к лучшем положении канюли в рот животного.- Использование какого-либо общего ножницы (например. Fiskars) или лезвие бритвы, удаления 1,5 см раздел из широкого конце пипетки Р-200.
- Вставьте 6 см х 1 мм кусок трубы в редукционного клапана с женщиной Luer замка крышки и силиконовой манжеты, т.е. адаптер Tuohy Борст и вставьте эту канюли в модифицированной кончика пипетки. Держите пипетки в положении с Luer лОка с использованием короткого часть ⅛ в трубах диаметром.
Рисунок 1
- Интубации база
Это блюдо используется для хранения иммобилизованного животное в стабильной, вертикальном положении и для облегчения удаления жидкости, поступающей в животное через интубации. Если это не установлено правильно, объединение может произойти, ведущих к интрузивных колебательных сигналов в электрофизиологические записи.- Получить базовый блюдо 100 мм х 15 мм пластиковой чашке Петри.
- Используя инструмент для пайки, расплавления отверстие, диаметром 6 мм и 7,5 мм ниже кромки обода, в стороне блюдо. Используя тот же инструмент, растопить отверстие, диаметром 10 мм и 11 мм ниже кромки тарелки ~ 74 ° против часовой стрелки от Меньшее отверстие. Это отверстие будет служить дренажное отверстие.
- Вставьте трубку, диаметром 1 см, в отверстие с конца поднял так, чтобы конец не может быть заблокирован. Затем вставьте наконечник P-200 Pipetteman в маленькое отверстие, это послужит фиктивной канюли.
- С чашку Петри слегка повышенной на стороне большее отверстие, заливают расплавленный воск консервную в чашку таким образом, что отверстие канюли просто покрыты. Область будет служить в качестве упора, позволяя канюлю для введения ~ 3 мм в рот рыбы. Этот набор до должно быть позволено затвердеть.
- Использование пламени нагревают металлическую кромку, вырезать канал удерживать рыбу таким образом, что канал начинается от кончика канюли и проходит приблизительно 1-2 дюйма
- Внимание должно быть принято для того, чтобы непрерывная вниз угол из района канюли в дренажную порта формируется.065fig2.jpg "ширина =" 400px "/>
Рисунок 2
- Внимание должно быть принято для того, чтобы непрерывная вниз угол из района канюли в дренажную порта формируется.065fig2.jpg "ширина =" 400px "/>
- Настройка перфузии
- Прежде чем начать, промойте перфузии наборы параметров с водой среды обитания, гарантируя, что все пузырьки воздуха удаляются.
- Добавить ~ 30 мл 0,016% (630 мкм) Tricaine решение установки краниотомия перфузии и позволить ~ 2 мл проходить через трубки, чтобы обеспечить Tricaine будет доставлен животного на перфузии инициации. См. шаг 2.2 для разбавления.
- Для основной настройке перфузии, добавить ~ 50 мл воды обитания в первой трубы. Добавить любые желаемые экспериментальных соединений в каждой из остальных труб.
- Поместите установки канюли в небольшое отверстие в интубации базы.
- Крутить 1 в широкой полосе 42 см Kimwipe в тугую спираль и вставить его в дренажную трубку так, что Kimwipe простирается на обоих концах. Эта ткань будет служить в качестве фитиля, чтобы удалить перфузии жидкости и предотвратить накопление жидкости в пределах тон интубации базу, которая может помешать электрофизиологические записи.
- Вставьте один конец трубки в большое отверстие чашки Петри, что позволяет нижний конец для расширения в инертном блюдо, достаточно большой, чтобы собрать все перфузии отходов. Это блюдо будет служить оттока резервуара для установки. Расположите ткань так, чтобы один конец будет лежать рядом с области живота животного, а нижний расширение может капать в блюдо.
- Поместите заполненную интубации базу вблизи вскрытии микроскопом. Подключите замок Luer канюли с трубкой Tricaine перфузии.
- Капиллярной иглы и электроды
- Получить первичный электрод, состоящий из 2,5 в из 0,010 в серебряной проволоки и вторичного электрода, который должен состоять из 15 в той же проволоки заземлить установку. Для вторичного электрода, использовать 15 в разделе 0,010 в серебряной проволоки с пайкой наконечником, что позволяет ему соответствоватьв задней части головы этапе.
- Гальванических кончики обоих первичных и вторичных серебряных проволок с хлорид-ионов.
- Использование микропипетки съемник, потяните тонкостенный, боросиликатного капиллярную иглу с сопротивлением <15 мОм.
- Заполните капиллярную иглу с 2-3 мкл 2 М хлорида калия или достаточно, чтобы частично покрыть наконечник хлорида покрытием из серебряной проволоки.
- Вставьте основную электрод в капиллярную головы и смонтировать его в держатель электрода.
- Установите головной сцену в микроманипулятора и затем смонтировать вторичный электрод во второй микроманипулятора. С установки, первая позиция каждого электрода, а затем установите пайку кончик среднего электрода в задней части головы этапе.
- Получить первичный электрод, состоящий из 2,5 в из 0,010 в серебряной проволоки и вторичного электрода, который должен состоять из 15 в той же проволоки заземлить установку. Для вторичного электрода, использовать 15 в разделе 0,010 в серебряной проволоки с пайкой наконечником, что позволяет ему соответствоватьв задней части головы этапе.
2. Приготовление растворов, перфузии система, и электрофизиологические записи Оборудование
- Получение 1 л воды обитанияот аквариума рыбы.
- 0,016% T] Tricaine метансульфонат (Tricaine) (50 мл 630 мкМ) 24.
- Оттепель аликвоту 0,4% Трис-буферном Tricaine, рН 7,2.
- Добавить 2,1 мл 0,4% Трис-буферном Tricaine 47,9 мл воды обитания и перемешать.
- Оттепель концентрацию акций желаемого водорастворимой экспериментальной соединения (например, 300 мМ пентилентетразола, общий chemoconvulsant).
- Оттаять аликвоты 1 мкг / мкл панкурони метила в растворе Рингера.
- Заполните как обезболивающее и экспериментальные системы интубации с водой среды обитания и слейте по крайней мере, достаточно, чтобы удалить все пузырьки из труб. Это должно быть сделано, потому что пузырьки препятствуют потока жидкости, что приводит к удушению животного.
- Полностью слейте перфузии трубки, которые будут содержать наркотики, не позволяя воздух в соединительный трубопровод.
- Заполните обезболивающим трубку с 0,016% (630 мкм) Tricaine решения и размещать любую EXPERментальных соединение (я) в дополнительной трубки (ов) на экспериментальной системы перфузии.
- Первый тюбик экспериментальной перфузии должен содержать только среды обитания воды.
- Смочите небольшой пор губку обитания водой и поставьте в пустой 60 мм х 15 мм чашки Петри. Это блюдо будет использоваться для хранения рыбы в то время как анестетик вводится.
3. Краниотомия
- Добавить достаточное количество раствора Tricaine 630 мкМ в 15 х 60 мм чашки Петри, чтобы заполнить его около трех четверти пути. Взвесить наполненный блюдо. Это будет использоваться для иммобилизации животных так, что дальнейшие анестезия может быть вводили внутрибрюшинно.
- Погрузите животное в чашку, содержащую Tricaine и взвесить блюдо снова.
- Вычтите разницу между весом от шагов 1 и 2, чтобы получить вес рыбы.
- Разрешить животное не оставаться в Tricaine решения пока спокойно и наиболее движение прекратилось.
- Используя пару широких щипцов, передавать рыбу на предварительно смоченные губку и поместите ее в сторону. Передача рыбу за хвост хорошо работает для этого процесса.
- Поместите губку и рыбу под микроскопом рассекает.
- С помощью шприца Nanofil, содержащей 34 G иглу, отмерить достаточно бромида панкурони таким образом, что есть 1 мкг / г веса рыбы.
- Использование эскимо палку вдоль спинной стороны рыбы, чтобы держать ее ровно, администрирования панкурония бромид внутрибрюшинно, используя шприц Nanofil.
- Используя тонкий пинцет, захватить рыбу на нижней челюсти и быстро передавать животное в интубации базы.
- Поместите животное так, чтобы она спинной вверх на виде воска и таким образом, что 1 мм канюли может быть вставлена в рот. Используйте тонкий пинцет для маневра рыбу и открыть рот вокруг канюли. Благодаря составе интубации лоток, остановка была спроектирована в базу, что позволяетканюли для вставки 3 мм в рот рыбы.
- После того, как в положении, включите самотечных перфузии пробирку, содержащую Tricaine.
- Вырежьте секцию Kimqipe ткани 3 см 2 и влажный его водой среды обитания.
- Поместите ткань над животным, чтобы предотвратить высыхание. Секция Kimwipe также может быть расположен, чтобы помочь в проведении животных спинной вверх.
- Под микроскопом рассечение, использовать VANNA весенние ножницы для удаления ~ 2 мм 2 часть черепа, охватывающей тектуме. Эта область выглядит темной, костлявой пластины, которая сидит позади глаза.
Рисунок 3- Вставьте один лезвие ножниц VANNA на край тарелки и нажмите с силой, достаточной для проникновеният.е кость, без пирсинга мозг. Закройте ножницы, чтобы отрезать кость.
- Извлеките часть кости.
- Если кровь присутствует, удалить с помощью край Kimwipe. Кровотечение обычно останавливается вскоре после проведения трепанации черепа.
4. Электрофизиологии
- Выключите интубации стоп-кран и быстро отключить блокировку Luer соединяющий интубации базу в Tricaine капельно.
- Перемещение нетронутыми установку интубации к электрофизиологии микроскопом и подключиться к системе перфузии.
- Включите обитания воды и заливать в размере 1 мл / мин в течение ~ 1 часа, для того, чтобы смыть Tricaine.
- Использование микроманипулятора под визуальным контролем, поместите вторичный электрод так, чтобы кончик электрода может быть вставлен в ноздрю животного или в провал за верхней челюсти.
- Вставьте основную электрода иглу в отверстие краниотомии. Вставьтеиглу в ткани таким образом, что его конец находится в пределах довольно поверхностный тектуме.
- Если электрод слишком глубоко, электрический сигнал может быть небольшой.
- Сбор и анализ электрического разницу записанный между первичными и вторичными электродов. Этот процесс позволит внеклеточных записей, которые будут получены.
- Сбор данных в Gap без режиме с частотой дискретизации 5 кГц, с фильтра нижних частот 0,1 кГц и фильтр высоких частот 1 Гц.
- Не начать запись электрофизиологические деятельность пока вода обитания не перфузии в течение как минимум 45 мин.
- Запись базовую родной активности, по крайней мере, 15 мин перед добавлением экспериментальных лекарственных средств. Начало перфузии с экспериментальными препаратов выбора и записи для требуемого периода времени. У здоровых препаратов, можно записать неврологическое активность в течение 2-3 часов.
5. Убирать
- Усыпить животное по передозировки наркотиков с использованием Tricaine в соответствии с принятой практикой, как это изложено Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации (АВМА) Руководящие принципы для эвтаназии животных (2013 г.).
- Данио рерио быть умерщвлены должны быть помещены в Tricaine растворе при 200-500 мг / л Рыбы, чтобы их оставили в растворе в течение как минимум 10 мин после прекращения ритмической оперкулярной деятельности, после чего они подвергаются физических средств эвтаназии (шейки пересечение), чтобы обеспечить смерть.
- Запустите DI воды через все пробирки и собрать для надлежащей утилизации, если опасные.
- Оставьте запорные краны для каждой трубки в открытом положении для облегчения сушки на воздухе.
- Замочите электроды в 70% этаноле и дайте высохнуть на воздухе.
- Очистите каждый кусок с 70% этанола и дайте высохнуть на воздухе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был использован для измерения нейронной активности взрослых данио в естественных условиях. Эти электрофизиологические записи последовательно и воспроизводимо получена. 5 показан типичный пример родных и индуцированных изменений нейронной активности взрослого рыбок данио, когда пентилентетразола (PTZ), общий chemoconvulsant 6,7,25,26, вводится в интубации настройки.
Уроженец неврологическое деятельность взрослых данио контролировали для каждого эксперимента (рис. 5А). Было последовательно отметил, что эта деятельность является спонтанным и небольшие по амплитуде в течение срока записи. После введения 15 мМ PTZ к системе, спонтанные припадки, как разряды стали развиваться около 5 мин. после введения. Эта деятельность была изначально кратко, малая амплитуда и произошло часто, подобно тому, что наблюдалось в личиночной гebrafish 6,7. При постоянном воздействии на PTZ, постоянной практики крупных сбросов амплитудных развитых, которые были затем меньшие, более частые всплески активности и последующего периода затишья (Рисунок 5В).
Этот метод был успешно использован для введения других chemoconvulsants через систему интубации. С помощью этих соединений, изменения в родном неврологической активности были также эффективно вызывали. Пентилентетразола был использован здесь в качестве примера надлежащей его способности надежно изменить родной нейронной активности у рыбок данио в стереотипной манере.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол был использован для измерения нейронной активности взрослых данио в естественных условиях. С практикой, нейронная активность можно наблюдать последовательно, хотя характеристики (амплитуды и формы событий) из записанного деятельности может варьироваться от отдельных рыб. Использование внеклеточной техники записи может объяснить это наблюдение. Способ обеспечивает одновременный мониторинг большого количества клеток в области 1, так что вариации в позиционировании первичного электрода могут играть определенную роль в наблюдаемом активности. Глубина первичной электрода также изменяет область измеряемого. Если кончик электрода находится слишком глубоко в регионе, наблюдаемый сигнал будет меньше, чем ожидалось, и изменения в деятельности будет труднее наблюдать, если это происходит, просто отступить первичный электрод так, чтобы кончик сидит более поверхностно . Обратите внимание, что это характерно для тектуме и не бытьан рассматривать в глубине и в других областях мозга. Однако, эта процедура может быть проведена в другой области головного мозга. Если наблюдается нервная активность снижается до базового уровня в ходе эксперимента, и неясно, если рыба все еще жив, снять электроды из черепа и проверить, если есть еще кровоток по всему животного. Это может быть проверено путем наблюдения крупных судов в губе или носовой области рыбы. Кровоток можно легко увидеть в этих регионах. Если электроды удаляются для проверки кровотока в середине записи, когда репозиционирование электроды, они будут в несколько ином месте, чем они были изначально, отрицая возможность непосредственно сравнить эту часть записи в исходного основного .
Перед началом этой процедуры, необходимо обеспечить что интубации трубки, а также перфузии трубки как для трепанации черепа и электрофизиологии установок являютсябез каких-либо пузырьков. Если пузырьки собираем, они могут быть запущены из системы, открыв кран и позволяя некоторые из среды обитания воды, чтобы пробежать. Если это не снимает проблему, небольшой шприц может быть прикреплен к концу трубы, где канюли будет помещен, и свет всасывающий применяется для удаления остатков воздуха внутри системы. Для удаления стойких пузырьков, вода обитания может быть принужден через трубопровод. Кроме того, убедитесь, что перфузии трубки загрунтовать и капает до интубации рыбу. Если скорость потока ~ 1 мл / мин не получено, высота напора может быть изменена, чтобы достичь этого. Это будет гарантировать, что рыба имеет доступ к достаточному количеству потока воды. Когда установка электрофизиологии перфузии установки с многочисленными труб в серии, было установлено, что заняло приблизительно ~ 1 мин для нового решения, которые будут введены в организм животного, хотя соответствующие изменения в записанном неврологического деятельности зависели от составного Бейнг введены. Он сообщил, что этот расход измеряется до проведения каких-либо экспериментов. Предыдущая работа показала, что Tricaine может ослаблять нервную деятельность, требуя, чтобы он был удален из системы для того, чтобы получить точные записи 27,28. Через предыдущей работы было определено, что период 45-60 мин интубации с водой среды обитания необходимо промыть Tricaine и для нервной деятельности для достижения собственных уровней. Аналогичным образом, вымывание пентилентетразола проводили также, и было установлено, что в течение 20 мин требовалось, чтобы вернуться нейронной активности к исходному уровню. Таким образом, экспериментаторы должен завершить испытания для определения времени вымывания для каждого соединения интереса внедряются в систему.
Эта техника требует некоторой практики. При проведении трепанации черепа, особую осторожность должны быть приняты для того, чтобы небольшая область костной пластины, закрывающей голову может быть проколот и удаляются, не повреждаямозг. Это может быть сделано путем введения ножницы VANNA под острым углом по отношению к голове. Костная площадь покрытия тектуме имеет слияния недалеко от центра, которые слабы и послужить хорошим точки входа для ножниц. После небольшого перерыва было сделано в тарелке, обрежьте ножницами небольшую площадь кости, и удалить с помощью пинцета. Младший рыбы часто имеют более мягкие, более податливыми черепов, поэтому рыба, которые в возрасте 1 года или менее, которые рекомендуется использовать во время обучения эту технику. Иногда кровь начнет собирать вокруг области краниотомии, но это может быть удалена посредством легкого в Kimwipe осторожно вокруг области. С помощью этой процедуры, краниотомия очень мала, будучи около 2 мм 2 в площади. В связи с этим небольшие размеры, высыхание черепной области не произошло. Однако, если краниотомия больше по размеру, можно применить агар или некоторый другой материал, чтобы предотвратить потерю влаги из мозга, если это стать проБлем.
Достопримечательность является использование бромида панкурони. Это химическое вещество хранили в аликвотах по 10 мкл в целях предотвращения повторного замораживания и оттаивания. Предлагаемый объем, который будет использоваться в эксперименте, будучи 1 мкл на грамм веса, как правило, достаточно для иммобилизации взрослую рыбу. В некоторых случаях, однако, этот объем не является адекватным. Когда это происходит, и паралич не получено, более панкурониум бромид можно вводить внутрибрюшинно к рыбе тех пор, пока запись не началась. При проведении инъекции, не пытайтесь вводить через трудные побочных масштабах; вводить рыбу в более мягкой области живота, рядом с вентиляционным отверстием. Если рыба начинает двигаться, как только первичный электрод был расположен, есть хороший шанс, что игла была прервана в трепанации черепа, и процедуру необходимо повторить с использованием нового животного. Благодаря этой работе было определено, что панкурониум бромид может уменьшить записанного нервныедеятельность в личиночной данио (≤ 50% от базовой амплитуды) и предполагается, что то же самое справедливо и для взрослых. Тем не менее, в недавнем опыте, нейронная активность в организме взрослого человека достаточно надежна, что любые увлажняющие эффекты, приписываемые бромида панкурони, кажется, не отрицательно повлиять на способность сбора и анализа данных. В противоположность этому, смешивает, связанные с движением могут быть значительными. Для этой процедуры, польза от полной неподвижности животного имеет значение за пределами этого ограничения и нервные изменения, которые вводятся достаточно надежны, сохранится вне любых увлажняющих эффектов. Кроме того, любое движение от животного может сместить электрод, регистрируется записывающего оборудования электрофизиологии и, возможно, поставить под угрозу животное.
Ограничения этого метода в первую очередь заключаются в том, что внеклеточный записи является единственным возможным способом записи неврологическое деятельность в неповрежденной взрослых данио. При позиционировании прима ры электрод, игла должна быть вставлена в краниотомии, предотвращая один видеть точно, где электрод размещаемых. Хотя, с практикой, можно расположить электрод в пределах той же самой области и на той же глубине последовательно.
В естественных электрофизиологических в значительной степени ограничивается данио личинки. Это связано с возможностью легко иммобилизации мелкую рыбу и тот факт, что они не требуют интубации. Таким образом, электрофизиологические исследования были сосредоточены на личиночной стадии и мало что было сделано в отношении электрофизиологических деятельности в взрослом мозге. Это предотвратило любые сравнения между несовершеннолетним и взрослым неврологического деятельности, которые будут сделаны. Использование системы многотрубного интубации позволяет для легкого введения различных соединений к рыбе. Это также позволяет влияния различных химических веществ или лекарств, которые будут изучены в рамках обоих взрослой и личиночной систем.
нт "FO: держать-together.within-странице =" всегда ">
Рисунок 1. Интубации Канюля. Удалить 1,5 см раздел с от широкого конца желтой P-200 Pipetteman наконечником (A). Вставьте 6 см х 1 мм кусок трубы (стрелка) в Luer Блокировка уменьшая разъем (B) и вставьте эту канюли в модифицированной кончика пипетки. Удерживая наконечник пипетки в положении с замком Luer с помощью короткого часть ⅛ в трубке (С).
Рисунок 2. Готовые базовую настройку интубации. После залива Воск остынет, поместите установку канюли в меньший отверстие междунарubation база (А). Крутить 1 в широкой полосе 42 см Kimwipe в тугую спираль и вставить его в дренажную трубку так, что Kimwipe простирается на обоих концах. Вставьте один конец дренажной трубки в большое отверстие чашки Петри (B), что позволяет нижний конец расширить в 30 мм х 100 мм кристаллизующейся блюдо (не в режиме). Расположите ткань так, чтобы один конец будет лежать рядом с области живота животного (обведены черным пунктирной линией), а нижний расширение может капать в блюдо.
Рисунок 3. Краниотомия. Под микроскопом рассечение, использовать VANNA весенние ножницы для удаления ~ 2 мм 2 часть черепа, охватывающей тектуме. Эта область выглядит темной, трапециевидной костной пластинки, что Sего позади глаз. Пунктирный круг разграничивает где трепанация черепа позиционируется. Стрелка показывает, что игла первичного электрода расположена внутри отверстия краниотомии. Основной электрод состоит из 2,5 в разделе 0,010 в серебряной проволоки, которая была гальваническим с хлорид-ионов и вставленной в боросиликатное капиллярной иглы. Капиллярной иглы заполнена 2-3 мкл 2 М хлорида калия или достаточно, чтобы частично покрыть наконечник хлорида покрытием из серебряной проволоки. Вторичный электрод состоит из 15 в разделе одной и той же проволоки, используемой для основного электрода исключением того, что наконечник припаян на одном конце, что позволяет вставить в задней части головы стадии. В конце вторичного провода, который должен быть расположен касаясь рыбу также должны быть гальваническим с хлорид-ионов. Стрелка показывает, где вторичный электрод был расположен в правую ноздрю взрослого рыбы.
Рисунок 4. Установка для сбора электрофизиологических активности. Нетронутыми установки интубации перемещается в электрофизиологических микроскопом и канюли подсоединен к перфузионной системе (А). Водная система должна быть включена, что позволяет перфузии, чтобы начать немедленно. Использование микроманипулятор, поместите вторичный электрод (В) так, чтобы кончик электрода вставляется в ноздрю животного или в провал за верхней челюсти (стрелка). Вставка первичный игольчатого электрода (С) в отверстие краниотомии. Вставьте иглу так, что она довольно расположенный в поверхностный тектуме. Большая дренажная трубка (D) простирается от интубации блюдо, из поля зрения, а другой конец впадает тон коллекция блюдо.
Рисунок 5. Электрофизиологические записи в пределах тектуме. (A) Было последовательно отметил, что родной деятельность в тектуме взрослого рыбок данио является стереотипно спонтанное, показывая небольшую амплитуду (2-10 мВ) деятельности в течение всего периода записи. (В) После введения 15 мМ PTZ к системе, спонтанные припадки, как разряды стали развиваться приблизительно 5 минут после введения. Эта деятельность была изначально кратко, малая амплитуда. При продолжении контакта с PTZ, постоянной практики большой амплитуды (до 15 мВ) разряды, разработанные, которые были затем меньшие, более частые всплески активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH / NINDS Грант R01NS070159 (в ПРО ТВД, ЛЗЕ и ОВД).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M.
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
