अधिक प्रोटीन की तुलना में आधे से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इमेजिंग और तीन आयामी पुनर्निर्माण दोनों के लिए चुनौती दे रहे हैं कि छोटे प्रोटीन (आणविक जन <200 केडीए) कर रहे हैं. अनुकूलित नकारात्मक धुंधला उच्च विपरीत और अपेक्षाकृत उच्च संकल्प (~ 1 एनएम) विभिन्न शारीरिक शर्तों के तहत छोटे असममित प्रोटीन या परिसरों की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक मजबूत और उच्च throughput प्रोटोकॉल है.
200 केडीए – प्रोटीन की स्ट्रक्चरल दृढ़ संकल्प बल्कि 40 के बीच आणविक जनता के साथ प्रोटीन के लिए चुनौती है. प्राकृतिक प्रोटीन के आधे से अधिक 40 के बीच एक आणविक द्रव्यमान है यह देखते हुए कि – 200 केडीए 1,2, एक नैनोमीटर संकल्प की क्षमता के साथ एक मजबूत और उच्च throughput विधि की जरूरत है. नकारात्मक धुंधला (एन) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) अक्सर प्रोटीन संरचना और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है जो एक आसान, तेजी से, और गुणात्मक दृष्टिकोण है. दुर्भाग्य से, परंपरागत एन एस प्रोटोकॉल अक्सर विशेष रूप से आमतौर पर rouleaux कलाकृतियों पेश कि फार्म लिपो प्रोटीन के साथ, प्रोटीन पर संरचनात्मक कलाकृतियों उत्पन्न करते हैं. एक मानक के रूप में क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) से लिपो प्रोटीन की छवियों का उपयोग करके, एन एस नमूना तैयार करने की स्थिति में मुख्य मापदंडों हाल ही में जांच की गई और अनुकूलित एन एस प्रोटोकॉल (OpNS), एक संशोधित पारंपरिक एन एस प्रोटोकॉल 3 के रूप में की सूचना दी. आरओ तरह कलाकृतियोंuleaux बहुत अतिरिक्त (1 एनएम के पास) यथोचित उच्च संकल्प के साथ उच्च विपरीत छोटे और विषम प्रोटीन की छवियों को उपलब्ध कराने, OpNS द्वारा सीमित किया जा सकता है. इन उच्च संकल्प और उच्च विपरीत छवियों इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 4,5 की विधि के माध्यम से, इस तरह के एक 160 केडीए एंटीबॉडी के रूप में एक व्यक्ति प्रोटीन (एक भी वस्तु, कोई औसत) 3 डी पुनर्निर्माण के लिए भी अनुकूल हैं. इसके अलावा, OpNS छोटे प्रोटीन के नमूने के सैकड़ों की जांच के लिए एक उच्च throughput उपकरण हो सकता है. उदाहरण के लिए, 53 केडीए cholesteryl एस्टर स्थानांतरण प्रोटीन के पहले प्रकाशित तंत्र (CETP) नमूने 6 के सैकड़ों की स्क्रीनिंग और इमेजिंग शामिल किया गया. को ध्यान में रखते क्रायो ईएम शायद ही कभी सफलतापूर्वक छवियों प्रोटीन कम से कम 200 केडीए एक सौ से अधिक नमूने शर्तों स्क्रीनिंग शामिल किसी भी अध्ययन प्रकाशित करने के लिए अभी तक है, यह OpNS छोटे प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक उच्च throughput विधि कॉल करने के लिए उचित है. उम्मीद है कि यहाँ प्रस्तुत OpNS प्रोटोकॉल ई की सीमाओं को बढ़ाने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता हैएम छोटे प्रोटीन संरचना, गतिशीलता और तंत्र में ईएम पढ़ाई में तेजी लाने और.
प्रोटीन समारोह को समझना प्रोटीन संरचना का ज्ञान की आवश्यकता है. 200 केडीए – स्ट्रक्चरल दृढ़ संकल्प जिसका आणविक जनता 40 के भीतर हैं प्रोटीन के लिए चुनौती है. एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन क्रिस्टलीकरण द्वारा सीमित है; क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) आणविक जनता कम कर रहे हैं जो दोनों छवि अधिग्रहण और छोटे प्रोटीन के तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण में कठिनाई है, जबकि परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, 40 केडीए से कम आणविक जनता तक सीमित है 200 केडीए से. विशेष रूप से, 50% से अधिक प्रोटीन 40 की सीमा के भीतर एक आणविक जन – मौजूदा तरीकों इस आकार के प्रोटीन का अध्ययन करने में चुनौती दे रहे हैं, के रूप में 200 केडीए 1,2, एक नई विधि की जरूरत है.
सबसे ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEMs) परमाणु संकल्प, यानी, बेहतर 3 से एक प्रस्ताव में सक्षम हैं हालांकि, एक जैविक नमूने से भी एक के पास नैनोमीटर संकल्प संरचना को प्राप्त करने के बजाय challen हैging 7. विकिरण क्षति, कम विपरीत, संरचनात्मक विचलन के साथ ही निर्जलीकरण के रूप में कलाकृतियों सभी उच्च संकल्प मंदिर इमेजिंग 3,8 बाधा.
विभिन्न मंदिर दृष्टिकोण के अलावा, क्रायो ईएम पास शारीरिक स्थितियों 9-12 के तहत अत्यधिक सममित बड़े अणुओं के परमाणु संकल्प संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए एक उन्नत और अत्याधुनिक विधि है. क्रायो ईएम नमूना बाद में इस तरह के तरल नाइट्रोजन या हीलियम तापमान 13 के रूप में क्रायोजेनिक तापमान पर imaged है जो कांच का बर्फ, में बड़े अणुओं एम्बेड, नमूना समाधान ठंड फ़्लैश तैयार किया जाता है. नमूने है कि कोई कलाकृतियों वर्तमान और संरचना 8-12 में लगभग मूल निवासी हैं में क्रायो ईएम फायदेमंद है. अतिरिक्त उपकरणों स्थापित या एक क्रायो ईएम क्षमता के लिए एक मानक मंदिर साधन के उन्नयन के लिए खरीदे जाने की आवश्यकता है मैं): क्रायो ईएम अपने नुकसान है. उपकरण शामिल हैं: विरोधी contaminator, क्रायो धारक, कम खुराक मोड सॉफ्टवेयर और कम खुराक Sensiेश्य सीसीडी कैमरा, इन उपकरणों की कीमतों में मंदिर साधन ही की कीमत से काफी कम हैं, हालांकि; द्वितीय) क्रायो ईएम आपरेशन एन एस आपरेशन की तुलना में अब समय की जरूरत है. एक क्रायो ईएम नमूना जांच अक्सर एन एस की तुलना में मंदिर साधन नमूनों को तैयार करने और संचालित करने के लिए अब समय की आवश्यकता है क्रायो ईएम सहित अतिरिक्त कठिनाइयों को संबोधित आवश्यकता है: तरल नाइट्रोजन तापमान आपरेशन, नमूना चार्ज, इमेजिंग बहाव, तापमान ढ़ाल, कम खुराक मॉडल आपरेशन, नमूना विकिरण संवेदनशीलता और खुराक सीमाओं. कुछ क्रायो EM छवियों निश्चित रूप से एक संतुलित तापमान ढाल के साथ तैयार साधन के साथ क्रायो ईएम विशेषज्ञों द्वारा 1 घंटा या उससे कम समय में प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि इन अतिरिक्त कदम, एन एस डाटा अधिग्रहण की तुलना में उपयोगी डेटा प्राप्त करने की गति धीमी हो जाएगी; iii) उपयोगकर्ताओं ऐसे इमेजिंग proc में, क्रायो EM ग्रिड, कम खुराक आपरेशन, खुराक माप ठंड, तरल नाइट्रोजन से निपटने चार्ज संभाल रही, बहती है और ज्ञान के रूप में अतिरिक्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती हैEssing; विभिन्न मंदिर सत्र के दौरान एक ही क्रायो नमूना के लिए repeatable इमेजिंग के चतुर्थ) की कमी है. क्रायो ईएम नमूनों आसानी मंदिर साधन से / नमूना लदान और उतराई के दौरान बर्फ संदूषण से क्षतिग्रस्त हो रहे हैं. इस नुकसान के नमूने अलग किया जाना मुश्किल हो जाता है जब विशेष रूप से चिंता का विषय है / 14 शुद्ध; v) छोटे प्रोटीन (<200 केडीए आणविक द्रव्यमान) चुनौती दे रहे हैं, क्योंकि कम विपरीत की imaged किया जा; vi) क्रायो EM छवियों के विपरीत कम और उच्च शोर विशेष रूप से संरचनात्मक लचीला कर रहे हैं कि प्रोटीन के लिए प्रोटीन झुकाव, रचना और वर्गीकरण, के निर्धारण में समग्र सटीकता कम है, इसलिए, छवियों के बीच पार सहसंबंध मूल्य कम कर देता है और स्वाभाविक रूप से समाधान में उतार चढ़ाव 4,5.
नकारात्मक धुंधला (एन) किसी भी प्रयोगशाला, किसी भी प्रकार के ईएम के साथ, प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए उपयोग कर सकते हैं जो एक अपेक्षाकृत "प्राचीन" और ऐतिहासिक विधि है. ब्रेनर और हॉर्न पहली अवधारणा ओ विकसितच वायरस 15 की जांच के लिए एक आधी सदी पहले नकारात्मक धुंधला. एन एस आरोप लगाया भारी धातु लवण के साथ नमूना कोटिंग के माध्यम से पूरा किया है. इस अवधारणा मूल रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोपी और नकारात्मक छवि 16 देखते समय उच्च छवि के विपरीत, की अनुमति नमूनों चारों ओर अंधकार उपलब्ध कराने के एक दाग समाधान में बैक्टीरिया embedding के अभ्यास से आ रहा है. भारी धातु आयनों प्रोटीन 17-20 में कम घने परमाणुओं की तुलना में इलेक्ट्रॉनों को फैलाने के लिए एक अधिक से अधिक क्षमता है, और कोटिंग भारी धातु दाग सुधार विपरीत के साथ एक उच्च खुराक सीमा परमिट के बाद से. एन एस नमूना आसान कण उन्मुखीकरण दृढ़ संकल्प और क्रायो ईएम से छवियों से 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उच्च विपरीत छवियों 8 प्रदान कर सकते हैं.
पारंपरिक एन एस, दुर्भाग्य से, सपाट और 8,21,22 stacking ऐसे सामान्य एकत्रीकरण, आणविक हदबंदी के रूप में दाग, प्रोटीन बातचीत,, द्वारा प्रेरित कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं. लिपिड संबंधित prote के लिएऐसे लिपो प्रोटीन 16,23-30 के रूप में इन,, खड़ी और एक rouleaux में एक साथ (चित्रा 1) 31-36 पैक कर रहे हैं कि कणों में एक आम विरूपण साक्ष्य का परिणाम है. ऐसे nondenaturing polyacrylamide ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में कई लिपोप्रोटीन अध्ययन, क्रायो उन्हें सभी शो लिपोप्रोटीन कण अलग कणों के बजाय प्राकृतिक रूप से खड़ी दिखती हैं मास स्पेक्ट्रोमेट्री 39,41, और छोटे कोण एक्स रे विवर्तन डेटा 42, 13,29,37-40 अध्ययन एक साथ एक rouleaux 21,29,30,35,42-45 बनाने. पारंपरिक एन एस द्वारा rouleaux गठन का अवलोकन संभवतः मानक एन एस प्रोटोकॉल का हल 13,29,30,46-49 और संवेदनशीलता में संरचनात्मक लचीला कर रहे हैं कि apolipoproteins (एपीओ) और फॉस्फोलिपिड से बना लिपो प्रोटीन के बीच गतिशील बातचीत के कारण होता है. इस विरूपण साक्ष्य की पहचान करने के लिए, अपोलीपोप्रोटीन E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) नमूना एक परीक्षण नमूना और cryo- के रूप में इस्तेमाल किया गयास्थितियों की एक श्रृंखला के तहत तैयार एन नमूनों स्क्रीनिंग एक artifact मुक्त मानक 29, के लिए EM छवियों. एन एस और क्रायो ईएम से प्राप्त कण आकार और आकार की तुलना करके, धुंधला अभिकर्मक और नमक एकाग्रता के विशिष्ट प्रकार अच्छी तरह से जाना जाता rouleaux घटना के कारण दो मुख्य मापदंडों होना पाया गया. इस प्रकार, एक अनुकूलित नकारात्मक धुंधला (OpNS) प्रोटोकॉल की सूचना मिली थी.
OpNS करके, apoE4 एचडीएल की अच्छी तरह से जाना जाता rouleaux घटना OpNS (2A चित्रा) से हटा दिया गया. सांख्यिकीय विश्लेषण क्रायो ईएम से उन लोगों की तुलना में OpNS पैदावार आकार और आकार में बहुत इसी तरह की छवियों (कम से कम 5% विचलन) का प्रदर्शन किया, लेकिन इसके विपरीत हटा दिया गया. OpNS का सत्यापन लगभग सभी वर्गों या apoA-मैं 7.8 एनएम (चित्रा 2B), 8.4 एनएम सहित लिपोप्रोटीन नमूने 6,29,30,50,51, के उपवर्गों के rouleaux विरूपण साक्ष्य के उन्मूलन का परीक्षण करके प्रदर्शन किया गया (चित्रा -2) , 9.6 एनएम डीiscoidal एचडीएल (rHDL) (चित्रा 2 डी), 9.3 एनएम गोलाकार rHDL (चित्रा 2 ई), मानव प्लाज्मा एचडीएल (चित्रा 2 एफ), लिपिड मुक्त apoA-मैं (चित्रा 2 जी), प्लाज्मा एचडीएल (चित्रा 2H), कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल का पुनर्गठन ) (चित्रा 2I), मध्यवर्ती घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (आईडीएल) (चित्रा 2J), बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (VLDL) (चित्रा 2K), और POPC liposome (चित्रा 2L) 30. (चित्रा -4 ए और बी) 4,5,29 6,29, और अत्यधिक लचीला 160 केडीए आईजीजी एंटीबॉडी – अतिरिक्त सत्यापन, छोटे और विषम प्रोटीन इमेजिंग 53 केडीए cholesteryl एस्टर हस्तांतरण प्रोटीन (CETP) (सी चित्रा 3 ए) सहित द्वारा प्रदर्शन किया गया , 52, और दो संरचनात्मक अच्छी तरह से जाना जाता प्रोटीन, GroEL और एंटीबॉडी (चित्रा 2M और एन). सी से किसी भी अतिरिक्त सत्यापन की आवश्यकता के लिएolleagues, हम इस OpNS विधि पर कोई अंधा परीक्षण के लिए खुले हैं.
OpNS एक उच्च throughput प्रोटोकॉल भी CETP, लिपो प्रोटीन के 4 वर्गों के लिए recombined एचडीएल बातचीत सहित एक श्रृंखला की शर्तों के तहत विभिन्न प्रोटीन (के लिए बाध्य किया गया था कि इस तरह के CETP के रूप में छोटे प्रोटीन के नमूने के सैकड़ों की जांच के माध्यम से प्रोटीन तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, के रूप में प्लाज्मा एचडीएल, एलडीएल और वीएलडीएल, साथ / 3 मिनट, 20 मिनट, 1 घंटा, 2 घंटा, 4 घंटा, 8 घंटा, 24 घंटा, 48 घंटा और 72 घंटा सहित 9 ऊष्मायन टाइम्स के तहत 2 एंटीबॉडी, H300 और N13,, बिना, सहित 4, और 3 dilutions, यानी, 0.1 मिलीग्राम / एमएल, 0.01 मिलीग्राम / एमएल और 0.001 मिलीग्राम / एमएल, प्लस अतिरिक्त नियंत्रण के नमूने,: 4 के तहत दाढ़ अनुपात, यानी, 1: 0.5, 1: 1: 1, 2, 1 विभिन्न व्यक्तियों द्वारा उपरोक्त प्रयोगों) 6,29 की ट्रिपल परीक्षण के साथ अकेले CETP, अकेले अकेले एलडीएल, और वीएलडीएल,. OpNS CETP की छवियों यथोचित ठीक संरचनात्मक विवरण के साथ उच्च विपरीत छवियों प्रदान की; हमें की अनुमति सफलतापूर्वक 53 केडीए SMA के एक 3 डी घनत्व नक्शा फिर से संगठित करने के लिएडालूँगा प्रोटीन CETP (चित्रा 3 डी – एफ) के एक कण पुनर्निर्माण द्वारा. हमें मध्यवर्ती संकल्प एक भी की (~ 1.5 एनएम) (एक वस्तु, कोई औसत) आईजीजी एंटीबॉडी 3 डी संरचना को प्राप्त करने की अनुमति दी है, जो – इसके अलावा, उच्च विपरीत OpNS छवियों हमें एक व्यक्ति प्रोटीन (सी चित्रा -4 ए) से एक पर्याप्त संकेत प्रदान 5 – व्यक्ति कण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (IPET) विधि (जम्मू चित्रा 4E) के माध्यम से. IPET पुनर्निर्माण रणनीति, कार्यप्रणाली, कदम दर कदम प्रक्रिया और संरचनात्मक बदलाव के विश्लेषण का विस्तृत विवरण पहले 4 सूचित किया गया है. यूट्यूब 5 पर अपलोड द्वारा कच्चे छवियों और मध्यवर्ती परिणाम, 3 डी घनत्व नक्शा और संरचनात्मक डॉकिंग सहित IPET एंटीबॉडी पुनर्निर्माण प्रक्रियाओं, के बारे में एक फिल्म की जनता के लिए भी उपलब्ध था. अलग व्यक्ति एंटीबॉडी कणों से 3 डी पुनर्निर्माण की तुलना प्रोटीन गतिशीलता और सी बता सकता हैरासायनिक प्रतिक्रियाओं 4,5 दौरान onformational परिवर्तन.
केडीए 1,2 200, इन छोटे प्रोटीन इमेजिंग में सफलता OpNS विधि छोटे और विषम संरचनात्मक निर्धारण और तंत्र खोजों की ओर पारंपरिक ईएम सीमा पुश करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है कि इसका सबूत – प्रोटीन का 50% से अधिक 40 से लेकर आणविक द्रव्यमान है कि ध्यान में रखते हुए . इस प्रकार, विस्तृत प्रोटोकॉल के रूप में नीचे दी गई है.
पारंपरिक एन एस तकनीक की तुलना में, OpNS rouleaux कलाकृतियों (चित्रा 1 और 9), विश्वसनीय और उचित उच्च संकल्प (~ 1nm) छोटे प्रोटीन की संरचनात्मक जानकारी प्रदान (चित्रा 2) को रोका जा सकता. क्रायो ईएम की तुलना में, OpNS एक उच्च throughput तरीका प्रदान करता है और प्रोटीन और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 6 की एक विस्तृत विविधता की जांच कर सकते हैं. हालांकि, OpNS अभी भी अपने नुकसान की है. पारंपरिक एन एस की तुलना में, OpNS जरूरत पर जोर देता: नमूना तैयार करने में मैं) अधिक जटिल कदम; द्वितीय) एक रेडियोधर्मी पदार्थ, UF का उपयोग; iii) की वजह से है क्योंकि इसके प्रकाश संवेदनशीलता के UF दाग की कम शक्ति के लिए ताजा दाग रखने; चतुर्थ) वर्षा UF समाधान -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत और उपयोग करने से पहले विगलन आवश्यकता जाना चाहिए को रोकने के लिए; वी) और अंत में सभी UF खतरनाक अपशिष्ट के रूप में नियंत्रित किया जाना चाहिए. क्रायो ईएम की तुलना में, OpNS अपेक्षाकृत कम संकल्प छवियों और किसी भी अभी तक नहीं की खोज विरूपण साक्ष्य के लिए कोई गारंटी नहीं प्रदान करता हैभविष्य में.
लिपोप्रोटीन rouleaux गठन पर एन एस आपरेशन प्रक्रियात्मक प्रभाव
ड्रॉप द्वारा ड्रॉप 16, और वाशिंग प्रक्रियाओं 29, 55 मिश्रण: परीक्षा 16,29-36,55 के लिए प्रोटीन की तैयारी के लिए एन एस प्रोटोकॉल तरीकों 50 की तीन प्रमुख समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है. मैं) मिश्रण प्रोटोकॉल एक विशिष्ट अनुपात में दाग और प्रोटीन नमूना की प्रारंभिक मिश्रण की आवश्यकता है, और फिर अंत में ईएम परीक्षा 55 के लिए हवा सुखाने से पहले फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त समाधान को हटाने, एक ग्रिड पर लेपित कार्बन फिल्म पर मिश्रित समाधान को लागू करने. द्वितीय) ड्रॉप द्वारा ड्रॉप प्रोटोकॉल बाद में दाग की एक बूंद (~ 4 μl) के आवेदन से पहले अतिरिक्त नमूना समाधान को हटाने, ~ 1 मिनट के लिए कार्बन दे बैठने में लेपित एक EM ग्रिड से सीधे (~ 4 μl) नमूना बूंद लागू करना शामिल ग्रिड के एक ही पक्ष पर समाधान. ऊष्मायन के ~ 1 मिनट के बाद, Exces हटानेसाफ फिल्टर पेपर के साथ संपर्क के माध्यम से दाग, अंत में हवा सुखाने 16,56-58 के लिए प्रस्तुत करने. iii) धोने प्रोटोकॉल (चित्रा 7) तो सही फिल्टर पेपर 3,29,30 से अतिरिक्त समाधान हर बार हटाने के बाद विआयनीकृत पानी के साथ तीन बार धोने, 1 मिनट के लिए कार्बन में लेपित एक EM ग्रिड के लिए नमूना समाधान आवेदन की आवश्यकता होती है. OpNS प्रोटोकॉल इस धोने की प्रक्रिया से संशोधित किया गया था.
एन एस दाग प्रकार और लिपोप्रोटीन rouleaux गठन पर प्रभाव
एन एस में, भारी धातु दाग को मजबूत इलेक्ट्रॉन बिखरने प्रोटीन 17-20,59 से विपरीत प्रदान करते हैं. एन एस नमूने इसके अलावा अधिक से अधिक विकिरण खुराक ग्रस्त हैं, और एक तेज नकारात्मक विपरीत 8,9,60 द्वारा प्रोटीन सुविधाओं में वृद्धि कर सकते हैं. भारी धातुओं के धब्बे के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है: phosphotungstic एसिड (पीटीए) 16 सहित, anionic, methylamine Tungstate 14 और सिलिकॉन Tungstate 61; और कटियनऐसे uranyl एसीटेट (यूए) 62, UF 3,29,30, और uranyl नाइट्रेट (यूएन) 63 के रूप में आईसी,. सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है कि anionic एन एस दाग की एक पीटीए 33,64-67 है. 7.5 – पीटीए आम तौर पर एक पीएच 7.0 के आसपास है, जो कि heteropoly एसिड, है. पीटीए भी सकारात्मक धुंधला 3,16,68 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पीटीए की नकारात्मक आरोप दोनों लिपोप्रोटीन और liposome सतहों पर सकारात्मक POPC तरह, सिर समूहों का आरोप लगाया असंतृप्त लिपिड, साथ electrostatic बातचीत में मध्यस्थता कर सकते हैं. पीटीए भी नियमित बफर लवणता 29,30 (चित्रा 1) के तहत इस बातचीत 29,30 के माध्यम से rouleaux गठन के कारण हो सकता है. ऐसे यूए, UF और संयुक्त राष्ट्र के रूप में uranyl दाग, विशेष रूप से अक्सर जैविक नमूनों 62,69,70 की एक किस्म की एन एस के लिए इस्तेमाल किया जाता है cationic भारी धातुओं के दाग और UA के लिए वैकल्पिक विकल्प हैं. प्रयोगों UF ऐसे POPC के रूप में असंतृप्त वसा अम्ल लिपिड होते कि लिपो प्रोटीन का कोई rouleaux का कारण बनता पाया. हालांकि, UF अभी roule उत्पन्न हो सकता हैऐसे dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) और 1 hexadecanoyl-2-octadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (PSPC) के रूप में संतृप्त फैटी एसिड लिपिड होते कि लिपोप्रोटीन पर औक्स गठन. इस बातचीत का विस्तृत तंत्र अज्ञात है. यूए / UF / संयुक्त राष्ट्र कम पीएच मान पर सभी काम 3.5-4.6 लेकर कर सकते हैं. इस तरह कम पीएच मान पीएच 14,71 के प्रति संवेदनशील हैं कि कुछ जैविक अणुओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. दिलचस्प है, यूए / UF एक अज्ञात तंत्र 72 के माध्यम से कुछ मिसे के भीतर प्रोटीन संरचना को ठीक कर सकते हैं. पीटीए के विपरीत, यूए / UF एक एसिड से एक नमक के समान है.
(: 0.3 एनएम, संयुक्त राष्ट्र: ~ 0.5 एनएम UF) 3,74 UF कथित जिसमें, UF और संयुक्त राष्ट्र दाग यूए की तुलना में छोटे अनाज के आकार के है, यूए 73 की तुलना में बेहतर परिणाम दे सकता है. UF पालन करके नकारात्मक दाग अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया गया था जब एक दिलचस्प उदाहरण, एक छोटे प्रोटीन (53 केडीए CETP) के माध्यमिक संरचना की तरह विवरण सीधे कच्चे micrographs से देखे जा सकते हैंपहले क्रायो सकारात्मक धुंधला (क्रायो पी एस) विधि (चित्रा 8) 6 की सूचना दी. क्रायो में PS, दाग नमूना माध्यमिक संरचनात्मक पतन का कारण हो सकता है जो OpNS प्रोटोकॉल में क्रायो ईएम नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के बजाय सुखाने प्रक्रिया का पालन करते हुए जमे हुए फ्लैश था. क्रायो पुनश्च छोटे प्रोटीन 75 के उच्च विपरीत और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक विधि है. क्रायो पुनश्च छवियों सूचना दी क्रायो एन एस प्रोटोकॉल 22 से उन लोगों की तुलना में इसके विपरीत उलट, लेकिन पारंपरिक क्रायो EM छवियों से उन लोगों के लिए सुसंगत छवि के विपरीत है है, इस प्रकार यह क्रायो पुनश्च विधि नामित किया गया था. क्रायो पुनश्च छवियों धुंधला अभिकर्मक, uranyl formate, धुंधला केवल बाहरी सतह की संरचना की कल्पना कर सकते हैं कि पारंपरिक देखने को चुनौती देने, आणविक सतह कि प्रवेश दिखा. uranyl formate आणविक सतह प्रवेश कैसे की व्यवस्था अज्ञात है. एक संभावना यह uranyl कटियन उपलब्ध प्रोटीन carboxyl समूहों बांधता है, और इस प्रकार हैकांच का बर्फ आसपास के जिससे एक सकारात्मक दाग के रूप में अभिनय, प्रोटीन और uranyl समूहों का धुंधला की तुलना में कम घनत्व की है. क्रायो पुनश्च विधि एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी 76-78 में चरण समस्या को हल करने के लिए एक साझा दृष्टिकोण था जो कई ्र प्रतिस्थापन (मीर) विधि के समान है. मीर में, क्रिस्टल नमूने अपने मूल रूप को एक isomorphic फार्म प्राप्त करने के लिए, यूरेनियम सहित एक भारी परमाणु समाधान, साथ भिगो कर रहे हैं. भारी परमाणु के अलावा कभी कभी क्रिस्टल गठन या इकाई सेल आयामों को प्रभावित लेकिन क्रिस्टल संरचना निर्धारण 76-78 की अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है. UF के छोटे अनाज से लाभांवित करके, क्रायो पुनश्च विशेष रूप से लगभग सभी प्रोटीन समाधान में स्वाभाविक रूप से गतिशील और विषम हैं कि जब विचार, प्रोटीन संरचना के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है जो एक ही प्रोटीन, के एक उच्च विपरीत और उच्च संकल्प छवि प्रदान कर सके. इस क्रायो पुनश्च विधि के सत्यापन के लिए, हम उन्हें क्षेत्र से किसी भी अंधा परीक्षण के लिए खुला. </p>
लिपो प्रोटीन में rouleaux गठन पर नमक एकाग्रता प्रभाव
परंपरागत पीटीए नकारात्मक धुंधला अभिकर्मक का उपयोग करना, मनाया rouleaux गठन के अधिक होने की संभावना के बजाय प्रोटीन बातचीत के लिपिड बातचीत से संबंधित है. काफी लवणता (0.5 एम NaCl), मध्यम लवणता (0.25 एम NaCl), अपेक्षाकृत कमजोर लवणता (0.1M NaCl), और शुद्ध पानी (9 चित्रा) के तहत तैयार POPC liposome पुटिका के नमूने इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन micrographs rouleaux गठन किया गया था दिखाने नमक एकाग्रता (- डी चित्रा 9A) के लिए सहसंबद्ध. UF के रूप में नकारात्मक धुंधला अभिकर्मक का उपयोग करना, कोई rouleaux जल्दी धुंधला एक जरूरी है सही से पहले नमक एकाग्रता कम करने के लिए धोने की प्रक्रिया, सुझाव POPC liposome पुटिका नमूना 30 (चित्रा 2L) में मनाया गया था, लेकिन संबंधित POPC में rouleaux को रोकने के लिए नहीं स्वतंत्र रूप से पर्याप्त कदम नमूने.
<p class="Jove_content"> मंदिर इमेजिंग छोटे प्रोटीन एक के पास SCHERZER फोकस हालत की आवश्यकता है.उच्च संकल्प पर छोटे प्रोटीन का सफल मंदिर इमेजिंग दो महत्वपूर्ण शर्तों, एक उचित बीम संरेखण और एक के पास SCHERZER फोकस अधिग्रहण हालत की आवश्यकता है. मैं) एक उचित बीम संरेखण एक अपेक्षाकृत उच्च defocus के तहत अधिग्रहीत एक कार्बन फिल्म छवि के फूरियर स्थानांतरण पर दिखाई Thon छल्ले (सत्ता स्पेक्ट्रम) की संख्या के माध्यम से आंका जा सकता है. किरण की बेहतर संरेखण हालत, अधिक Thon अंगूठियां देखे जा सकते हैं और एक के पास SCHERZER फोकस के तहत औसत दर्जे का .. द्वितीय) हासिल छवि एक अन्य की हालत गंभीर है. जैविक नमूने छवि के विपरीत 79 में वृद्धि कर सकते हैं – (2 माइक्रोन और भी अधिक 1), जैविक नमूनों इमेजिंग के लिए एक पारंपरिक मानक रणनीति आमतौर पर उच्च defocus का इस्तेमाल करता. यह रणनीति है, जो अक्सर मुश्किल सामग्री के परमाणु संकल्प संरचना इमेजिंग के लिए विशिष्ट रणनीति से अलग महत्वपूर्ण हैएक के पास SCHERZER फोकस (~ 50 एनएम defocus) का इस्तेमाल करता है. एक उच्च defocus जैविक नमूने इसके विपरीत मजबूत बनाने सकता है, उच्च संकल्प संकेतों आंशिक रूप से सफाया हो जाएगा. नतीजतन, उच्च संकल्प संकेत की मिलीभगत एक उच्च defocus इमेजिंग हालत में कम होगा. कारण मंदिर छवि नमूना संरचना के कनवल्शनफ़िल्टर्स और साधन CTF है, कि है. CTF वक्र अक्सर उच्च आवृत्ति पर शून्य आयाम को पार डोलती जिसमें आवृत्ति, के खिलाफ एक oscillating वक्र है. हर बार CTF शून्य भर में, इस विशिष्ट आवृत्ति पर नमूना संरचनात्मक संकेत (शून्य बार किसी भी संख्या शून्य हो जाएगा) का सफाया हो जाएगा. इस आवृत्ति में सफाया संकेत किसी भी CTF सुधार एल्गोरिथ्म (बजाय मूल संरचनात्मक संकेत के किसी भी यादृच्छिक संख्या में हो सकता है एक शून्य से विभाजित एक शून्य) द्वारा बरामद नहीं किया जा सकता. उच्च defocus इमेजिंग के तहत, CTF, और अधिक आक्रामक तरीके से, इस प्रकार CTF एक परिणाम के रूप में, अधिक बार शून्य आयाम पार हिलाना होगाविशिष्ट आवृत्तियों की एक बड़ी संख्या में संरचनात्मक संकेतों का सफाया हो जाएगा. समाप्त हो जाते हैं कि अधिक संकेत, कम मिलीभगत छवि होगा. विशेष रूप से, छवि की मिलीभगत बरामद या किसी भी CTF सुधार करके सही नहीं किया जा सकता. हालांकि, अलग defocuses तहत अधिग्रहीत incompleted छवियों के एक नंबर भी एक परमाणु संकल्प 9-12 प्राप्त किया जा सकता है जिसमें एक औसत विधि, के माध्यम से नमूना संरचना के प्राप्त एक पूरा संरचनात्मक संकेत करने के लिए एक दूसरे को अपने अंतराल को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
औसतन विधि कुछ अत्यधिक सममित प्रोटीन और संरचनात्मक संबंधित कठोर प्रोटीन की संरचना को प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. हालांकि, यह अभी भी विशेष रूप से इस तरह के एंटीबॉडी और HDLs के रूप में संरचनात्मक गतिशीलता और लचीला प्रोटीन, के लिए, छोटे और विषम प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन में चुनौती बनी हुई है. औसतन प्रोटीन कणों की संरचना और रचना लेकिन डि में समान हैं कि इस धारणा पर आधारित हैfferent झुकाव में, लेकिन कई प्रोटीन समाधान में thermodynamic अस्थिरता से गुजरना करने के लिए जाना जाता है. पहले से प्रोटीन thermodynamic अस्थिरता उतार चढ़ाव जाने बिना औसतन पद्धति लागू करके, औसतन संरचना अक्सर डोमेन 10,80 या क्रायो ईएम पुनर्निर्माण में संकल्प 81 में स्थानीय भिन्नता लापता हो सकता है.
एक एकल प्रोटीन के छोटे प्रोटीन के 3D पुनर्निर्माण को प्राप्त करने में सफलता, जैसे 53 केडीए CETP, और 3 डी संरचना, जैसे 160 केडीए IgG1 एंटीबॉडी, एक उचित संरेखण शर्त के तहत लगभग SCHERZER फोकस इमेजिंग हालत का उपयोग करने से लाभ. छवि के विपरीत लगभग SCHERZER ध्यान केंद्रित छवियों में कम लगता है, इसके विपरीत आसानी से बस पृष्ठभूमि में उच्च आवृत्ति शोर को कम करने के लिए कम से गुजारें छानने लगाने से बढ़ाया जा सकता है. हम मानते हैं, के पास SCHERZER छवियों अधिकतम संरचनात्मक संकेतों ले ध्यान देते हैं, और कण संरेखण की शुद्धता बढ़ाने और effi वृद्धि कर सकते हैंएकल कण 3 डी पुनर्निर्माण और व्यक्तिगत कण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी पुनर्निर्माण में ciency.
The authors have nothing to disclose.
हम संपादन और टिप्पणियों, और डीआरएस के लिए डॉ मिकी यांग धन्यवाद. सहायता के लिए लेई जांग और बो पेंग. इस काम विज्ञान का कार्यालय, ऊर्जा के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग के मूल ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय (कोई. डे AC02-05CH11231 अनुबंध), राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान (द्वारा समर्थित किया गया कोई . R01HL115153), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (कोई. R01GM104427).
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SYRINGE: 1ML NORM-JECT | VWR | 89174-491 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491 |
Syringe filter: 0.2 μm | VWR | 28145-487 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487 |
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) | Whatman | 6809-1002 | http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx |
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Parafilm: 4 in. x 125 ft. | VWR | 470152-246 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A |
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh | Pacific Grid-Tech | Cu-300CN | http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon |
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh | EMS (Electro Microscopy Sciences) | CF200-Cu | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx |
Tweezer: Dumont Tweezer L5 | EMS (Electro Microscopy Sciences) | 72882-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5 |
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System | EMD Millipore | Milli-Q Advantage A10 | http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117 |
Filter Paper: Grade 1 circles | Whatman | 1001-090 | http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx |
Aluminum Foil | NA | NA | Any type |
Glow Discharge Unit | Ted Pella | 91000 | http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors | VWR | 89174-520 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520 |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors | VWR | 89174-524 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524 |
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips | VWR | 37001-528 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528 |
Pipet | Pipetman | F161201 and F167300 | http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx |