Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cecal hemorroider og punkterings indusert Sepsis som en modell for å studere Autophagy i Mus

Published: February 9, 2014 doi: 10.3791/51066
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services, University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

Summary

Eksperimentell sepsis kan bli indusert i mus ved hjelp av cecal ligering og punktering (CLP)-metoden. Gjeldende forskrifter for å bestemme autophagy in vivo i forbindelse med CLP-indusert sepsis er presentert her: En protokoll for å måle ved hjelp av autophagy (GFP)-LC3 mus, og en protokoll for å måle autophagosome dannelse ved elektronmikroskopi.

Abstract

Eksperimentell sepsis kan bli indusert i mus ved hjelp av cecal ligering og punktering (CLP)-metoden, noe som fører til polymikrobielle sepsis. Her blir en protokoll tilgjengelig for å indusere sepsis av varierende alvorlighet hos mus ved hjelp av CLP teknikk. Autofagi er en grunnleggende vev som svar på stress og patogen invasjon. To aktuelle protokoller for å vurdere autofagi in vivo i sammenheng med eksperimentell sepsis er også presentert her. (I) Transgene mus som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP)-LC3 fusjonsprotein blir utsatt for CLP. Lokalisert forbedring av GFP signal (puncta), som analyseres enten ved immunohistokjemiske eller confocal analyser, kan benyttes for å påvise forbedret autophagosome dannelse og dermed endret aktivering av autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vakuole (autophagosome) dannelse per enhet vev område (som en markør av autofagi stimulering) kan kvantifiseres ved hjelp av elektronmikroskopi. Studiet av autophagic respons på sepsis er en kritisk component av å forstå de mekanismer som vev reagerer på infeksjon. Forskningsresultater på dette området kan til slutt bidra til å forstå patogenesen av sepsis, som representerer et stort problem i Critical Care Medicine.

Introduction

Sepsis, en systemisk inflammatorisk respons på infeksjon, representerer et ledende dødsårsaken i kritiker syke pasienter en. Intra-abdominale infeksjoner, ofte fører til polymikrobielle sepsis, står for 20% av sepsis tilfeller, som har betydelig dødelighet på opp til 60% 2. Sepsis-assosiert dødelighet primært resultater fra multi-organ dysfunksjon med påfølgende organsvikt 3,4. Ytterligere etterforskning av sykdomsfremkallende mekanismen for denne sykdommen er stort behov for å fremme utvikling av nye og mer effektive behandlingsformer.

Den cecal ligation og punktering (CLP)-metoden er en vanlig prosedyre for modellering sepsis in vivo. Som cecum er full av bakterier, dets punktering resultater i polymikrobielle peritonitt, translokasjon av bakterier i blodet (bakteriemi), septisk sjokk, multi-organ dysfunksjon og til slutt døden fem. Det er generelt akseptert at CLP gjenspeiler kliniskvirkeligheten mer nøyaktig enn tidligere teknikker, slik som injeksjon av endotoksin eller rensede bakterier i gnagere, således CLP er ansett gullstandarden (om enn ikke uten begrensninger) 6 for den eksperimentelle induksjon og dermed undersøkelse av patogenesen av sepsis. I denne monografien, beskriver vi protokollene utformet for å vurdere om sykdomsfremkallende mekanismer av sepsis inkluderer autofagi.

Autofagi, et evolusjonært konservert cellulære prosessen, forenkler omsetningen av skadede proteiner og organeller som mitokondrier og spiller en viktig rolle i clearance av intracellulære patogener inkludert bakterier 7,8. Under autofagi, er cytosoliske proteiner eller organ trukket inn doble membranbundne vesikler kalt autophagosomes, som senere blir levert til lysosomer for degradering ni. En rekke proteiner har blitt identifisert som pattedyr homologer av autophagy-relaterte gener (ATG),opprinnelig identifisert i gjær, som regulerer prosessen med autophagy. Konverteringen av microtubule assosiert protein-en lett kjede 3B (LC3B) (homologue av Atg8) fra LC3B-I (fri form) til LC3B-II (fosfatidyletanolamin-konjugert form) representerer et stort skritt i autophagosome formasjon 9. Autophagic dysfunksjon er assosiert med aldring og menneskelige sykdommer, inkludert kreft og nevrodegenerative lidelser 10. Videre påvirker autofagi medfødt og adaptiv immunitet som antigen presentasjon, lymfocytter utvikling og cytokin sekresjon av immunceller åtte. Dermed virker det rimelig at autofagi kan også spille en rolle i den systemisk inflammatorisk respons på infeksjon (dvs. i sepsis).

Hittil flere metoder har vært beskrevet for å vurdere rollen til autophagy i vevsskade in vivo. Disse inkluderer bruk av grønn fluorescens protein (GFP)-LC3 uttrykker mus og kvantifisering av autophagosomes i vev ved elektronmikroskopi (disse to metoder er beskrevet i monografien). Ytterligere fremgangsmåter omfatter kvantifisering av autophagic proteinekspresjon i vevshomogenater, og analysen av autophagic fluks (som beskrevet andre steder) 11-13. Målet med denne gjennomgangen er å gi nåværende protokoller for vurdering av autofagi in vivo i sammenheng med eksperimentell sepsis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Institutional Animal Care og bruk komité ved Brigham and Women Hospital / Harvard Medical School området vedtok følgende prosedyrer.

En. Cecal hemorroider og Punktering

Bruk mus av samme bakgrunn (C57Bl / 6), male, 8-10 uker gamle. Hunnmus er mer motstandsdyktige enn menn mot sepsis-indusert dødelighet. Mus eldre enn 8 uker produsere mindre variable resultater enn yngre mus i form av overlevelse etter CLP. Omtrent N = 10 mus pr gruppe forhold bør brukes for overlevelsesanalyse. N = 3-5 mus er tilstrekkelig for autophagy analyser.

  1. Bruk sterile små kirurgiske instrumenter (nemlig skalpell, saks og sløv anatomiske tang), som skal være aktuelle for gnager kirurgi.
  2. Forbered anestesi blanding: Til 7,95 ml PBS legg 150 pl av xylazin (AnaSed injeksjon på 100 mg / ml) og 700 pl av Ketamin (Ketaset   CIII, 100 mg / ml).
  3. For å sikre aseptiske forhold under prosedyren, hansker, munnbind og kirurgisk kappe.
  4. Vei dyr. Anesthetize dem ved å injisere intraperitonally (ip) blandingen nevnt i trinn 3 i en dose på ul (10x kroppsvekt i g). For eksempel, for en mus som veier 22 g, administrerer 10x22 = 220 pl av det anestetiske blandingen. Således, de endelige doser av xylazin og ketamin 17 og 80 mg / kg kroppsvekt, henholdsvis. Sørg for at anestesi er tilstrekkelig; ingen fleksjon av ekstremitet bør produseres etter tå klype Obs. Bruk ophthalmic salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
  5. Plasser dyrene på en ren arbeidsflate på ryggen. Haler og hind poter er orientert mot etterforsker. Desinfiser magehuden ved hjelp av alkohol (70% EtOH løsning). Merk: Kirurgisk området bør være helt barbert, for å unngå forurensning av såret gjennom kontakten medpels. Også, optimalt, bør benyttes en sirkulerende varmt vann pute for å opprettholde normothermia av anesteserte mus som i løpet av operasjonen.
  6. Ved å bruke en skalpell, lage en liten langsgående snitt i huden parallelt og ca 1 cm igjen til midtlinjen. Ikke trenge ennå i bukhulen. Bruk liten saks for å forlenge det første innsnitt.
  7. Identifiser magemusklene og dissekere dem til å få adgang inn i bukhulen.
  8. Ved å bruke butte anatomiske tang, identifisere cecum og flytte den ut av bukhulen. Vær forsiktig så du ikke skader mesenterial blodkar (dette kan føre til dødelig blødning).
  9. Ligere 60% av cecum å oppnå en middels grad av sepsis. Ligering av lik eller mer enn 75% av den cecum resulterer generelt i høy grad av sepsis, mens ligering av lik eller mindre enn 25% av cecum resulterer i lav grad av sepsis. Vær forsiktig så du ikke ligate ileocecal ventilen (dette kan blokkere tarm kontinuitet).
  10. Ved å bruke en21 G nål, perforere cecum ved en gjennom-og-gjennom punktering (to hull) nær til ligering. Retningen til perforeringen skal være fra mesenteriske til det anti-mesenteriske side av cecum. Vær forsiktig så du ikke å punktere mesenterial blodkar.
  11. Fjern nålen. Klem forsiktig på ligatisert cecum å bekrefte patency gjennom de to hullene, kun en liten mengde avføring bør ekstrudert gjennom dem.
  12. Flytt ligerte og punktert cecum inn i bukhulen.
    Merk: For humbug mus, hopper du over trinn 01.10 til 01.12.
  13. Bruk silke kirurgiske sting 6-0 med skjærende nål til å lukke magemuskulatur. Bruk silke kirurgiske sting 6-0 med skjærende nål til å lukke abdominal hud.
  14. Injiser 1 ml forvarmet (37 ° C) fysiologisk saltvann ip å erstatte varme og fuktighet tapt under prosedyren. Plasser mus under en varmelampe inntil deres lungeredning Obs. Optimalt en tryggere oppvarming enhet (such som et sirkulerende varmt vann pad) kan brukes i stedet for en varmelampe.
  15. Postoperativt injisere buprenorphin (0,05 mg / kg kroppsvekt sc.) For å oppnå smertelindring. Merk: Et dyr skal ikke forlates før den har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Et dyr som har gjennomgått et kirurgisk behandling bør ikke bli returnert til selskapet av andre dyr inntil fullt restituert.
  16. Plasser dyrene tilbake i burene med ubegrenset tilgang på mat og vann. Mus skal avlives når de blir døende (angitt med kliniske symptomer som for eksempel unnlatelse av å bevege seg ved berøring eller cyanose). Sjekk mus hver 4 time for å unngå å ha dem dø før avlivning.

2. Tissue Harvest og Fixation

  1. Forbered en 4% Paraformaldehyde (PFA) løsning: Å 889 ml PBS legge 111 ml av 37% PFA.
  2. Sacrifice mus ved hjelp av enten CO 2-indusert narkose eller Ketamin / xylazin solution i en høy dose.
  3. Immobilisere musene på en ren overflate. Spray mage-og bryst huden med 70% EtOH løsning for å desinfisere det.
  4. Bruk en skalpell og liten saks for å fjerne mage og bryst hud samt hud dekker tracheal området.
  5. Avslør luftrøret ved å fjerne dens omkringliggende vev (muskler og bindevev).
  6. Plasser en sutur (uten å kutte nål) rundt luftrøret. Ikke trekk den ennå.
  7. Bruk en liten perifer venekateter (20 G) til 'intubere' luftrør. Vær forsiktig under kateterinnleggelse for å unngå tracheal tåre. Legg merke til at diameteren på luftrøret største er like under cricoid brusk.
  8. Stram sutur rundt luftrøret / kateter. Fjern nålen slik at bare plast kanyle av kateteret inn i trachea. Needle fungerte kun som en guide-wire for å sette inn plast kanyle.
  9. Etter å ha sikret plast kanyle inn i luftrøret, kuttet the abdominalmusku åpne buken og avsløre mellomgulvet.
  10. Ved hjelp av en nål, punktere membranen for å produsere Pneumotoraks (dvs. innføring av luft inn i pleuralhulrommet). Lunger bør da kollapset.
  11. Ved hjelp av små saks, fjerne mellomgulvet, kutt langs brystbenet (sternotomi), fjerne brystkassen og avsløre hjertet og lungene.
  12. Gjennom plast kanyle innsatt i trachea, fikse lungene med formaldehydløsningen under 30 cm H 2 O trykk.
  13. Fjern lungene og plassere dem i 4% PFA i 24 timer og deretter i 70% EtOH-oppløsning inntil behandling.
  14. Identifisere og fjerne hjerte, lever og nyrer. På samme måte, setter dem inn i 4% PFA i 24 timer og deretter i 70% EtOH-oppløsning inntil behandling.

Tre. GFP Mus og visning av GFP Slides

  1. Utfør CLP og humbug kirurgi på GFP-LC3 mus som beskrevet i trinn 1, og postoperativ prosedyres som beskrevet i trinn 2 i protokollen.
  2. Legge vev (nemlig lunger, hjerte, lever og nyrer) i parafin og skjær dem i serie 5 mikrometer seksjoner.
  3. Når det er klart for GFP farging, Inkuber ved 60 ° C i 30-60 min inntil parafin smelter og vev vises gjennomskinnelig.
  4. Deparaffinize med standard gradert serie av xylen eller xylenerstatninger, 5 min xylen 1, xylen to, og xylen 3 deretter 3 min inkubasjoner i gradert serie EtOH: 100%, 95%, 75%, og deretter skylle i destillert vann.
    Merk: Etter deparaffinization unngå vev uttørking, noe som øker utvalget bakgrunn.
  5. Utfør antigen gjenfinning ved hjelp av sitronsyre-buffer (10 mM natrium-citrat-syre, 0,05% Tween 20, pH 6,0), ved mikrobølgeovnen i 10-20 min. Vær nøye med å erstatte buffer jevne mellomrom for å unngå vev uttørking.
  6. La løsningen avkjøles i 20 minutter på benken for å fullføre antigen henting.
  7. Vask 2-3x med PBS. Fjern overflødig buffer og transfer lysbilder fra stativ til horisontal posisjon i et lysbilde boks eller annen fuktet kammer for å hindre uttørking.
  8. Blokk 45 til 60 minutter ved romtemperatur med 10% normal esel serum (også 5% bovint serum albumin, eller fortrinnsvis serum fra dyret i hvilken det sekundære antistoff ble generert) i PBS.
  9. Inkuber prøvene i grunnskolen GFP antistoff på 1:100 fortynning i PBS natten ved 4 ° C i fuktet kammer. Forsiktig anvende små biter av Parafilm løpet vev med antistoff for å fremme homogen kontakt med vevet og hindre fordampning.
    Merk: gjenværende trinnene blir utført ved romtemperatur.
  10. Vask 5 x med PBS for å fjerne overskudd av primært antistoff. Inkuber med sekundært antistoff 1:500-1:1,000 i PBS i 1 til 2 timer ved romtemperatur.
  11. Vask 5x med PBS for å fjerne overskudd av sekundært antistoff. Hvis ønskelig, counterstain lysbildene på dette trinnet.
  12. Hvis du bruker fluorescerende sekundær antistoff, ruge 0,1% Sudan svart i 70% EtOH feller 15-20 min å redusere autofluorescence. Tørk av overflødig Sudan Svart fra rundt vev og vaske 5x med PBS over 20 min.
  13. Monter prøven med dekkglass og lagre horisontalt, til monteringsløsning har satt.

4. Alternativ Protokoll: Direkte Påvisning av GFP-LC3

  1. Cannulate og blåse lungene med ~ 500 ml 50/50 v / v oktober PBS.
  2. Legge i oktober ved å sette en liten mengde av oktober i bunnen av en cryomold.
  3. Plassere dissekert lungekomplekset forsiktig i formen.
  4. Sakte fryse methylbutane kjølt ved hjelp av tørris.
  5. Tilsett mer oktober inntil vevet er fullstendig dekket og frosset faststoff. Hold på tørris og oppbevar ved -80 ° C.
  6. Ved hjelp av en cryomicrotome, kuttet 5-10 mikrometer tykke seksjoner beskytte delene mot lys. Lagre seksjoner og gjenværende vev ved -80 ° C.
  7. For å forberede lysbilder for bildebehandling, fjerne avsnitt fra fryseren og umiddelbart bruke en dråpe PBS for å hindre uttørking.
  8. Fix for 30 min med 4% PFA. Vask med PBS.
  9. Påfør DAPI / Hoescht for 10 min. Vask 3x med PBS.
  10. Monter prøven med dekkglass og lagre horisontalt, til monteringsløsning har satt.
  11. Bilde ved hjelp epifluorescence eller konfokalmikroskop. Oppbevar prøver ved 4 ° C i opptil en måned.

5. Utarbeidelse av Tissue Elektronmikroskopi

  1. Skjær vev inn ca 1 mm kuber for å fikse.
  2. Fiks vevet i 2% formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer, pH 7,4.
  3. Vask med 0,1 M natrium-kakodylat-buffer i 1-2 timer.
    Merk: Fast vev kan lagres i 0,1 M natrium-kakodylat ved 4'C
  4. Post fix i en% osmiumtetroksid i 0,2 M natrium kakodylat buffer for en hr.
  5. Skylling i 0,2 M natrium-kakodylat-buffer i 10 min 3x.
  6. Dehydrerer i 70% EtOH, 20 min 2x. Dehydrerer i 90% EtOH, 10 min 2x. Dehydrerer i 100% EtOE20 min 2x.
  7. Inkuber med propylenoksyd (epoksy-propan) i 10 min 2x.
  8. Inkuber med propylenoksyd / epoksyharpiks-blanding (50:50) i 1 time. Den epoxy-harpiks blandingen er: 24 g Agar 100 harpiks, 13 g dodecenylsuccinic anhydrid, 13 g methylnadic anhydrid og 1 ml N-benzyldimethylamin. Bland godt i en engangsbeger ved hjelp av en tre slikkepott.
  9. Inkuber med Epoxy resin over natten i uavdekkede ampuller (dette gjør at eventuelle gjenværende propylen oksid å fordampe).
  10. Legge i merkede kapsler med nylagde harpiks. Å polymerisere ved 60 ° C i 48 timer.
  11. Photograph vevssnitt ved hjelp av en overføring elektronmikroskop ved 80 eller 60 kV på elektronmikroskop film. Skriv ut bildene til fotopapir eller lagre som digitale medier.
  12. Analyser autophagosome formasjonen i intakte celler som inneholder kjernen. Lav strømfelt (e. G.. 2000-4000 X) kan brukes til å identifisere nukleerte celler. Vanligvis 6,800-10,000 X bilder brukes for ther autophagosome kvantifisering. Count autophagosomes per arealenhet 15-30 felt for hensiktsmessig statistisk representasjon. Autophagosomes har dobbel membran struktur, hvor sent stadium autophogosomes lignet fylte vakuoler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bacteremia er tilstede i mus allerede i 6 timer etter CLP-indusert sepsis 14.. Kliniske tegn på sepsis (inkludert frysninger, takypné og nedsatt motorisk aktivitet) vises ca 12 timer etter inngrepet. Mus utsatt for CLP begynner å dø på rundt 18 timer etter induksjon av peritonitt. Jo mer alvorlig er sepsis jo mer økt er dødeligheten 15. I detalj, høyverdig sepsis forårsaker 100% dødelighet i løpet av 2-3 dager, mens mid-grade sepsis resultater i dødelighet rundt 60% på 7 dager etter CLP (utover denne fristen, ingen dødsfall er forventet) (figur 1). I motsetning til dette bør dødelighet av narre mus være null

Figur 1
Figur 1. Overlevelseskurver etter CLP av forskjellig alvorlighetsgrad hos mus. C57BL / 6 mus ble utsatt for hykle kirurgi eller CLP-indusert sepsis av forskjellig alvorlighet ved å justere ligation holde konstant antall perforeringer i cecum (dvs. en "gjennom-and-through" punktering (to hull) med en 21 G nål ). Ligation av 60% av cecum resulterer i en mid-grade sepsis, noe som fører til dødelighet rundt 60% på 7 dager etter CLP. Ligation på ≥ 75% av cecum gir høy grad av sepsis, og senere, i 100% dødelighet i løpet av 2-3 dager etter CLP, mens, ligering av ≤ 25% av cecum fører i lavgradig sepsis, og dermed i nesten null dødelighet. Typiske overlevelse utfall vises.

Ved anvendelsen av autophagy studier, valgte vi å gjennomføre en CLP modell av mid-grade sepsis. Lavgradig sepsis kan være utilstrekkelig for å indusere autofagi, mens høyverdig sepsis kan føre til tidlig dødelighet av mus (før induksjon av autofagi).

ve_content "> For å analysere autofagi, har vi benyttet transgene mus som uttrykker GFP-LC3 fusjonsprotein utsatt for de nevnte sepsis protokoller. For behandlingsprosedyrer som fører til stimulering av autofagi veien, er det forventet at det vil være lokalisert forbedring av GFP signal ( puncta), som analyseres enten ved immunhistokjemiske eller confocal analyser, som tyder på forbedret autophagosome formasjon 16.

Fig. 2
GFP avbildning in vivo og in vitro. Figur 2.. (A, B) Representative eksempel på GFP avbildning i museorganer (f.eks nyre) oppnådd fra GFP-LC3B mus. Bildet viser GFP-LC3 puncta i glomeruli av nyrevevet hentet fra ubehandlede mus. Scale barer = 10 mm. ( C, D) Ytterligere data er gitt for å illustrere in vitro GFP-LC3 avbildning. Primære mesangiale celler ble isolert fra GFP-LC3 transgene mus ved å bruke en protokoll for celleisolasjon fra genetisk modifiserte mus som tidligere beskrevet. 17. Cellene ble inkubert i fravær (C) eller i nærvær (D) av TGF-β1 (2 ng / ml) i 24 timer som tidligere beskrevet 18. Behandling med TGF-β1 økt overflod av autophagosomes (grønn puncta). Klikk her for å se større bilde.

Dette kan bli ytterligere testet ved klassisk ultrastructural analyse ved hjelp av elektronmikroskopi, som beskrevet i protokollen. Det er forventet at vevssnitt innhentet fra septik mus eller andre vev skademodeller ville vise forbedret autophagic vakuole (autophagosome) dannelse per enhet vev området.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 3
Figur 3. Elektronmikroskopi av autophagosome formasjon. Et representativt micrograph av tidlig og sent stadium autophagosome formasjonen i lungevev tatt fra C57Bl / 6 mus utsatt for mid-grade CLP (60% ligation, 21 G, 2 hull). Εarly scene autophagosomes har en dobbel-membran struktur (pil), mens sent stadium autophagosomes ligne en fylt vakuole (pilspiss). M betegner mitokondrier. Scale bar = 1 mikrometer. En representant kontroll bildet er vist av lungevev fra C57Bl / 6 mus utsatt for humbug drift. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den store fordelen med CLP er at det tillater forskere å undersøke sepsis av ulike alvorlighetsgrader (dvs. fra lav til middels og høy grad). Alvorligheten av indusert sepsis påvirkes av lengden av cecum ligert (som er det viktigste determinant), størrelsen på nålen benyttes for punktering, og antallet hull 15 utført. I tillegg kan mus belastning og kjønn av betydning for graden av sepsis; flere stammer er mer utsatt enn andre og hanner, generelt er mer utsatt enn hunner 19,20. De ovennevnte faktorene tatt sammen bestemme CLP-indusert dødelighet.

Basert på vår erfaring, det er en forskjell mellom etterforskere med hensyn til oppnådde CLP-indusert dødelighet. . For eksempel Rittirsch et al brukte 50% ligation, 21 G, en 'gjennom-og-gjennom "punktering (to hull) for å oppnå en dødelighet 15 60%, en etterforsker i vår forskningsgruppe behoved å bruke en litt mer alvorlig modell (60% ligering, 21 G, 1 'gjennom-and-through "punktering) for å oppnå den samme dødeligheten, mens, en annen forsker i vårt forskningsgruppe anvendes en mer alvorlig modell (i nærheten av 100% ligation , 19 G, 1 'gjennom-og-gjennom "punktering) for å oppnå en mye lavere dødelighet (bare 25%). Med de ovennevnte hensyn i tankene, kan man argumentere for at karakterisering av alvorlighetsgraden av CLP (dvs. lav-, middels-eller høyverdig sepsis) bør gjøres med tilbakevirkende kraft (dvs. ved å se på den resulterende dødelighet) snarere enn prospektivt (dvs. ved å bruke visse vilkår, for eksempel 50% ligation). Når en operatør oppnår en dødelighet på rundt 60%, så er dette mid-grade sepsis, uansett hvilke forhold (for eksempel lengden på cecum ligatisert og antall hull utført) er implementert. Dermed virker det rimelig at operatøren prøve forskjellige forhold for å identifisere de under som 60% av mus dø. Deretter operatørenhar til å gjennomføre nøyaktig de samme forhold i begge grupper ble sammenlignet.

Ved å implementere nøyaktig de samme forhold (f.eks lengden av cecum ligatisert, størrelsen på nål brukes for punktering, antall hull utført, musen belastning, og kjønn), det er forventet at konsistente og reproduserbare resultater vil bli produsert 15. Men selv etter at ytelsen til CLP på en standardisert måte (tar hensyn til de ovennevnte faktorer som bestemmer), kan variasjoner forekomme. Det har blitt anerkjent av eksperter at "selv når identiske fornærmelser er gitt til identisk alderen grupper av dyr - selv fra samme kull - en variabel individuell effekt kan sees 'seks. Derfor, i forsøk på å redusere variasjonen, synes det rimelig at operatøren utføre CLP i begge sammenlignet grupper på samme dag.

Analysen av autophagy, en dynamisk cellulær prosess, er komplekse. Protokollene er skissert i denne monograph gi grunnlag for å estimere autofagi aktivering in vivo, basert på biokjemiske eller morfologisk analyse av autophagosome formasjon. I prinsippet kan de protokoller som er gitt i dette kapitlet brukes til analyse av autofagi i alle organ vev hos mus utsatt for CLP eller alternative modeller av sepsis. Mens leveren er generelt akseptert å representere et primært mål for CLP, kan denne prosedyren også forårsake skader på lunge-eller nyrevevet, noe som er verdig til videre studier. Effekten av CLP på autofagi av hepatocytter har vært relativt godt studert i forhold til virkningene på autofagi av nyre eller lunge, og noen relevante bevis er nylig blitt publisert 21,22.

Det bør bemerkes at disse er statiske tiltak av autofagi, som økte autophagosome tall kan også reflektere autofagi dysfunksjon gjennom blokkering av lysosomal funksjon og end-stage behandling. I denne forbindelse bør disse assays kompletteres med BiochemiCal-analyser for autophagic substrat omsetning (f.eks   flux) som nylig er beskrevet, og er tilpasset for in vivo-analyser 11. Disse analysene kan også bli supplert med standard Western immunoblotanalyse for uttrykket av sentrale autophagy proteiner i vev som nylig beskrevet 12,13. Således er det anbefalt at en kombinasjon av disse testene gjennomføres for å oppnå en nøyaktig estimering av status for autophagy i skadet vev 16..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å fortolle

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, til AMK Choi. S. Ryter mottatt lønn støtte fra Lovelace Respiratory Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
  2. Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
  3. Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
  4. Rivers, E., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).
  5. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
  6. Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
  7. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  8. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
  9. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  10. Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
  11. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
  12. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
  13. Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
  14. Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
  15. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
  16. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  17. Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
  18. Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  20. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
  21. Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
  22. Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).

Tags

Infeksjon autophagosome Autophagy cecal ligation og punktering mus sepsis
Cecal hemorroider og punkterings indusert Sepsis som en modell for å studere Autophagy i Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding,… More

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter