Summary
Bu çalışma, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve kayıtları ve bozulmamış bir hayvanda nöral faaliyet işleme izin vermek için in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Abstract
Daha önce, erişkin zebrabalıkları elektrofizyolojik çalışmalar hazırlıklarını veya göz fincan hazırlıkları ve electrorentinogram kayıtları dilim sınırlı olmuştur. Bu çalışma, nöral faaliyet kayıt sağlayan, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Yetişkin immobilizasyonu yanaktan ve operküler hareketinin yerine solungaçları çözülmüş oksijen sağlamak için bir mekanizma gerekmektedir. Bu teknik ile, hayvanların hareketsiz ve bu şartı yerine getirmek için bir habitat su ile perfüze. Kranyotomi tricaine metansülfonat altında gerçekleştirilir (MS-222; tricaine) anestezi beyne erişimi sağlamak için. Birincil elektrod dışı beyin aktivitesini kaydetmek için kraniotomi penceresi içinde konumlandırılmış. Bir Multitube perfüzyon sisteminin kullanımı sayesinde, farmakolojik bileşikler, çeşitli nöral aktivitede yetişkin balık ve herhangi bir değişiklik için uygulanabilirgözlenebilir. Metodoloji nörolojik etkinlik değişiklikler ile ilgili yapılacak gözlemler sağlar değil, aynı karşılaştırmalar larva ve yetişkin zebrabalıkları arasında yapılacak için de izin verir. Bu araştırmacılara nedeniyle farklı yaşam evrelerinde çeşitli bileşiklerin tanıtımı nörolojik aktivite değişiklikleri tanımlamak için yeteneği verir.
Introduction
Bu makalede, bir protokol zebrabalıkları yetişkin nöral faaliyet vivo kayıtları elde etmek için tarif edilmektedir. Ekstrasellüler kayıt yöntemleri nöral doku küçük bir bölge içinde elektriksel aktivitenin gerilim ölçümleri sağlayan kullanılır. Soruşturma Bu yöntem, bir hayvanda davranıyor 1 hücrelerin çok sayıda izleme içerir. Daha önce, dilim kayıtları göz kupası hazırlıkları ve elektroretinogram kayıtları gibi, yetişkin ve larva hem de yapılmıştır. Bu deneyler büyük ölçüde çeşitli duyu sistemlerinin 2-5 fizyolojik tepkiler detay yapılmıştır. Yakın zamana kadar, sağlam beyin preparatlar sadece solunum ve oksijen difüzyon deri yoluyla oluşabilir zebra balığı larvası 3,6,7, elektrofizyoloji ile yerine getirilmesi için mevcut olmuştur. Bizim hazırlık hayvan o tamamen bilinçli ve farkında kalır bir yetişkin zebrafish yerli nörolojik etkinlik ölçülecek sağlarf çevresi.
Zebra balığı (Br.rerio) şu anda, genetik toksikolojik, farmakolojik ve fizyopatolojik çalışmalar 3 için bir model olarak temel bir rol oynamaktadır. Onlar genetik, nöral ve endokrin seviyelerinde 8 memelilerin kapsamlı benzerliği paylaşmak çünkü Zebra nörobilim alanında görünürlük kazanmıştır. Geçtiğimiz on yıl içinde, standart nöroanatomik immünohistokimyasal teknikler ve zebra balığı sinir sistemi 9-12 arasında ve farklı nörotransmitterlerin 3,8,13 dağılımının ayrıntılı karakteristik organizasyon belirlemek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, araştırmacılar davranışsal süreçler 16-19 ve duyu sistemlerinin 2,13,20 elektrofizyolojik özellikleri üzerine ortalamak birçoğu fonksiyonel çalışmalar 14,15, onların odak değiştirdi. Bu çalışmaların az sayıda Adul belirli alanların elektriksel aktivitesi üzerinde yoğunlaşmıştırzebra balığı beyin 21-23 t, ama in vivo yaklaşımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir değildi.
Bu protokol, spesifik beyin bölgelerinde aktivitesinin modellerini açıklamak için Zebrafish sinir sistemi içerisinde, hem kendiliğinden ve uyarılmış aktivite elektrofizyolojik çalışmaları için uyarlanabilir. Bu tekniğin kullanımı, karşılaştırmalar, genç larva ve yetişkinlerin nörolojik aktivitesi arasındaki yapılmasını sağlar. Bundan başka, protokol genetik ya da farmakolojik değişiklikler arasında karşılaştırmalar izin verir. Birlikte bu tür genetik mühendisliği veya farmakolojik testleri gibi diğer yaklaşımlar ile, bu yöntem, geç başlangıçlı, epilepsi ya da nörodejeneratif süreçler üzerinde çalışılması gibi olası uygulamalar için nöronal iletişim ve plastisite sağlam bir yetişkin hayvan hem de fonksiyonel analizi için yeni bir olanak sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberi, Ulusal Enstitüleri ile sıkı göre yapılan ve gözden onaylanmış ve Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Üniversitesi tarafından denetlenecektir protokol # A2011 09-003, takip edildi Komite.
1.. Ekipman Kurulumu
- Kraniotomi için perfüzyon sistemi
Yetişkin immobilizasyon balık çözünmüş oksijen sağlamak için entübasyon sistemi gerektirir. Sistemleri çeşitli kullanılabilir, ancak bir 60 ml şırınganın oluşan basit bir yerçekimi sistemi kullanılır. Sürekli ~ 1 ml / dk 'lık bir akış hızı veren bir yüksekliğe basınç başım yükseltmek. Bu, daha sonra şırınga elektrofizyolojik perfüzyon sistemine için kullanılan şırınga ile seri halde yerleştirilebilir.- Tek bir 60 ml Luer lock şırınga tüpünü alın ve pistonu çıkarın.
- Yaklaşık 8 ve en şırınga Askıda# 160; kelepçeyi kullanarak bir halka-stand tabanı yukarıda.
- Şırınganın ucuna bir tek yollu valf bağlayın. Vana ters amaçla, entübasyon tabanına genişletmek için yeterince uzun olan bir boru parça, çapı 2 mm, bağlayın.
- Elektrofizyoloji için perfüzyon sistemi
Elektrofizyolojik deneyler için, bir deney sırasında çeşitli bileşikler tanıtmak için çoğu zaman gereklidir. Çeşitli sistemler mevcuttur, ancak seri olarak 60 ml şırınga oluşan bir ağırlık sistemi kullanılabilir. Bu kurulum gelen musluğunu açarak yapılacak çözümler basit, seri giriş için izin verir.- Iki veya daha fazla 60 ml Luer lock şırınga elde ve her gelen Plenserleri çıkarın. Bir sonraki her bir şırınga tüp Balıklara farmakolojik çeşitli bileşikler yönetmek için kullanılabilir iken Balıklara yaşam su verilmesi için gereklidir.
- Bir 3'e her şırınga bağlayın -şekilde bir Luer bağlantı nolu kesme vanasına.
- Bir ucunda bir erkek Luer kilidi ile seri bağlamak için şırınga dış çap (OD) boru içinde ⅛ kullanın.
- Basınçlı bir baz içinde 27 üzerinde bir yüksekliğe ya da sürekli ~ 1 ml / dk 'lık bir akış hızı veren bir yüksekliğe kadar yükseltilmiş şekildedir cihazı elde edin.
- Entübasyon kanül
Entübasyon kanül balık sıvının giriş kolaylaştırır. Bu kurulum iyi konumda, hayvanın ağzı içinde kanül esneklik ve sertlik hem de sağlar.- Makas her genel çiftini (örneğin. Fiskars) veya jilet kullanarak, bir P-200 pipet geniş ucundan 1,5 cm bölümü çıkarın.
- Bir Tuohy Borst adaptörü örneğin bir dişi Luer kilit kap ve silikon yüksük ile bir indirgeme valf içine bir boru 6 cm x 1 mm parça yerleştirin ve modifiye edilmiş pipet içine bu kanül yerleştirin. Luer l pozisyonunda pipet tutunçaplı boru içinde ⅛ kısa bir kısmını kullanarak ock.
Şekil 1
- Entübasyon baz
Bu yemek stabil, dik bir konumda hareketsiz tutmak için hayvan ve entübasyon yoluyla hayvan giren sıvının çıkarılmasını kolaylaştırmak için kullanılır. Bu doğru bir şekilde kurulmuş ise, havuzlama elektrofizyolojik kayıt müdahaleci titreşim sinyalleri yol oluşabilir.- Bir 100 mm x 15 mm plastik Petri çanağı taban çanak elde edilir.
- Bir lehim aleti kullanarak, çanağın yan içine bir delik çapı 6 mm ve jantın dudak altında 7.5 mm, erime. Aynı aracı kullanarak, bir delik, 10 mm çapında ve çanak dudak altında 11 mm ~ 74 ° saat yönünün tersine eritebilir küçük delik. Bu delik drenaj deliği olarak görev yapacak.
- Bir tüp takın, ucu deliğin içine 1 cm çapında, uç bloke edilemez şekilde kaldırdı. Sonra küçük deliğe bir P-200 pipetteman ucu takın, bu bir kukla kanül olarak hizmet verecek.
- Hafifçe daha büyük bir deliğin tarafında yükseltilmiş Petri kabı ile, kanül delik sadece kapalı olduğundan bu çanak içine erimiş mum konserve dökün. Bu bölge, kanül balığın ağzına ~ 3 mm eklenir sağlayan bir durak olarak hizmet edecektir. Bu set up katılaşmaya izin verilmelidir.
- Alevle ısıtılan metal kenar kullanarak, kanal kanülün ucundan başlar ve yaklaşık olarak 1-2 inç uzanmaktadır, böylece balık tutmak için bir kanal bölmek
- Dikkat drenaj noktasına kanül alandan sürekli bir aşağıya doğru açı meydana olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Şekil 2,
- Dikkat drenaj noktasına kanül alandan sürekli bir aşağıya doğru açı meydana olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Perfüzyon kurulum
- Başlamadan önce, tüm hava kabarcıkları bertaraf olmasını sağlamak, yaşam su ile perfüzyon set-up yıkayın.
- Kraniotomi perfüzyon kurulum ~ 30 ml 0.016% 'si (630 iM) tricaine çözüm ekleyin ve ~ 2 ml bu tricaine perfüzyon başlaması üzerine hayvana teslim edilecektir sağlamak için boru üzerinden çalışmasına izin. Seyreltme için adım 2.2 bakınız.
- Ana perfüzyon ayarlamak için, ilk tüpe yaşam su ~ 50 ml ekleyin. Kalan tüpler her biri için herhangi bir istenen deney bileşikleri ekleyin.
- Entübasyon tabanının küçük deliğe kanül kurulum yerleştirin.
- Sıkı bir sarmal içine 42 cm Kimwipe'a geniş şerit bir 1 bükün ve Kimwipe'dan iki ucuna uzanacak şekilde drenaj borusuna takın. Bu doku perfüze sıvının çıkması için bir fitil olarak hizmet edecek ve t içindeki sıvı oluşumunu önlemekO elektrofizyolojik kayıt müdahale olabilir ki, tabanı entübasyon.
- Alt ucu tüm perfüzyon atıkları toplamak için yeterince büyük olan bir inert çanak içine uzanan sağlayan, Petri kabı büyük bir delik içine boru bir ucunu. Bu çanak kurulumu için çıkış rezervuar olarak görev yapacak. Bir ucu hayvanın karın bölgesine yakın uzanacaktır, böylece doku yerleştirin ve alt uzantısı çanak içine aktığından.
- Mikroskop yakın bu tamamlanmış entübasyon tabanını yerleştirin. Tricaine perfüzyon tüpünün için kanül Luer kilidi bağlayın.
- Kılcal iğne ve elektrotlar
- Gümüş tel ve kurulumu şasiye aynı tel içinde 15 kadar yapılması gereken bir ikinci elektrot olarak 0,010 içinde 2.5 oluşan bir birinci elektrot elde edilir. İkinci elektrot için, uyum sağlar bir lehim ucu, gümüş tel 0,010 arasında bölümünde bir 15 kullanımıbir baş-sahnenin arkasında.
- Klorür iyonları ile de birinci ve ikinci gümüş tellerin uçlarını elektrolizle.
- Bir mikropipet çektirmenin kullanarak, <15 MQ dirence sahip ince duvarlı, borosilikat kılcal iğneyi çekin.
- 2-3 2 M potasyum klorür ul, ya da kısmen gümüş tel klorit kaplı ucu karşılamak için yeterli olan kılcal iğne doldurun.
- Kılcal kafa içine birincil elektrodu takın ve elektrot tutucu monte.
- Bir micromanipulator içine baş sahne montaj ve daha sonra ikinci bir micromanipulator içine ikincil elektrot montaj. Her elektrot kurulum, ilk pozisyonu ile ve daha sonra baş sahnenin arkasına ikincil elektrot lehimli uç takın.
- Gümüş tel ve kurulumu şasiye aynı tel içinde 15 kadar yapılması gereken bir ikinci elektrot olarak 0,010 içinde 2.5 oluşan bir birinci elektrot elde edilir. İkinci elektrot için, uyum sağlar bir lehim ucu, gümüş tel 0,010 arasında bölümünde bir 15 kullanımıbir baş-sahnenin arkasında.
2. Çözümlerin hazırlanması, Perfüzyon Sistemi ve Elektrofizyolojik Kayıt Cihazları
- Habitat su 1 L edininbalık akvaryum dan.
- 0.016% T] tricaine metansülfonat (tricaine) (630 uM, 50 ml) 24.
- % 0.4 Tris-tamponlu tricaine, pH değeri 7.2 olan bir kısım çözülme.
- Habitat su 47.9 ml% 0.4 Tris tamponlu tricaine 2.1 ml ekleyin ve karıştırın.
- Istenen suda çözünür deneysel bileşiğin (örneğin 300 mM pentilentetrazol, ortak bir chemoconvulsant) stok konsantrasyonu çözülme.
- Ringer çözeltisi içinde 1 mcg / ml panküronyum bromür bir kısım çözülme.
- Anestezi ve habitat su ile deneysel entübasyon sistemlerini doldurun ve tüpler tüm kabarcıkları en azından yeterince boşaltın. Kabarcıklar hayvanın boğulma yol açan, sıvı akışını engellemek için bu yapılmalıdır.
- Tamamen bağlantı boru içine hava izin olmadan ilaç yapacak perfüzyon tüpleri boşaltın.
- 0.016% (630 uM) tricaine çözelti ile anestezi tüpü doldurmak ve herhangi bir yer experDeneysel perfüzyon sistemine ilave borunun (ler) in imental bileşik (ler).
- Deneysel perfüzyon birinci tüp tek yaşam su içermelidir.
- Boş bir 60 mm x 15 mm Petri kabındaki yaşam su ve yer ile küçük gözenek sünger nemlendirin. Anestezik enjekte edilir ise bu çanak balık tutmak için kullanılacaktır.
3. Kraniotomi
- O yol yaklaşık dörtte üçü doldurmak için 15 x 60 mm petri için 630 mcM tricaine çözümün yeterince ekleyin. Doldurulan çanak tartılır. Bundan başka anestezi periton içinden enjekte edilebilir, böylece bu hayvan immobilize etmek için kullanılacaktır.
- Çanak içeren tricaine içine hayvan daldırın ve tekrar çanak tartın.
- Balıkların ağırlığının elde edilmesi için adım 1 ve 2 den ağırlıklar arasındaki fark çıkarın.
- Hayvan sakin ve en hareket bitene kadar tricaine çözelti içinde kalmasını sağlar.
- Geniş bir çift forseps kullanarak, önceden nemlendirilmiş süngere balık transferi ve yanal konumlandırmak. Kuyruk tarafından balık aktarılması, bu süreç için iyi çalışır.
- Mikroskop altında sünger ve balık yerleştirin.
- Bir 34 G iğne içeren bir şırınga ile Nanofil, balık ağırlığının 1 ug / g olduğu şekilde, yeterli pankuronyum bromid ölçer.
- Periton Nanofıl şırınga kullanarak pankuronyum bromür yönetmek, sabit tutmak için balık dorsal kenarı boyunca bir popsicle sopa kullanarak.
- Ince forseps kullanarak, alt çenesi ile balık yakala ve hızlı entübasyon tabanına hayvan aktarın.
- Bu mum formu ve 1 mm kanül ağzına sokulacak şekildedir on dorsal-up, böylece hayvan yerleştirin. Balık manevra ve kanül etrafında ağzını açmak için ince forseps kullanın. Nedeniyle entübasyon tepsinin makyaj, bir durdurma sağlar, taban içine yerleştirilebilir olankanül balık ağzına 3 mm sokulacak.
- Yerleştirildikten sonra, tricaine içeren yerçekimi beslemeli perfüzyon tüp açın.
- Kimqipe bir doku 3 cm 2 bölümünü kesmek ve habitat su ile ıslatın.
- Kurumasını önlemek için hayvan üzerinde doku yerleştirin. Kimwipe bölüm ayrıca, hayvan dorsal-up tutulmasına yardımcı olmak için konumlandırılabilir.
- Diseksiyon mikroskobu altında, optik TECTUM kapsayan kranial ~ 2 mm 2 bölümünü kaldırmak için vanna yaylı makas kullanın. Bu alan gözün arkasında oturur bir karanlık, kemikli tabak gibi görünüyor.
Şekil 3,- Plakanın kenarında vanna makas bir bıçak yerleştirin ve geçirgenliğe karşı yeterli bir güçle itmebeyin piercing olmadan, kemik te. Kemik snip makas kapatın.
- Kemik parçasını çıkarın.
- Herhangi bir kan varsa, bir Kimwipe kenarını kullanarak kaldırın. Genellikle Kanama kısa kraniotomi yürüten sonra durur.
4. Elektrofizyoloji
- Entübasyon stop-horoz kapatın ve hızlı tricaine damla için entübasyon tabanını bağlayan Luer kilit ayırın.
- Elektrofizyoloji mikroskop sağlam entübasyon kurulum Taşı ve perfüzyon sistemine bağlamak.
- Yaşam su açın ve tricaine yıkayın amacıyla, yaklaşık 1 saat boyunca 1 ml / dk 'lık bir hızda serpmek.
- Elektrot ucu hayvanın burun içine ya da üst çene arkasında daldırma içine sokulabilir, böylece görsel kontrol altında bir mikromanipülatör kullanarak, ikinci elektrot yerleştirmek.
- Kraniotomi ağzına birincil elektrot iğne takın. Takınuç optik TECTUM içinde oldukça yüzeysel bir konuma, bu durumda, doku içine iğne.
- Elektrod çok derin ise, elektrik sinyali küçük olabilir.
- Toplayın ve birincil ve ikincil referans elektrotlar arasında kaydedilen elektriksel farkı analiz. Bu işlem, elde edilecek hücre kayıtları için izin verir.
- 0.1 kHz düşük geçiş filtresi ve 1 Hz yüksek geçiş filtresi ile, 5 kHz örnekleme hızında Gap serbest modunda verileri toplayın.
- Yaşam suyu 45 dakika bir az perfüze kadar elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmeye başlar etmeyin.
- Önceki deneysel ilaçların eklenmesinden en az 15 dakika boyunca yerel aktivitesinin bir temel kaydedin. Zaman istenilen miktarda tercih ve kayıt deneysel ilaçlar ile perfüzyon başlayın. Sağlıklı preparasyonlarda, 2-3 saat boyunca, nörolojik etkinlik kaydetmek mümkündür.
5. Temizlemek
- Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) Hayvanların Ötenazi (2013) için rehber tarafından belirtildiği gibi, kabul edilen uygulamalara uygun tricaine kullanarak aşırı dozda ilaç ile hayvan Euthanize.
- Ötenazi olmak Zebrafish 200-500 mg / l 'a tricaine çözelti yerleştirilmelidir Balıklar ölüm sağlanması için ötenazi (servikal transeksiyonu) bir fiziksel yollarla tabi tutulur ve bundan sonra ritmik operküler aktivite kesildikten sonra, 10 dakika içinde en az, için çözelti içinde kalan edilmelidir.
- Tüm tüpler aracılığıyla DI su çalıştırmak ve tehlikeli eğer, uygun bertarafı için toplamak.
- Hava kurutma kolaylaştırmak için açık konumda her bir tüp için stopcocks bırakın.
- % 70 etanol içinde elektrotlar daldırın ve hava ile kurumasına izin verir.
- % 70 etanol ile her parça temizleyin ve kurumaya bırakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, in vivo olarak yetişkin zebrabalıkları nöral aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Bu elektrofizyolojik tutarlı ve tekrarlanabilir elde edilir. Pentilentetrazol (PTZ), ortak bir chemoconvulsant 6,7,25,26, entübasyon içeri getirildiği zaman, Şekil 5, bir yetişkin zebrabalıkları nöral faaliyet yerli ve bağlı değişikliklerin bir temsili örneğini göstermektedir Kur.
Yetişkin zebrafish yerli, nörolojik etkinlik, her bir deney (Şekil 5A) için izlenmiştir. Bu sürekli bu faaliyet kaydın süresince genlik spontan ve küçük olduğu gözlenmiştir. Sisteme 15 mM PTZ tanıtılmasının ardından spontan epileptiform gibi boşalmalar yaklaşık 5 dakika geliştirmeye başladı. girişten sonra. Bu etkinlik, başlangıçta kısa, küçük genlik ve larva z içinde gözlenmiştir ne benzer, sık sık meydanaebrafish 6,7. PTZ, etkinliğin daha küçük, daha sık patlamaları ve bir sonraki sessiz bir dönemde (Şekil 5B) izledi geliştirilen büyük genlik deşarjları tutarlı bir desen devam maruz kalma ile.
Bu teknik entübasyon aracılığıyla, başka chemoconvulsants tanıtmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu bileşikler sayesinde, yerel nörolojik aktivitesinde değişiklikler de etkin bir şekilde uyarılmış edilmiştir. Pentilentetrazol sağlam bir basmakalıp bir şekilde zebrafish yerli nöral aktiviteyi değiştirmek için bir örnek nedeniyle yeteneği olarak burada kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, in vivo olarak yetişkin zebrabalıkları nöral aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Kaydedilen etkinlik özellikleri (genlik ve etkinlikleri şekli), ayrı ayrı balıklar arasında değişebilir ama uygulama ile, sinir aktivitesi, sürekli olarak gözlemlenebilir. Dışı kayıt tekniğinin kullanılması bu gözlemi açıklayabilir. Yöntem, bir bölge içinde 1 hücreleri, çok sayıda eş zamanlı olarak izlenmesini sağlar, bu nedenle birinci elektrot konumlandırma varyasyonlar olarak gözlenen etkinin bir rol oynayabilir. Birincil elektrotun derinliği, aynı zamanda ölçülen bölge değiştirir. Elektrot ucu bir bölgede çok derin konumlandırılmış ise, gözlenen sinyal beklenen ve aktivite değişiklikleri gözlemlemek için zor olacak daha küçük olacak, bu olursa ucu daha yüzeysel olarak oturuyor, böylece, sadece birincil elektrot geri çekin . Bu optik TECTUM karakteristik ve olması değil dikkat çekmeken beynin diğer bölgelerde derinlemesine bakan. Ancak, bu işlem beynin farklı bir bölge içinde yürütülen olabilir. Gözlenen sinirsel aktivite deney sırasında bazal düzeylere iner ve balık hala hayatta ise belirsiz ise, kafatası gelen elektrotlar kaldırmak ve kan akımı hayvan boyunca hala orada olup olmadığını görmek için kontrol edin. Bu, dudak ya da balık burun bölgesinde büyük gemiler gözlemleyerek kontrol edilebilir. Kan akımı kolayca bu bölgelerde görülebilir. Elektrotlar, bir kaydın ortasında kan akışı kontrol etmek için kaldırılır ise elektrotlara konumlandırma zaman, doğrudan orijinal bazal kaydın bu bölümünü karşılaştırma olanağı negating ilkinden daha biraz daha farklı bir konumda olacaktır .
Bu prosedürü başlamadan önce, entübasyon tüpleri yanı sıra kraniotomi ve elektrofizyoloji kurulumları hem perfüzyon tüpler olduğu sağlanmalıdırHerhangi bir kabarcıkları serbest. Baloncuklar toplamak yoksa, onlar musluğu açarak ve yaşam biraz su ile çalıştırmak için izin vererek sistem tükendi olabilir. Bu sorunu ortadan kaldırmak etmezse, küçük bir şırınga kanül yerleştirilmiş olacaktır borunun ucuna tutturulabilir ve ışık emme sistemi içinde herhangi geri kalan havayı çıkarmak için uygulanır. İnatçı kabarcıklar için, habitatı su borular yoluyla zorlanamaz. Ayrıca, perfüzyon tüpler astar ve balık intubating önce damlama emin olun. ~ 1 ml 'lik bir akış hızı / dakika elde değilse, basınç başlığının yüksekliğinin bu elde etmek amacıyla değiştirilebilir. Bu balık, yeterli su akışı erişimi sağlayacaktır. Elektrofizyoloji perfüzyon ayar seri olarak çok sayıda borular ile hazırlandığında, bu kaydedilen nörolojik etkinlik ile sonuçlanan değişiklikler bileşik olmaktan bağlı olsa da, hayvana tanıtılacak yeni çözüm için yaklaşık ~ 1 dakika sürdü olduğu saptanmıştırg tanıttı. Bu akış hızı önceden herhangi deneyler yürüten ölçülebilir olması tavsiye edilir. Önceki çalışma tricaine doğru kayıtları 27,28 elde etmek amacıyla sistemden kaldırılacak gerektiren, sinir aktivitesi azaltmak olduğunu göstermiştir. Önceki çalışmaları sayesinde, bu yaşam su ile entübasyon 45-60 dakikalık bir süre tricaine yıkayın ve sinirsel aktivite için yerel seviyelere ulaşmak için gerekli olduğu tespit edilmiştir. Benzer şekilde, pentilentetrazol arınma de gerçekleştirilmiştir, ve 20 dakikalık bir süre başlangıç seviyelerine geri sinir aktivitesi için gerekli olduğu tespit edildi. Bu nedenle, deneyci sistemi içine ilgi her bileşik için yıkama süresini belirlemek için denemeler tamamlamalıdır.
Bu teknik, bazı pratik gerektirir. Kraniotomi yaparken, ekstra bakım başını kapsayan kemikli plakasının küçük bir bölge zarar vermeden delinmiş ve kaldırılabilir olmasını sağlamak için alınması gerekenbeyin. Bu kafa göre bir dar açı vanna makas getirerek yapılabilmektedir. Optik TECTUM kapsayan kemikli alan zayıf ve makas gibi iyi giriş noktaları olarak hizmet merkezine yakın füzyonlarını vardır. Küçük bir mola plağındaki yapıldıktan sonra, kemik küçük bir alanı kesmek için makas kullanın ve ince forseps bir çift kullanarak kaldırın. Genç balıklar genellikle daha yumuşak, daha esnek kafatasları var, bu yüzden bu tekniği öğrenirken yaş veya daha az 1 yıl olan balık kullanım için önerilmektedir. Bazen, kan kraniotomi bölgesi etrafında toplamaya başlar, ancak bu nazikçe alanı çevresinde bir Kimwipe dabbing kaldırılabilir. Bu prosedür ile, kraniyotomi alanında yaklaşık 2 mm olan 2, çok küçüktür. Bu nedenle, küçük boyutu, kranial bölgenin kuruma olmamıştır. Kranyotomi büyük boyutta olduğu, ancak, bu bir profesyonel hale gelir ise, beynin nem kaybını önlemek için, agar ya da başka bir malzemenin uygulanması da mümkündürblem.
Ilgi çekici bir nokta pankuronyum bromid kullanılmasıdır. Bu kimyasal tekrarlanan donma ve erime önlemek amacıyla 10 ul alikolar içinde depolanır. Ağırlığının gramı başına 1 ul olmak üzere bir deneyde kullanılmak üzere önerilen hacim, yetişkin bir balık immobilize edilmesi için yeterlidir. Vesilesiyle, ancak, bu hacim yeterli değil. Bu durum oluşur ve felç elde edilmediği zaman, daha panküronyum bromür sürece kayıt başlamamış gibi, balık intraperitoneal edilebilir. Enjeksiyonu yaparken, sert yan ölçekler yoluyla enjekte etmeye kalkma, havalandırma yakın, yumuşak karın bölgesinde balık enjekte. Balık birincil elektrot yerleştirilmiş bir kez hareket etmeye başlarsa, iğne kraniotomi içinde kapalı kırıldı, ve prosedür yeni bir hayvan kullanılarak tekrarlanması gerektiğini iyi bir şans var. Bu çalışma sayesinde, bu panküronyum bromür kaydedilen sinirsel azalttığı tespit edilmiştirlarva zebrabalıkları (≤ taban genlik değerinde% 50) aktivitesi ve aynı yetişkinler için de geçerlidir varsayılır. Ancak, son deneyim, bir yetişkin sinirsel aktivite panküronyum bromür atfedilen herhangi bir nemlendirme etkisi olumsuz verileri toplamak ve analiz yeteneğini etkiler görünmüyor yeterince sağlamdır. Tersine, hareket ile ilişkili boşa önemli olabilir. Bu işlem için, hayvanın tam hareketsizlik yararları bu sınırlama ötesinde değer ve tanıtılmaktadır sinir değişiklikleri herhangi bir nemlendirme etkilerinin ötesinde ısrar edecek kadar sağlamdır. Ayrıca, hayvanın herhangi bir hareket, elektrot yerini alabilir elektrofizyoloji kayıt cihazları tarafından tescil edilecek ve muhtemelen hayvan tehlikeye.
Bu tekniğin sınırlamalar öncelikle dışı kayıt sağlam bir yetişkin zebrabalıkları içinde nörolojik faaliyetini kaydetmek mümkün yol olduğunu aslında yalan. Prima yerleştirirken zaman ry elektrot, iğne elektrot kısmında ise tam olarak nerede görmesini engelleyen bir, kraniyotomi içine sokulması gerekmektedir. Rağmen, uygulama ile, bu aynı bölge içinde ve tutarlı bir şekilde aynı derinlikte elektrot yerleştirmek mümkündür.
Vivo elektrofizyoloji ölçüde Zebra balığı larvaları ile sınırlı olmuştur. Bu kolayca, küçük balık ve entübasyon gerektirmeyen gerçeğini hareketsiz yeteneği kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, elektrofizyolojik çalışmalar larva aşamaları odaklanmış ve küçük yetişkin beyin içinde elektrofizyolojik aktivite konusunda yapılmıştır. Bu yapılacak çocuk ve yetişkin nörolojik etkinlik arasında bir karşılaştırma engellemiştir. Multitube entübasyon sisteminin kullanılması balık için çeşitli bileşikler kolayca verilmesi için izin verir. Bu, aynı zamanda, farklı kimyasal madde ya da her ikisi, larva ve yetişkin sistemlerinde incelenecek ilaçların etkileri sağlar.
nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 1. Entübasyon Kanül. San bir P-200 pipetteman ucu (A) geniş ucundan bir 1,5 cm bölümünü kaldırın. Konektörünü (B) indirgeyici bir Luer Lock içine bir boru 6 cm x 1 mm parça (ok) takın ve modifiye edilmiş pipet içine bu kanül yerleştirin. Boru (C) içinde ⅛ kısa bir kısmını kullanarak Luer kilit pozisyonunda pipet tutun.
Şekil 2. Entübasyon tabanı kurulumu bitirdi. Körfez Wax soğuduktan sonra, int küçük deliğe kanül kurulum yerleştirinubation baz (A). Sıkı bir sarmal içine 42 cm Kimwipe'a geniş şerit bir 1 bükün ve Kimwipe'dan iki ucuna uzanacak şekilde drenaj borusuna takın. Alt uç çanak (değil görünümünde) kristalleştirilmesi, 30 mm x 100 mm kadar uzatmak için izin Petri kabı (B) 'nin büyük bir delik içine drenaj borusunun bir ucunu. Bir ucu (siyah kesik çizgiyle) hayvanın karın bölgesi yakınında yer böylece doku yerleştirin ve alt uzantısı çanak içine aktığından.
Şekil 3,. Kraniotomi. Diseksiyon mikroskobu altında, optik TECTUM kapsayan kranial ~ 2 mm 2 bölümünü kaldırmak için vanna yaylı makas kullanın. Bu alan bu s karanlık, trapez kemik plakası gibi görünüyoronun göz arkasında. Kraniotomi konumlandırılmış nerede noktalı daire demarcates. Ok başı birinci elektrodun iğne kraniotomi deliği içinde konumlandırılmıştır var gösterir. Birincil elektrot klorid iyonları ile elektroliz ve borosilikat kılcal iğne sokulduktan gümüş tel 0,010 kesit bir 2.5 oluşur. Kılcal iğne 2-3 2 M potasyum klorür ul, ya da kısmen gümüş tel klorit kaplı ucu kaplayacak kadar doldurulur. İkinci elektrot, bir ucu baş kademesinin arkasına yerleştirilmiş izin vererek, bir ucunda lehimlenmiştir dışında birincil elektrot için kullanılan aynı tel bölümünde bir 15 oluşur. Balık dokunmadan konumlandırılacak olan ikinci telin ucu, ayrıca, klorür iyonlarının elektroliz gerekir. İkinci elektrot yetişkin balık sağ burun içinde konumlandırılmış olmuştur nerede ok gösterir.
Şekil 4. Elektrofizyolojik aktivite toplanması için kurulum. Sağlam entübasyon ayar elektrofizyoloji mikroskop taşınır ve kanül, perfüzyon sistemine (A) bağlanmıştır. Sistem su perfüzyon hemen başlatmak için izin, açık olması gerekir. Elektrot ucu hayvanın burun deliğine veya üst çenenin (ok) arkasındaki dip sokulur böylece mikromanipülatör kullanarak, ikincil elektrot (B) yerleştirin. Kraniotomi ağzına birincil elektrot iğne (C) takın. Bu optik TECTUM içinde oldukça yüzeysel yerleştirilmiş ve bu şekilde, iğne takın. Büyük drenaj borusu (D) görüş alanının dışında, entübasyon çanak uzanır ve diğer ucu t içine boşaltırO toplama tabağı.
Şekil 5,. Optik TECTUM içinde elektrofizyolojik kayıtları. (A) Bu sürekli yetişkin zebrafish optik TECTUM içindeki yerli aktivitesi kaydın süresince küçük bir amplitüd (2-10 mV) aktivitesi gösteren, basmakalıp kendiliğinden olduğu gözlenmiştir. (B) sistemine 15 mM PTZ tanıtılmasının ardından, spontan epileptiform gibi boşalmalar girişten sonra yaklaşık 5 dk geliştirmeye başladı. Bu aktivite, ilk olarak kısa, küçük genişliğe sahip oldu. PTZ, büyük genlikli tutarlı bir desen sürekli maruz kalma ile (en fazla 15 mV) aktivite daha küçük, daha sık patlamaları izledi geliştirilen deşarjlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma (TMD, JDL ve ATS) NIH / NINDS Grant R01NS070159 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
