Summary
Detta dokument beskriver hur en vuxen zebrafisk kan immobiliseras, intuberades, och användas för in vivo-elektrofysiologiska experiment för att möjliggöra inspelning och manipulation av neural aktivitet i ett intakt djur.
Abstract
Tidigare har elektrofysiologiska studier i vuxen zebrafisk begränsats att skiva preparat eller till ögon cup förberedelser och electrorentinogram inspelningar. Detta dokument beskriver hur en vuxen zebrafisk kan immobiliseras, intuberade, och som används för in vivo elektrofysiologiska experiment, vilket möjliggör inspelning av neural aktivitet. Immobilisering av den vuxna kräver en mekanism för att ge löst syre till gälarna istället för buckal och opercular rörelse. Med vår teknik, är djuren immobiliserade och perfusion med habitat vatten för att uppfylla detta krav. En kraniotomi utförs under tricaine metansulfonat (MS-222, tricaine) anestesi för att ge tillgång till hjärnan. Den primära elektroden är sedan placerad inuti kraniotomi fönster för att spela in cellulära hjärnaktivitet. Genom att använda ett flerrörs perfusion systemet, kan en mängd olika farmakologiska föreningar administreras till vuxna fiskar och eventuella förändringar i den neurala aktivitetenkan observeras. Metodiken möjliggör inte bara för observationer som skall göras om förändringar i neurologisk aktivitet, men det gör också att jämförelser kan göras mellan larv och vuxen zebrafisk. Detta ger forskarna möjlighet att identifiera förändringar i neurologisk aktivitet på grund av införandet av olika föreningar i olika livsstadier.
Introduction
I den här artikeln, är ett protokoll som beskrivs för att få in vivo-inspelningar av neural aktivitet i vuxen zebrafisk. Extracellulära inspelning metoder används, ger spänningsmätningar av elektrisk aktivitet i en liten region i nervvävnad. Denna undersökningsmetod innebär att man övervakar ett stort antal celler i en beter djur 1. Tidigare har slice inspelningar utförts i både vuxna och larver, som har ögon cup förberedelser och elektroretinogram inspelningar. Dessa experiment har till stor del utförts på detaljer fysiologiska reaktioner av olika sensoriska system 2-5. Fram tills nyligen har intakta hjärnpreparat endast varit tillgänglig för att utföra elektrofysiologi med zebrafisk larv 3,6,7, där andning och syre diffusion kan ske genom huden. Våra förberedelser gör att infödda neurologiska aktiviteten av en vuxen zebrafisk som ska mätas medan djuret fortfarande är vid fullt medvetande och medveten of dess omgivningar.
Zebrafisk (Danio rerio) för närvarande spelar en grundläggande roll som modell för genetiska, toxikologiska, farmakologiska och fysiopatologiska studier 3. Zebrafish har fått synlighet inom området neurovetenskap, eftersom de har uttalad likhet med däggdjur på de genetiska, neurala och endokrina nivåer 8. Under det senaste decenniet har standard neuroanatomic och immunhistokemiska tekniker som använts för att bestämma den detaljerade karakteristiska organisation av zebrafisk nervsystemet 9-12 och av fördelningen av olika signalsubstanser 3,8,13. På senare tid har forskare skiftat sitt fokus på funktionella studier 14,15, av vilka många centrum på beteendeprocesser 16-19 och elektrofysiologiska egenskaper hos sensoriska system 2,13,20. Ett litet antal av dessa studier har inriktats på den elektriska aktiviteten i specifika områden av adult zebrafisk hjärnan 21-23, men hade inte utförts med hjälp av en in vivo-metod.
Detta protokoll kan anpassas för elektrofysiologiska studier av både spontan och framkallad aktivitet inom zebrafisk nervsystemet att beskriva aktivitetsmönster i specifika delar av hjärnan. Användningen av denna teknik tillåter jämförelser mellan den neurologiska aktiviteten av unga larvstadier och vuxna. Vidare tillåter våra protokoll jämförelser mellan genetiska eller farmakologiska förändringar. Tillsammans med andra metoder, till exempel genteknik eller farmakologiska tester, ger denna metod en ny möjlighet för funktionsanalys av neuronal kommunikation och plasticitet i den intakta vuxna djur liksom för potentiella tillämpningar, till exempel att studera sen debut epilepsi eller neurodegenerativa processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer utfördes i strikt enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur och följde protokoll # A2011 09-003, som granskas, godkänns och övervakas av University of Georgia Institutional Animal Care och användning kommitté.
1. Installation av utrustning
- Perfusionssystemet för kraniotomi
Immobilisering av den vuxna nödvändiggör en intubation systemet avge löst syre till fisken. En mängd olika system kan användas, men en enkel gravitation system bestående av en 60 ml spruta används. Höj tryckhöjden till en höjd som konsekvent ger en flödeshastighet av ~ 1 ml / min. Denna spruta kan placeras i serie med de sprutor som sedan används för den elektrofysiologiska perfusionssystemet.- Erhåll en enda 60 ml luer-lockspruta röret och avlägsna kolven.
- Häng sprutan cirka 8 i &# 160, ovanför basen av ett ringstativ med hjälp av en klämma.
- Anslut en enkelriktad kranen till slutet av sprutan. Till den motsatta änden av kranen genom att ansluta en slang, 2 mm i diameter, som är tillräckligt lång för att sträcka sig till intubering bas.
- Perfusion system för elektrofysiologi
För elektrofysiologiska experiment, är det ofta nödvändigt att införa en rad olika föreningar under ett experiment. En mängd olika system finns tillgängliga, men ett tyngdkraftssystem bestående av 60 ml sprutor i serie kan användas. Denna inställning gör det möjligt för enkel, seriella införa lösningar som skall utföras genom att öppna motsvarande kranen.- Skaffa två eller flera 60 ml Luer lock-sprutor och ta bort kolvarna från varje. En spruta är nödvändig för att administrera habitat vatten till fisken medan varje efterföljande rör kan användas för att administrera en mängd olika farmakologiska föreningar för fisken.
- Anslut varje spruta till en 3 -vägskranen med en Luer-anslutning.
- Använd ⅛ i ytterdiameter (OD) slangar för anslutning sprutorna i serie med ett Luer-lås på en ände.
- Säkra anordningen så att tryckhöjden höjs till en höjd av 27 i ovanför basen, eller en höjd som konsekvent ger en flödeshastighet av ~ 1 ml / min.
- Intubationskanyl
Den intuberingskanyl underlättar införandet av fluid till fisken. Denna setup ger både flexibilitet och fasthet till bästa positionen kanylen i djurets mun.- Använda någon allmän sax (t ex. Fiskars) eller ett rakblad, ta en 1,5 cm sektion från den breda änden av en P-200 pipettspetsen.
- Sätt i en 6 cm x 1 mm slang till en reduceringsventil med en kvinnlig Luerlås mössa och silikon hylsa, dvs en Tuohy Borst adapter och sätter denna kanyl i den modifierade pipettspetsen. Håll pipettspetsen i läge med Luer-lock med användning av en kort del av ⅛ i slangen diameter.
Figur 1
- Intubation bas
Denna maträtt används för att hålla den immobiliserade djur i ett stabilt, upprätt läge och för att underlätta avlägsnandet av vätskan som kommer in i djuret via intubation. Om detta inte är etablerad på rätt sätt, kan sammanslagning ske, vilket leder till påträngande vibrationssignaler i den elektrofysiologiska inspelning.- Skaffa basen skålen av en 100 mm x 15 mm plast petriskål.
- Med hjälp av en lödverktyg, smälta ett hål, 6 mm i diameter och 7,5 mm under läppen hos fälgen, in i sidan av skålen. Med användning av samma verktyg, smälta ett hål, 10 mm i diameter och 11 mm under den utskjutande kanten av skålen ~ 74 ° moturs från mindre hålet. Detta hål kommer att fungera som dräneringshålet.
- Sätt i ett rör, 1 cm i diameter, in i hålet med änden lyfts så att änden inte kan blockeras. Sätt sedan en P-200 pipetteman spets i det lilla hålet, detta kommer att fungera som en dummy kanyl.
- Med petriskålens något förhöjda på den sida av det större hålet, häll smält konserv vax i skålen, så att kanylens hål bara är täckt. Regionen kommer att fungera som ett stopp, vilket gör att kanylen ska infogas ~ 3 mm i munnen på fisken. Denna uppsättning upp bör tillåtas stelna.
- Med hjälp av en flamma-heated metall kant, tälja en kanal för att hålla fisken så att kanalen börjar från spetsen av kanylen och sträcker sig ungefär 1-2 tum
- Försiktighet måste vidtas för att säkerställa att en kontinuerlig nedåtriktad vinkel från kanylen området till dräneringsöppningen är bildad.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Figur 2
- Försiktighet måste vidtas för att säkerställa att en kontinuerlig nedåtriktad vinkel från kanylen området till dräneringsöppningen är bildad.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Perfusion inställnings
- Innan du börjar, spola perfusion uppställningar med habitat vatten, se till att alla luftbubblor avlägsnas.
- Lägg till ~ 30 ml av 0,016% (630 uM) tricaine lösning på kraniotomi perfusion setup och tillåta ~ 2 ml för att köra igenom slangen för att säkerställa att tricaine kommer att levereras till djuret vid perfusion inledande. Se steg 2.2 för spädning.
- Till huvud perfusion setup, lägga ~ 50 ml habitat vatten till det första röret. Lägg till önskade experimentella föreningar till var och en av de återstående rören.
- Placera kanyl inställning i det lilla hålet i intubation bas.
- Tvinna en 1 i bred remsa på 42 cm Kimwipe i en tät spiral och sätt in den i dräneringsröret så att Kimwipe sträcker sig på båda ändar. Denna vävnad kommer att fungera som en veke för att avlägsna perfusion vätska och för att förhindra att vätska uppbyggd inom than intubation bas, vilket kan störa elektrofysiologiska inspelning.
- Sätt i en ände av slangen i det stora hålet i petriskålen, så att den nedre änden för att sträcka sig in i en inert maträtt som är tillräckligt stor för att samla in all perfusion avfall. Denna rätt kommer att fungera som utflödet reservoar för installationen. Placera vävnaden så att en ände kommer att ligga i närheten av djurets buk regionen och den undre förlängningen kan droppa in i skålen.
- Placera det ifyllda intubation bas nära dissekera mikroskop. Anslut Luer lock av kanylen till tricaine perfusionsslangen.
- Kapillär nål och elektroder
- Skaffa en primär elektrod bestående av 2,5 i av 0,010 i silvertråd och en sekundär elektrod som ska bestå av 15 i samma tråd för att jorda installationen. För det sekundära elektroden, använda en 15 i sektion av 0,010 i silvertråd med en lödd spets, som gör att den passarpå baksidan av ett huvud-scen.
- Elektroplätera spetsarna av både de primära och sekundära silvertrådar med kloridjoner.
- Med hjälp av en mikropipett avdragare, dra ett tunnväggigt, borosilikatglas kapillär nål med ett motstånd på <15 mQ.
- Fyll kapillär nålen med 2-3 pl 2 M kaliumklorid, eller tillräckligt för att delvis täcka kloridbelagda spets silvertråd.
- Sätt den primära elektroden i kapillären huvudet och montera den i elektrodhållaren.
- Montera huvud-scenen i en mikromanipulator och sedan montera den andra elektroden i en andra mikromanipulator. Med uppbyggnad, första läge varje elektrod och montera sedan lödas spetsen på den sekundära elektroden i bakhuvudet-stadium.
- Skaffa en primär elektrod bestående av 2,5 i av 0,010 i silvertråd och en sekundär elektrod som ska bestå av 15 i samma tråd för att jorda installationen. För det sekundära elektroden, använda en 15 i sektion av 0,010 i silvertråd med en lödd spets, som gör att den passarpå baksidan av ett huvud-scen.
2. Beredning av lösningar, Perfusion System, och Elektroinspelningsutrustning
- Skaffa 1 L av habitat vattenfrån akvariet av fisk.
- 0,016% T] tricaine metansulfonat (tricaine) (50 ml 630 M) 24.
- Tina en alikvot av 0,4% Tris-buffrad tricaine, pH 7,2.
- Lägg till 2,1 ml av 0,4% Tris-buffrad tricaine till 47,9 ml habitat vatten och blanda.
- Tina lager koncentration av önskad vattenlösliga experimentell förening (t ex 300 mM pentylentetrazol, en gemensam chemoconvulsant).
- Tina upp en alikvot av 1 mikrogram / l pankuroniumbromid i Ringers lösning.
- Fyll både anesthetizing och experimentella intubation system med habitat vatten och avlopp åtminstone tillräckligt för att ta bort alla bubblor från rören. Detta måste göras eftersom bubblor hindrar vätskeflöde, vilket leder till kvävning av djuret.
- Helt dränera perfusion rören som kommer att hålla droger utan att låta luften i anslutningsslangen.
- Fyll anesthetizing rör med 0,016% (630 M) tricaine lösning och placera någon expertisimental förening (ar) i ytterligare rör (er) på experimentell perfusionssystemet.
- Den första rör experimentella perfusion ska endast innehålla habitat vatten.
- Fukta små porer svampen med habitat vatten och lägg i en tom 60 mm x 15 mm petriskål. Denna rätt kommer att användas för att hålla fisk medan bedövningsmedlet injiceras.
3. Kraniotomi
- Lägg tillräckligt av 630 mikroM tricaine lösning på en 15 x 60 mm petriskål för att fylla det ungefär tre fjärdedelar av vägen. Väg den fyllda skålen. Detta kommer att användas för att immobilisera djuret så att ytterligare anestesi kan injiceras intraperitonealt.
- Sänk djuret i skålen som innehåller tricaine och väger skålen igen.
- Subtrahera skillnaden mellan vikterna från steg 1 och 2 för att få vikten på fisken.
- Låt djuret att stanna kvar i tricaine lösningen tills lugn och mest rörelse har upphört.
- Med hjälp av ett par breda tång, överför fisken till förfuktade svampen och placera den i sidled. Överföra fisken i svansen fungerar bra för denna process.
- Placera svampen och fisk under dissekera mikroskop.
- Med en Nanofil spruta innehållande en 34 G nål, mäta ut tillräckligt pankuroniumbromid sådan att det finns 1 ug / g av fiskens vikt.
- Med hjälp av en Popsicle pinne längs ryggsidan av fisken för att hålla den stadigt, administrera pankuroniumbromid intraperitonealt använder Nanofil sprutan.
- Med användning av fin pincett, greppa fisken genom att underkäken och snabbt överföra djuret till intubering bas.
- Placera djuret så att den är dorsal-up på vax formen och så att en mm kanylen kan införas i munnen. Använd fin pincett för att manövrera fisk och öppna munnen runt kanylen. På grund av makeup av intubation bricka, var ett stopp engineered in i basen, vilket gör attkanylen som skall införas 3 mm in i munnen på fisken.
- Väl på plats, slå på allvar matad perfusion rör innehållande tricaine.
- Skär en 3 cm 2 avsnitt i Kimqipe vävnad och blöt det med habitat vatten.
- Placera vävnaden över djuret för att förhindra uttorkning. Den Kimwipe sektionen kan också vara placerad för att hjälpa till att hålla djuret dorsal-up.
- Under dissektion mikroskop, använder Vanna våren sax för att ta bort ~ 2 mm 2 delen av kraniet som täcker den optiska tectum. Området ser ut som en mörk, benig platta som sitter bakom ögat.
Figur 3- Sätt i ett blad av Vanna sax vid kanten av plattan och skjuta med tillräcklig kraft för att penetrationste benet, utan att genomborra hjärnan. Stäng saxen för att klippa benet.
- Avlägsna benbit.
- Om något blod är närvarande, ta bort med hjälp av kanten på en Kimwipe. Blödning i allmänhet stannar strax efter att utföra kraniotomi.
4. Elektrofysiologi
- Stäng av intubation stop-kuk och snabbt koppla bort Luer lås ansluter intubation basen till tricaine dropp.
- Flytta intakta intubation inställning till elektromikroskop och ansluta till perfusion systemet.
- Slå på habitat vatten och BEGJUTA med en hastighet av 1 ml / min under ca 1 timme, för att tvätta ur tricaine.
- Med hjälp av en mikromanipulator under visuell kontroll placerar sekundärelektrod, så att elektrodspetsen kan införas i djurets näsborre eller in i dopp bakom den övre käken.
- Sätt den primära elektroden nålen i kraniotomi öppning. Sätt inålen i vävnaden, så att spetsen är placerad tämligen ytlig inom optiken tectum.
- Om elektroden är för djupt, kan den elektriska signalen att vara liten.
- Samla in och analysera den elektriska skillnad som noteras mellan de primära och sekundära referenselektroder. Detta förfarande kommer att möjliggöra cellulära inspelningar som skall erhållas.
- Samla in data i Gap-free-läge på en 5 kHz samplingsfrekvens, med ett lågpassfilter av 0,1 kHz och ett högpassfilter på 1 Hz.
- Börja inte spela in elektrofysiologiska aktivitet tills habitat vatten har perfusion i minst 45 min.
- Spela in en baslinje av infödd aktivitet under minst 15 minuter före tillsats av experimentella droger. Börja perfusion med experimentella droger av val och rekord för önskad tid. Hos friska preparat, är det möjligt att spela in den neurologiska aktiviteten i 2-3 timmar.
5. STÖKA
- Euthanize djuret genom överdos med hjälp tricaine enligt vedertagna metoder, som beskrivs av American Veterinary Medical Association (AVMA) Riktlinjer för eutanasi för djur (2013).
- Zebrafish som skall avlivas bör placeras i en tricaine lösning vid 200-500 mg / L. Fisk är att vara kvar i lösningen i minst 10 minuter efter avslutad rytmisk opercular verksamhet, varefter de utsätts för en fysisk form av dödshjälp (cervikal transektion) för att säkerställa döden.
- Kör DI vatten genom alla rör och samla in för lämplig avfallshantering, om farligt.
- Lämna kranarna för varje rör i det öppna läget för att underlätta lufttorkning.
- Blötelektroderna i 70% etanol och låt lufttorka.
- Rengör varje bit med 70% etanol och låt lufttorka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har använts för att mäta neurala aktiviteten av vuxna zebrafisk in vivo. Dessa elektrofysiologiska inspelningar konsekvent och reproducerbart erhålls. Figur 5 visar ett representativt exempel på inhemska och inducerade förändringar av neural aktivitet av en vuxen zebrafisk när pentylentetrazol (PTZ), en gemensam chemoconvulsant 6,7,25,26, införs i intubation installationen.
Den nativa neurologiska aktiviteten hos den vuxna zebrafisk övervakades för varje experiment (figur 5A). Det observerades genomgående att denna aktivitet är spontan och liten amplitud under varaktigheten på inspelningen. Efter införandet av 15 mM PTZ till systemet, började spontana epileptiforma liknande urladdningar för att utveckla omkring 5 min. efter införandet. Denna verksamhet var från början kort, liten amplitud och uppträdde ofta, liknande det som observeras inom larver zebrafish 6,7. Med fortsatt exponering för PTZ, ett mönster av stora amplitud utsläpp utvecklats som följdes av mindre, mer frekventa skurar av aktivitet och en efterföljande lugn period (Figur 5B).
Denna teknik har med framgång använts för att införa andra chemoconvulsants via intubering systemet. Med dessa föreningar, har förändringar i native neurologisk aktivitet också effektivt kallat. Pentylenetetrazol användes här som ett exempel på grund av den förmåga att kraftigt förändra den infödda neural aktivitet hos zebrafisk på ett stereotypt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll har använts för att mäta neurala aktiviteten av vuxna zebrafisk in vivo. Med lite övning kan neural aktivitet observeras genomgående, även om de egenskaper (amplitud och form av händelser) i inspelade aktivitet kan variera mellan enskilda fiskar. Utnyttjande av den extracellulära inspelningsteknik kan förklara denna observation. Metoden ger samtidig övervakning av ett stort antal celler inom en region 1, så variationer i positioneringen av den primära elektroden kan spela en roll i den observerade aktiviteten. Djup av den primära elektroden ändrar också regionen som mäts. Om spetsen på elektroden är placerad alltför djupt inom en region, kommer den observerade signalen vara mindre än förväntat och förändringar i verksamheten kommer att bli svårare att observera, om detta sker, helt enkelt dra tillbaka den primära elektroden så att spetsen sitter mer ytligt . Noterar att det är kännetecknande för den optiska tectum och har intesv betraktade på djupet i andra regioner av hjärnan. Dock kan detta förfarande utföras inom en annan region av hjärnan. Om den observerade neurala aktiviteten minskar till basnivåer under experimentet och det är osäkert om fisken fortfarande lever, ta bort elektroderna från kraniet och kontrollera om det fortfarande blodflödet i hela djuret. Detta kan kontrolleras genom att observera de stora kärlen i läppen eller nasala området av fisken. Blodflödet kan lätt ses i dessa regioner. Om elektroderna tas bort för att kontrollera blodflödet i mitten av en inspelning, då flytta elektroderna, kommer de att vara i en något annorlunda plats än vad de var från början, att förneka möjligheten att direkt jämföra denna del av inspelningen till den ursprungliga baslinjen .
Innan du påbörjar denna procedur, måste man se till att de intubation rören samt perfusion rören för både kraniotomi och elektrofysiologiska installationer ärfri från bubblor. Om bubblor samlar in, kan de köras ut ur systemet genom att öppna kranen och låta en del av livsmiljön vatten för att köra igenom. Om detta inte eliminera problemet, kan en liten spruta fästas på änden av röret, där kanylen skulle placeras, och lätt sug appliceras för att avlägsna eventuell kvarvarande luft i systemet. För envisa bubblor, kan habitat vatten tvingas genom slangen. Se också till att perfusion rören grundmålas och droppande innan intuberande fisken. Vid en flödeshastighet av ~ 1 ml / min inte erhålls, kan höjden hos tryckhuvudet ändras för att uppnå detta. Detta kommer att säkerställa att fisken har tillgång till tillräcklig vattenflöde. När elektrofysiologi perfusion installationen är installationen med många rör i serie, bestämdes det att det tog ungefär ~ 1 min för den nya lösningen att införas till djuret, även om förändringar av de inspelade neurologiska aktiviteten var beroende av föreningen being introduceras. Det rekommenderas att detta flöde mätas innan utföra några experiment. Tidigare arbete har visat att tricaine kan dämpa neural aktivitet, som kräver att det tas bort från systemet i syfte att erhålla exakta inspelningar 27,28. Genom tidigare arbete, bestämdes det att en period av 45-60 minuter av intubation med habitat vatten behövs för att tvätta ur tricaine och för neural aktivitet för att nå inhemska nivåer. Likaså washout av pentylentetrazol genomfördes också, och det bestämdes att en period av 20 minuter krävdes för att gå tillbaka neural aktivitet till basnivåer. Därför bör experimentatorer slutföra försök för att fastställa spolningstider för varje förening av intresse införs i systemet.
Denna teknik kräver lite övning. Vid utförandet av kraniotomi måste extra försiktighet iakttas för att säkerställa att en liten region i den beniga plattan som täcker huvudet kan punkteras och avlägsnas utan att skadahjärnan. Detta kan göras genom att införa de vanna sax i en spetsig vinkel i förhållande till huvudet. Den beniga område som omfattar den optiska tectum har fusioner nära centrum som är svaga och fungerar som bra ingångar för saxen. När en liten paus har gjorts i plattan, använd sax för att klippa ett litet område på benet, och ta bort med hjälp av ett par fina pincett. Yngre fiskar har ofta mjukare, mer följ kranier, så fisk som är 1 år eller mindre föreslås att användas när man lär sig den här tekniken. Ibland kommer blod att börja samla kring regionen av kraniotomi, men detta kan avlägsnas genom att badda en Kimwipe försiktigt runt området. Med detta förfarande är det kraniotomi mycket liten, är ca 2 mm 2 i området. På grund av denna lilla storlek, har uttorkning av skallen inte inträffat. Om emellertid kraniotomi är större i storlek, är det möjligt att applicera agar eller något annat material för att förhindra fuktförlust från hjärnan, om detta blir en problem.
En punkt av intresse är användningen av pankuroniumbromid. Denna kemiska lagras i alikvoter om 10 | il för att förhindra upprepad frysning och upptining. Den föreslagna volym som skall användas i ett experiment, som är 1 pl per gram i vikt, är vanligen tillräcklig för att immobilisera en vuxen fisk. Ibland är dock denna volym inte är tillräcklig. När detta inträffar och förlamning är inte erhålls, kan mer pankuroniumbromid administreras intraperitonealt till fisken, så länge inspelningen inte har börjat. Vid genomförande av injektionen, försök inte att injicera igenom tuffa sidoskalor, injicera fisken i mjukare buken regionen, nära ventilen. Om fisken börjar röra sig när den primära elektroden har placerats, det finns en god chans att nålen har avbrutits inom kraniotomi, och proceduren måste upprepas med ett nytt djur. Genom detta arbete har det bestämts att pankuroniumbromid kan minska den inspelade neuralaaktivitet i larver zebrafisk (≤ 50% av utgångsvärdet amplitud) och det antas att samma sak gäller för vuxna. Men i den senaste tidens erfarenheter, är det neural aktivitet i vuxen robust nog att eventuella dämpande effekter tillskrivs pankuroniumbromid inte verkar påverka förmågan att samla in och analysera data. I motsats härtill kan blandar ihop i samband med rörelse vara betydande. För denna procedur, är fördelarna med fullständig orörlighet av djuret i värde utöver denna begränsning och de neurala förändringar som införs är tillräckligt robusta för att fortsätta förbi någon dämpande effekt. Dessutom kan någon rörelse från djuret undan elektroden, registreras av den elektrofysiologi färdskrivare och eventuellt äventyra djuret.
Begränsningarna av denna teknik ligger främst i det faktum att cellulära inspelning är det enda möjliga sättet att spela in neurologisk aktivitet i den intakta vuxen zebrafisk. Vid placering av prima ry elektrod måste nålen föras in i kraniotomi, vilket förhindrar en från att se exakt var elektroden läggs. Men, det är med praktik möjligt att placera elektroden inom samma område och vid samma djup konsekvent.
In vivo elektrofysiologi har till stor del begränsats till zebrafisk larver. Detta beror på möjligheten att enkelt immobilisera små fiskar och det faktum att de inte kräver intubation. Därför har elektrofysiologiska studier fokuserat på larvstadierna och lite har gjorts när det gäller elektrofysiologisk aktivitet i den vuxna hjärnan. Detta har förhindrat några jämförelser mellan juvenil och vuxen neurologiska aktiviteten som skall göras. Användningen av flerrörs intubation system medger för enkelt införande av en mängd olika föreningar till fisken. Detta möjliggör också för effekterna av olika kemikalier eller läkemedel som skall studeras inom både larver och vuxna system.
nt "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 1. Intubationskanyl. Ta bort en 1,5 cm sektion från den breda änden av en gul P-200 pipetteman spets (A). Sätt i en 6 cm x 1 mm rörstycke (pil) till en Luer Lock reduceringsstycket (B) och infoga denna kanyl i den modifierade pipettspetsen. Håll pipettspetsen i läge med Luer-låset med hjälp av en kort del av ⅛ i slangen (C).
Figur 2. Färdiga intubation grundinställningar. När Gulf Wax har svalnat, lägg kanylen inställning i det mindre hålet i intubation bas (A). Tvinna en 1 i bred remsa på 42 cm Kimwipe i en tät spiral och sätt in den i dräneringsröret så att Kimwipe sträcker sig på båda ändar. Sätt i en ände av slangen dränering in i det stora hålet i petriskålen (B), så att den nedre änden för att sträcka sig in i en 30 mm x 100 mm kristalliserande skål (ej i vyn). Placera vävnaden så att en ände kommer att ligga i närheten av djurets magtrakten (skisserat med svart-streckad linje) och den undre förlängningen kan droppa in i skålen.
Figur 3. Kraniotomi. Under dissektion mikroskop, använder Vanna våren sax för att ta bort ~ 2 mm 2 delen av kraniet som täcker den optiska tectum. Området ser ut som en mörk, trapets beniga platta som ärdess bakom ögat. Den streckade cirkeln avgränsar där kraniotomi är positionerad. Pilspetsen visar där nålen hos den primära elektroden är placerad inuti hålet hos kraniotomi. Den primära elektroden består av en 2,5 i sektion av 0,010 i silvertråd som har elektropläteras med kloridjoner och infogas i en borsilikat kapillär nål. Den kapillära nålen fylls med 2-3 | il av 2 M kaliumklorid, eller tillräckligt för att delvis täcka den kloridbelagd spets av silvertråd. Den sekundära elektroden består av en 15 i sektion av samma tråd som används för den primära elektroden med undantag av att en spets är lödd vid en ände, så att den kan sättas in i bakhuvudet-stadium. Den ände av den sekundära tråd som skall placeras vidröra fisk måste också elektropläteras med kloridjoner. Pilen visar var den sekundära elektroden har placerats inom höger näsborre av vuxen fisk.
Figur 4. Uppställning för samling av elektrofysiologisk aktivitet. Det intakta intubation installationen förflyttas till det elektromikroskop och kanylen ansluts till perfusions-systemet (A). Systemet vattnet måste vara på, vilket gör perfusion att starta omedelbart. Använda mikromanipulator, positionera den sekundära elektroden (B), så att elektrodens spets är införd i djurets näsborre eller in i dopp bakom den övre klämbacken (pil). Sätt den primära elektroden nålen (C) i kraniotomi öppning. Stick in nålen så att den är placerad ganska ytlig inom optik tectum. Den stora dräneringsröret (D) sträcker sig från den intubation skålen, av synfältet, och den andra änden mynnar ut i tHan samling maträtt.
Figur 5. Elektrofysiologiska inspelningar inom optisk tectum. (A) Det observerades genomgående att den infödda aktivitet inom optiken tectum av den vuxna zebrafisk är stereotypt spontan, visar liten amplitud (2-10 mV) aktivitet under hela inspelningen. (B) Efter införandet av 15 mM PTZ till systemet, började spontana epileptiforma liknande utsläpp utvecklas ca 5 min efter införandet. Denna verksamhet var från början kort, liten amplitud. Med fortsatt exponering för PTZ, ett mönster av stor amplitud (upp till 15 mV) utsläpp utvecklats som följdes av mindre, mer frekventa utbrott av aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH / NINDS Grant R01NS070159 (till TMD, JDL och ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
