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最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

Published: August 15, 2014 doi: 10.3791/51087
Automatic Translation
1, 1, 1
1Lawrence Berkeley National Laboratory, The Molecular Foundry

Summary

以上のタンパク質の半分以上は、電子顕微鏡像および三次元再構成の両方に挑戦している小タンパク質（分子量<200 kDa）のである。最適化されたネガティブ染色は、高いコントラストと異なる生理学的条件下で小さな非対称のタンパク質または複合体の比較的高い解像度（〜1 nm）の画像を得るため、堅牢かつ高スループットのプロトコルである。

Abstract

200 kDaの - タンパク質の構造決定は、むしろ40との間の分子量を有するタンパク質に挑戦されています。天然タンパク質の半分以上40との間の分子量を有することを考慮すると- 200 kDaの1,2、ナノメートル分解能で堅牢でハイスループット方法が必要である。ネガティブ染色（NS）電子顕微鏡法（EM）は、しばしば、タンパク質構造およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調べるために研究室で使用されている、容易に迅速、かつ定性的なアプローチである。残念ながら、従来のNSプロトコルは、多くの場合、特に通常連銭の成果物を提示形成リポタンパク質と、タンパク質上の構造的な成果物を生成します。標準としての低温電子顕微鏡（クライオEM）からのリポタンパク質の画像を用いて、NS試料調製条件の重要なパラメータは、最近スクリーニングし、最適化されたNSプロトコル（のOPN）、改変された従来のNSプロトコル3として報告した。 ROのようなアーティファクトuleauxが大きく、さらに、（1付近）合理的に高解像度とともに高コントラスト小さく、非対称タンパク質の画像を提供する、のOPNによって制限され得る。これらの高解像度と高コントラストの画像が電子線トモグラフィー4,5のメソッドを介して、そのような160 kDaの抗体のような個別のタンパク質（単一のオブジェクトなし平均）3D再構成のためであっても好適である。さらに、のOPNは、小さなタンパク質のサンプルの数百を調べるためのハイスループットなツールとなります。例えば、53kDaのコレステリルエステル転送タンパク質（CETP）の以前に公表メカニズムは、試料6の何百ものスクリーニングおよびイメージングを含んだ。低温電子顕微鏡はめったに成功したイメージを考えると、タンパク質未満200 kDaのは、100以上のサンプル条件をスクリーニング伴う任意の調査を公開するために、まだ持って、それが小さなタンパク質を研究するためのハイスループット法のOPNを呼び出すことが公平である。うまくいけば、ここで紹介するのOPNプロトコルは、Eの境界をプッシュするための有用なツールとなりますMは、小さなタンパク質の構造、ダイナミクスとメカニズムへのEM研究を加速します。

Introduction

タンパク質の機能を理解することは、タンパク質構造の知識を必要とする。 200kDaの - 構造の決定は、その分子量40内にあるタンパク質のための挑戦である。 X線結晶学は、タンパク質結晶化によって制限されます。低温電子顕微鏡（クライオEM）は、分子量が小さい両方のイメージ取得及び小タンパク質の三次元（3D）再構成、の困難を有している核磁気共鳴（NMR）分光法は、40キロダルトン未満の分子量に制限されている200kDaのより。現在の方法は、新しい方法が必要とされ、このサイズのタンパク質を研究に挑戦しているように、200 kDaの1,2 -注目すべきことに、50％以上のタンパク質が、40の範囲内の分子量を有する。

ほとんどの透過型電子顕微鏡（TEMは）は原子分解能、 すなわち、より優れた3オングストロームの分解能が可能であるが、生物学的サンプルからでも、近くにナノメートルの分解能構造を達成することはなく、チャレンジVolです変7。放射線損傷、低コントラスト構造の偏差ならびに脱水などのアーティファクトは全て、高分解能TEM像3,8を妨げる。

さまざまなTEMアプローチの中では、低温電子顕微鏡は、近い生理的条件下9-12の下で対称性の高い大規模な巨大分子の原子分解能構造を達成するための先進的かつ最先端の方法です。低温電子顕微鏡試料は、その後、液体窒素やヘリウム温度13として極低温で結像されるガラス質氷中に巨大分子を埋め込 ​​む、試料溶液を凍結フラッシュを調製する。サンプルがない成果物を提示しておらず、構造8-12にほぼネイティブという点で、低温電子顕微鏡が有利で ​​ある。低温電子顕微鏡は、その欠点を持っているは、i）追加のデバイスをインストールする必要または低温電子顕微鏡機能のための標準的なTEM装置をアップグレードするために購入されている。デバイスが含まれる：抗汚す人、クライオホルダー、低用量モードソフトウェアおよび低用量センシ電性CCDカメラ、これらのデバイスの価格はTEM機器自体の価格よりもはるかに低いものの; ii）の低温電子顕微鏡操作はNS動作よりも長い時間を必要とする。液体窒素温度の操作、サンプル充電、撮像ドリフト、温度勾配、低用量：クライオEMは、さらなる困難を、アドレス指定が必要であるため低温EMを調べると、試料は、多くの場合、試験片を作成し、NSよりもTEM機器を操作するために長い時間を必要とするモデル操作、サンプルの放射線感受性および投与量の制限。少数の低温電子顕微鏡画像は、確かにバランスの取れた温度勾配を用いて調製器具との低温電子顕微鏡の専門家が1時間以下で得ることができるが、これらの余分なステップは、NSデータの取得に比べて有用なデータを取得する速度が遅くなります。 ⅲ）ユーザーは、このような撮像procの中で、低温電子顕微鏡グリッド、低用量の操作、線量測定を凍結し、液体窒素を取り扱う充電を取り扱い、漂流や知識などの追加のトレーニングを必要とするディエッサー;異なるTEMセッション中に同じクライオ試料に対する反復可能なイメージングの静脈）の欠如。低温電子顕微鏡標本を簡単にTEM装置から/への検体搬入出時の氷の汚染による損傷を受ける。この損傷は、試料が14精製/単離することが困難であり、特に懸念される。 v）の小タンパク質（<200 kDaの分子量）が低いためコントラストが画像化されるべき挑戦しています。 vi）の低温電子顕微鏡像のコントラストが低いと、高い雑音は、特に構造的に可撓性のあるタンパク質について、タンパク質方位、コンフォメーションおよび分類の決定に全体の精度を低下させるため、画像間の相互相関値を減少させ、自然に溶液中に変動する4,5。

ネガティブ染色（NS）は、任意の研究室では、任意のタイプのEMで、タンパク質の構造を調べるために利用することができ、比較的「古代」と歴史的な方法である。ブレンナーとホーンは、最初のコンセプトoを開発Fウイルス15を検査するための半世紀前に陰性染色。 NSは、荷電重金属塩で試料をコーティングによって達成される。この概念は、もともと光学顕微鏡と負の画像16を表示する際に、より高い画像コントラストを可能にする、検体の周りに暗闇を提供する染色液に細菌を埋め込 ​​む習慣から来る。重金属イオンは、タンパク質17-20に低密度の原子に比べて電子を分散させるためのより大きな能力を有し、かつコーティング重金属染色は、改善されたコントラストの高い投与量の制限を可能にするからである。 NS標本を容易に粒子配向の決定と低温電子顕微鏡からの画像より三次元再構成のための高コントラスト画像8を提供することができます。

伝統NSは、残念ながら、そのような一般的な集約、分子解離、平坦化および8,21,22スタッキングなどの汚れ-タンパク質相互作用によって誘導される成果物を生成することができます。脂質関連proteのためにそのようなリポタンパク質16,23-30、積み重ね、連銭（ 図1）31-36に一緒にパックされた粒子で一般的なアーティファクトの結果としてプラグ、。そのような非変性ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動のような多くのリポタンパク質の研究、低温電子顕微鏡は、すべてのショーのリポタンパク質粒子が分離された粒子の代わりに、自然に積み重ねられている質量分析39,41、および小角X線回折データ42、13,29,37-40研究一緒に連銭21,29,30,35,42-45を形成する。従来のNSによる連銭形成の観察は、おそらくアポリポタンパク質（アポ）とソリューション13,29,30,46-49標準NSプロトコルに対する感度で構造的に柔軟であるリン脂質から構成されるリポタンパク質間の動的な相互作用によって引き起こされる。このアーティファクトを識別するために、アポリポタンパク質E4（アポE4）パルミトイル - オレオイルホスファチジルコリン（POPC）、高密度リポタンパク質（HDL）のサンプルは、試験サンプルとな凍結とした一連の条件で調製したNS検体をスクリーニングアーティファクト無料で標準29のEM画像。 NSおよびクライオEMから得られた粒径及び形状を比較することにより、染色試薬および塩濃度の特定のタイプは、周知の連銭現象を引き起こすつの重要なパラメータであることが見出された。このように、最適化されたネガティブ染色（のOPN）プロトコルが報告された。

のOPNでは、アポHDLのよく知られた連銭現象はのOPN（ 図2A）によって除去した。統計分析は、低温EMからのものと比較して、大きさと形状でのOPNの収量は非常に類似した画像（5％未満の偏差）を示した、しかし、コントラストが排除された。のOPNの検証が8.4ナノメートル（ 図2C）、アポA-Iの7.8ナノメートル（ 図2B）を含むリポタンパク質試料のほぼすべてのクラスまたはサブクラス6,29,30,50,51、の連銭アーティファクトの除去を検査することによって行われた、9.6 nmのDiscoidal再構成HDL（のrHDL）（ 図2D）、9.3 nmの球形のrHDL（ 図2E）、ヒト血漿HDL（ 図2F）、脂質を含まないアポA-I（ 図2G）、血漿HDL（ 図2H）、低密度リポタンパク質（LDL ）（ 図2I）、中間密度リポタンパク質（IDL）（ 図2J）、超低密度リポタンパク質（VLDL）（ 図2K）、およびPOPCリポソーム（ 図2L）30。 6,29、および柔軟性の高い160kDaのIgG抗体（ 図4AおよびB）4,5,29 -追加の検証が53 kDaのコレステリルエステル転送タンパク質（CETP）（C図3A）を含む、小さな非対称のタンパク質を画像化することにより行った、52、および2つの構造的によく知られているタンパク質、GroELおよびプロテアソーム（ 図2MおよびN）。 Cからの追加の認証を要求するためのolleagues、私たちはこののOPN方法上の任意のブラインドテストに開放されています。

のOPNハイスループットプロトコルはまた、CETPは、リポタンパク質の4つのクラスに再結合HDL相互作用を含む直列条件下で各種タンパク質（に結合したようなCETPの小さなタンパク質のサンプル数百を調べる介してタンパク質のメカニズムを研究するために使用されているように、血漿HDL、LDLおよびVLDL、と/ 3分、20分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間および72時間を含め9インキュベーション時間の下2抗体、H300及びN13、なしで、 0.5、1：1,1：2,1：4のモル比、 すなわち、1の下4、及び3の希釈、 すなわち、0.1 mg / mlの0.01 mg / mlの0.001 mg / mlの、および追加の対照試料を含む異なる人物による上記実験のトリプルテスト）6,29単独CETP、LDL単独、単独VLDL、。のOPN CETPの画像は、合理的に細かい構造の詳細で高コントラストな画像を提供した。私たちが正常に53 kDaのSMAの3次元密度マップを再構築することができますL1タンパク質CETP（ 図3D - F）単一粒子再建による。私たちは、単一の（一つのオブジェクトなし平均）のIgG抗体の3D構造の中間解像度（〜1.5 nm）を達成するために許可され、 -さらに、高コントラストのOPN画像は、個別のタンパク質（C図4A）から私たちに十分な信号を提供5 -個別の粒子の電子断層撮影（IPET）メソッド（J図4E）を介して。 IPET再構成戦略、方法、ステップバイステップのプロセスおよび構造的変動解析の詳細な説明は、以前4に報告された。 RAW画像と中間結果を含むIPET抗体再建手続きについての映画は、3D密度マップと構造のドッキングもYouTubeで5にアップロードすることによって公衆に利用可能であった。異なる個別の抗体の粒子からの3次元再構成の比較は、タンパク質のダイナミクスと、cを開示する可能性があります化学反応の4,5時にonformational変化。

kDaの1,2 200、これらの小さなタンパク質を画像化の成功は、のOPN法が小さく、非対称の構造決定や機構の発見に向けて、従来のEM境界をプッシュするための有用なツールであることを証明-タンパク質の50％以上が40の範囲の分子量を持っていることを考慮すると、 。したがって、詳細なプロトコルは以下のように提供される。

Protocol

1％新鮮なネガティブ染色溶液の調製（w / v）の

  1. 暗い部屋、またはボックスに100ミリリットルの脱イオン水を入れたガラス瓶に1mgのウラニルギ（UF）粉末を入れてください。
  2. 暗い部屋/ボックス中、室温で溶液でO / N撹拌する。解決策を打つからの光を防ぐために、アルミホイルで液ボトルを包みます。
  3. 0.2μmのを通して穏やかに溶液を濾過（孔径）フィルターを5 mlシリンジに取り付けられた。濾過した溶液は、いくつかのアルミ箔カバーさファルコンチューブに回収した。フィルターシリンジは、光の露出を防ぐためにアルミホイルでラップしなければなりません。
  4. 0.02ミクロン（孔径）のフィルターを通して再び溶液を濾過1mlシリンジに取り付けられた。濾過した溶液を2ミリリットルバイアルに採取し、アリコートした。シリンジおよびバイアルを、使用前にアルミニウム箔で覆われている。
  5. 直ちに液体窒素を充填した容器の中にバイアルを沈める長い取っ手の鉗子を用いて一定分量バイアルを凍結後に溶液を濾過した。
  6. ストレージおよび将来の使用のために-80℃の冷凍庫に凍結したバイアルを転送します。

ネガティブ染色Workstationおよびインキュベーションステーションの調製

  1. RTに設定した水浴中で1％UF溶液のバイアルを解凍する。アルミ箔は、光への暴露を防止するために、バイアルの周囲に巻き付けたままであることを確認してください。
  2. それは完全にアルミ箔を使用して解凍だ後に溶液を濾過0.02μmのフィルターを装着した1ml注射器を包んだ。バイアルをラップされた新しいアルミホイルに濾過された溶液を収集し、利用を待っているキャップに覆わアイスボックス内の氷の上に置いた。
  3. 空の蛋白質結晶化プレートの表面上に〜8インチの長いパラフィルムシートを押して指で解プレートを作成します。それは〜直径5mmの円形プレートの行を生成します。各行に6版を作る含まれている氷の内側平坦化された氷の表面にパラフィルムプレートを配置小胞体蓋、染色ワークステーションなど。
  4. 各行の右側の3枚のプレート上でのUFソリューションフィルタリング各行の左3枚のそれぞれ、ピペット〜35μlの上にピペット〜35μlの脱イオン水。タンパク質を染色する前に、光への曝露を防止するための蓋付きの染色ワークステーションをカバー。
  5. 氷空のボックスを半充填することによってEMグリッド培養ステーションを用意し、次支持ベース上に搭載することができ、ハンガーに付着した。ピンセット」のヒントは近くの氷表面である、ハンガーのサンプルピンセットを配置します。半分はボックスリップ高さでピンセット」のヒントをカバーしています。培養ステーションを作るために理想的なアイスボックスは空のピペットチップコンテナを使用しています。

3のOPN操作

  1. 10秒間、300メッシュの銅EMグリッドをコーティングされた薄い炭素膜をグロー放電。
  2. ピンセットでグリッドをピックアップし、氷の上に45°のチルト、1インチでグリッドを保​​つことによってハンガーにピンセットをフック培養ステーション内面。
  3. 〜0.01〜0.005 mg / mlでの最終タンパク質濃度でダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DBPS）とのタンパク質試料を希釈する。預金〜4μlを直ちにEMグリッドの炭素側の希釈後の試料を希釈した。 （タンパク質がDPBSに敏感である場合DPBSは別のバッファに変更することができる）
  4. 培養ステーション内部に約1分間のEMグリッド上のサンプルをインキュベートする。
  5. 迅速濾紙でグリッドのエッジに触れるを通して余分な溶液を除去します。
  6. 過剰な溶液は、EMグリッド上で除去した直後にパラフィルムシートの上に、純水表面の最初の一滴（〜35μl）をに迅速にグリッドをタッチします。そして、濾紙で速やかに過剰の水を除去する。
  7. パラフィルムの残り2水滴が上のEMグリッドを洗浄することによってさらに2回繰り返し、ステップ3.6（試料は水に非常に敏感である場合は、手順3.6と3.7をスキップすることができます）。
  8. EM GRIフロートEMグリッド上の余分な水分を除去した直後に、UF液の最初の一滴の表面には、直ちにdは。そして、10秒間インキュベートする。 UF液面にグリッドを浮遊する前に、3秒以内に水洗手続きを完了してください。洗浄時間が短いほど、より良い品質は次のようになります。
  9. 3回 - 〜2用ろ紙にヒントを貫通してピンセットを清掃してください。
  10. 濾紙でグリッドのエッジを接触させることを通じて、グリッド上の過剰な溶液を除去した後、UFの番目のドロップにグリッドを浮く。
  11. 第2の液滴の段差3.10の上に進みます。
  12. UF液の第三の液滴にグリッドをフロートし、約1分間の染色ステーションをカバーしています。
  13. オプションの手順：3.6で説明したように水の上に速やかにグリッドを洗う。この追加のステップは、ロードされた自由な金粒子や汚れの背景の上に含むサンプルの利益になる。
  14. 目にろ紙をタッチすることにより、過剰の溶液を除去（カーボン側の反対側）の電子グリッド全体の裏側。右濾紙に吸収液を観察した後、室温で窒素ガスの穏やかな流れの下でグリッドを乾燥させる。
  15. ペトリ皿の内側のろ紙のシート上にグリッドを配置し、室温で少なくとも30分間乾燥キャップを部分的に料理をカバーしています。いくつかのサンプルについては、時間ベーク40℃のインキュベーターでグリッドを配置します。
  16. 調べる将来のEMのためのEMグリッドボックスにグリッドを保​​管してください。

調査4。EM

  1. グリッド上の小さなタンパク質のEM検査の前に、適切に、TEMを合わせます。
    1. TEMが適切に位置合わせされたかどうかを決定するアモルファスカーボン膜のパワースペクトルで最も高い可視トーンリングの解像度を確認する。 TEMは、多くの異なるユーザーによって共有されるため、TEMは、多くの場合、正しく配置されていません。
    2. 慎重にアライメントconditioを調整するために、試料の炭素膜領域上のパワースペクトルを確認マシンのnの。最上位の可視トーンリングは、ターゲットと解像度よりも優れています。
      注：120 kVの高張力下で動作のLaB 6フィラメントTEMの適切な位置合わせの一例として、20以上のトーンリングは、可視化することができる、対応する解像度が5.0オングストロームよりも良好であることができる。このトーンリングは〜1.6μmでかつ20.4電子/ A2（ 図5）の用量のデフォーカス下で撮像されたアモルファスカーボン膜のフーリエ変換により達成した。
      注：高解像度トーンリングの観察が必要な状態ではなく、適切な位置合わせのために十分な条件である。実際に高解像度の画像を達成するために、多くの他のパラメータは、サンプルの品質、放射線損傷、充電及びドリフトならびに照射線量率としても重要である。
  2. 理想的に染色された領域に小さなタンパク質を画像化するために近いシェルツァーフォーカスに戻ってフォーカスを持参してください。
  3. 虚部を「曇天」エリアを検索メール。理想的に染色された領域は、通常、汚れの厚さは、通常、均等に炭素被覆グリッド（ 図6）上に分布していないので、グリッド上の「曇天」エリアのように見える厚い染みエリアの端の近くに位置しています。一般的に低倍率（<100×）は、第1の撮像のために、ズームインする前に、これらの曇った分野を見つけるのを助けることだった。

Representative Results

のOPNの実装は、以下のようなさまざまなリポタンパク質の種の構造的および形態学的検査が含まれる：発生期の組換えHDL（のrHDL）、球状組換えHDL、血漿HDL、LDL、IDLおよびVLDL（図2）30;そのような53kDaのCETP（首尾EMを通して画像最小のタンパク質の中で）（図3）6と160kDaのIgG抗体などだけでなく、小さなタンパク質（最もダイナミックで異質タンパク質の一つ）（図4）4,5,29,52でも28kDaの脂質無料アポリポタンパク質A-1（図2L）、およびGroELおよびプロテアソーム（図2MおよびN）。

ハイスループット法としてのOPNの他の例は、53 kDaのCETPように、タンパク質のメカニズムの解明のためのタンパク質 - タンパク質相互作用を検討している。冒頭で述べたように、CETPは、リポタンパク質の異なるサブクラスとどのように相互作用するかinvestigaだったテッドは私たちの知る限り、400以上のEM標本6を調べる経由で、スクリーニングに約100の異なる条件を必要とする低温電子顕微鏡研究のような場合はありませんでした。

のOPNは小さく、非対称のタンパク質立体構造を研究し、さらには3D構造が（平均化せずに）単一および個別のタンパク質を形成達成するために拡大して、EMの境界を拡張することができます。例えば、IgG抗体は、中間解像度で3D再構成を達成することが挑戦された非常に柔軟な構造を有する160kDaの分子である。のOPN方法は、チルト角（図4EおよびH）の一連の画像を個別のIgG抗体を使用した。 4,5 -個別の粒子の電子断層撮影（IPET）（J図4E）によって単一のタンパク質を正常に再構築のために許可されたのOPNから合理的に高解像度と高コントラストタンパクイメージ。 IPET 3D再構成では、 〜14.1Å（図4FおよびG）4の解像度で3D密度を達成するために、その後、逐次近似再構成を経由して、その算出したグローバルセンターに整列させた。同じアプローチでは、単一の抗体-ペプチド複合体を再構築した、そして単一の抗体粒子の内部ドメインのコンフォメーション変化を誘導したペプチド（図4IとJ、解像度〜16.6Å）4,5発見されました。異なる個別の粒子からの3D再構成を比較すると、構造解析は、私たちは、タンパク質の熱力学的な変動を明らかにすることを可能にし、さらに化学反応4,5,29,53,54の中間段階を「スナップショット」。

要約すると、40kDaの間の分子量を有するタンパク質 - 200 kDaのは、標準的なEM構造的な検査や再構成のために挑戦しています。考慮すると、50％を超えること40からの範囲の分子量があるタンパク質- 200 kDaの1,2、私たちは小さな非対称構造決定、さらには機構研究に向けて、従来のEM境界をプッシュする、堅牢かつ高スループットのツールとしてのOPN方法を報告している。

図1
従来のネガティブ染色（NS）、EMによるリポタンパク質の1ルーローアーティファクト図 。 （パネル下）電子（パネル上）の顕微鏡写真と選択された粒子は、標準的なミックス手続きの下でリンタングステン酸（PTA）とNSの後に連銭と、各種リポタンパク質を示しています。のApoE4を持つ（A）再構成HDL（のrHDL）、（B）はアポA-I含有9.6 nmの円板状のrHDL、（C）は、血漿LDL、（D）非アポリポタンパク質含有POPCリポソームを含むアポ。バー：50nmである。ウィンドウのサイズ：AとC、20 NM; Bは30nm。脂質研究のジャーナルが最初にこの作品29,30を発表した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
最適化されたネガティブ染色（のOPN）EMによる図2。タンパク質構造の電子顕微鏡写真のOPNによって連銭アーティファクトなしに、さまざまなリポタンパク質およびリポソームを示し、（A）アポE4含有のrHDL;（B）7.8ナノメートルのrHDL（C）8.4ナノメートルのrHDL;（ D）9.6ナノメートルのrHDL（E）9.3 nmの球状のrHDL;（F）ヒト血漿α-HDL、（G）、血漿HDL;（H）ヒト血漿LDL、（i）ヒト血漿IDL;（J）ヒト血漿VLDL; ;（L）脂質自由アポA-I。追加の検証は（M）GroELおよび（N）プロテアソームサンプルを用いて行った。顕微鏡写真（上のパネル）および（パネル下）選択された粒子。バー：50nmである。ウィンドウのサイズ： - Dは20nm; EとF、25ナノメートル; G、20ナノメートル; H、25nmの; I、50ナノメートル; JおよびKは100nm; L、80nmで。、脂質自由アポA-I、GroELおよびプロテアソームを除いて、本研究は、もともと脂質研究29,30のジャーナルに掲載されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図CETPの3のOPN電子顕微鏡写真。 （A）CETP（破線の円）との概要顕微鏡写真バナナ形状の粒子。（B）Windowe生の粒子を選択dは。明らかに他の小型·軽量化と、より狭い先端（左パネル）を含め大きく、重く、大きな球状の先端を示す（C）三つの生のCETP粒子画像、少ない全体的な曲率を有する類似した末端領域を示す上面図（中央CETP（右パネル）の長軸を上下のパネル）、およびエンドビュー（D）結晶構造（PDB重ね。これらの原料CETPの粒子画像に2OBD）は、とすることができる方位を示す両方の構造形状及びドメインサイズでよく一致するほぼ直接類似度（相互相関計算を計算する（ アブイニシオプロセスを自由2Dクラス平均を参照コンピュータ（（C）にパネルを対応する）。（E）であっても援助なしで定義された）これらのランダムに配向された粒子の、粒子を有する互いに高い類似性は、グループ化された整列した後、バックグラウンドノイズを低減するために平均化し、粒子画像詐欺を強化したtrast。参照の無料の2Dクラス平均は、ない任意のヒト作ら初期モデルは、このクラスの平均値に関与されたEMANパッケージにrefine2D.pyソフトウェアによって計算されます。参照クラスの平均）は、単一粒子の再構成からの3D再構成を検証するための独立した方法として使用することができる。（F）選択基準フリー2Dクラスの平均が他に比べてより大きな遠位端を示す。（G）スーパーインポーズ結晶構造（PDB ：、オーバーレイ画像は、構造の形状やドメインサイズ（低いパネル）の両方で結晶構造とリファレンスのないクラスの平均と近くの一致を参照自由の平均値に2OBD）の比較を示した（F）でCETPの3次元密度マップ。 13オングストロームの分解能は、のOPNおよび単一粒子再構成法（上部パネル）および結晶構造（低いパネル）によるこの単一粒子の再構成にドッキング隆起体によって撮像された粒子8,879から再構成した。 DET画像前処理、初期モデル、精密化手順、角度分布とフーリエシェル相関（FSC）を含む単一粒子再構成のailed情報は、方法の項に出版された原著論文の補足情報（H）単一粒子の再構築の最終比較（パネル上）と追加のPDBフィット比較（下のパネル）6。バー：A、50ナノメートル; B - Dは10nm; F、3nmで。これらの図の一部は、以前にネイチャーケミカルバイオロジー6に掲載されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4のOPN画像およびヒトIgG 1抗体粒子の再構成。 （A）以上ヒトIgG1抗体のOPN画像の表示。粒子は、3のサブドメインを有する粒子を表示明確に白丸で示す。（B）手動で生粒子のエッジを周囲雑音を低減して高解像度の5個体非結合抗体の粒子の原画像および（C）それらの対応するノイズ低減画像を選択（タッチなし簡単に可視化するための粒子内部の密度）。（D）と同様にEM画像を表示するに配向されたIgG1抗体の結晶構造（PDBエントリー1IGT）。対応する画像の比較は、EM画像およびドメインの位置と形状を含む結晶構造、間に多くの共通の特徴を示している。（E）単一インスタンスIgG1抗体からの第一原理 3D再構成のステップ·ツーステップ手順（なし平均、一つの個別オブジェクト）の個別粒子電子断層撮影（IPET）メソッドを使用して、（F）シ最終的な3D再構成14.1オングストロームの分解能でngle抗体粒子が「Y」字状に形成する3つのドーナツ状の領域を示した。（G）は、それぞれのドメイン密度マップの対応するそれぞれにドメインの結晶構造をドッキングし、手動でドメイン間のループを繰り返す。（H）と IPETによる単一のIgG-ペプチド複合体（なし平均、一人の個人のオブジェクト）の3次元再構成のステップ·ツーステップ手順（I）のIgGペプチド複合体の最終的な3D再構成は、16.6オングストロームの分解能で表示されていた3ロッドを示した「Y」字状に形成する形のドメイン（J）は、それぞれ、各IgG抗体ドメインの結晶構造（PDBエントリー：1IGT）をドッキング。各棒状密度には不十分インナードメイン構造変化を示唆して、ドメインの結晶構造とのマッチングが示されたペプチド結合の後。詳細な手順は、解像度解析と統計は、元の論文に記載された4に掲載さと科学の5を報告します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
ツァイスリブラ120のLaB 6 TEMにより1.6μmのデフォーカス下で撮像されたアモルファスカーボン膜の図5パワースペクトル。高解像度イメージングは、EMが適切な位置合わせと高解像度能力を有することを示す十分な証拠を必要とする。グリッド上の近く炭素領域のパワースペクトルの解析は、従来のデータ収集に対するビームのコヒーレンス状態を確認する効率的な方法である。アモルファスカーボン領域の画像のフーリエ変換は、機器関連のコントラスト伝達関数（Cを示す TF）は、そのようにトーンリングと呼ばれる。適切な位置合わせおよびコヒーレンスは、可視トーンリング、比較的高いデフォーカス条件で可視のトーンリングの最高解像度の数によって反映させることができる。 TEM装備のLaB 6フィラメントの近くで適切な位置合わせ条件の一例として、以上〜20以上のトーンリング（〜5Å）炭素膜から生成することができ、用量20.4電子使用してデフォーカスが1.6μmで画像化されている- /Å2。ローエンドTEMから達成トーンリングは、適切な配向状態で運転電界放出銃（FEG）強化TEMとして、ハイエンドのTEMからと類似している。当初は科学的に発表され、この作品は、5を報告します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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のOPNイメージングのための「理想的な」領域の図6の例の顕微鏡写真。つのタンパク質サンプル（A）のGroEL（B）プロテアソーム（C）球状HDLは、イメージングのための理想のOPNを実証する例として使用した。汚れが偏在検体中に分布しているので、サンプルの低倍率は、通常、「曇った」（一番左のパネル）が表示されます。イメージングのための理想的な領域は、通常、これらの「雲」の境界に位置しています。ステップ·バイ·ステップズームインつの「曇った」染色領域（左中パネル）の例は、高倍率画像は、高解像度および粒子の高コントラスト画像（右中パネル）を呈する示す。粒子の選択された画像は、タンパク質の構造の詳細（一番右のパネル）を示す。バー：30nmで大型を見るにはこちらをクリックしてください。この図のRのバージョン。

図7
図7のOPN手順の概略図。 （A）EMグリッド培養ステーション、グロー放電したグリッド上に試料溶液をインキュベートするための簡単なステーション。光に染み曝露を最小限に抑えながら、氷床上記水洗水滴、汚れの液滴を維持するように設計（B）染色ワークステーション。 （C）染色手順の概要を示す：ブロッティング方向、3回水洗、3×UF染色露光、染色液滴上の反転サンプルグリッド染色インキュベーション、および最終裏面サンプルはによって乾燥前にサンプル染色溶液の薄層を確保するためにブロッティング窒素、空気。 番目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図である。

図8
図8ハイ- 53kDaの小さなタンパク質CETPの解像度の画像は、修正のOPN法、クライオ陽性染色（クライオ-PS）から明らかになったファイブを高解像度かつ円形状（逆コントラスト）CETP粒子のソフトマスクされたRAW画像を選択します。および粒子形状を容易に可視化するための原料粒子（原料粒子画像」エッジを囲む手動でノイズ低減が、粒子内の任意の濃度を変更せず）をマスクする。すべての原子とEM画像に各粒子の同様の向きに揃え生粒子をマスキングするためのリボン結晶構造の比較。すべての結晶構造の特徴は、生データから解決することができるが、生の画像領域の高解像度の詳細は、結晶構造を有する一定の類似性を表示する。 Remarka BLY、これらのRAW画像は、両末端での類似性は、手動で縮小ノイズ画像（三角形）で見られ、近くに小さな円形の穴を有する終了示し;また、粒子画像内のC末端領域における鎖は結晶構造を補完βシート（矢印）、そして最後に、CETP C末端領域上の突出ループが結晶構造（菱形）でに似ている。（A）五セレクト（逆コントラスト）CETP粒子の高分解能及び円形ソフトマスクされた生の画像（B）10aにフィルタリングするローパス。（C）20aにフィルタリング高いローパス。（D）を手動でノイズ低減画像をマスクされた。（E）リボン構造による結晶構造比較。すべての原子表現による（F）結晶構造の比較。バー：5nmの。この作品の一部はネイチャーケミカルバイオロジー6に掲載されました。痩せ細っ ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9
図9塩分が異なるの下で、従来のNSプロトコル（PTA染色）により連銭形成を示すリポソームの電子顕微鏡写真。 （A）高塩分（〜0.5 MNaCl）。（B）正規塩分（〜0.25のNaCl）。（C）低塩分（〜0.1MのNaCl）。（D）純粋な水。顕微鏡写真（パネル上）と示した（パネルの下）を選択し、ウィンドウの粒子。バー：100nmである。ウィンドウのサイズ：80 nmの。脂質研究のジャーナルは、もともとこのワーク30を発表した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

従来のNS技術と比較して、のOPNは、小さなタンパク質の信頼性および妥当な高分解能（〜1nmの）構造的な詳細（ 図2）を提供する、連銭アーチファクト（ 図1,9）を防止することができる。クライオEMと比較して、のOPNは、高スループットの方法を提供し、タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互6の多種多様を調べることができる。しかし、のOPNはまだ欠点があります。従来のNSと比較して、のOPNは伴う：試料調製におけるⅰ）より複雑な工程; ⅱ）放射性物質、UFを使用した。 ⅲ）により、その光感度のUF染色の短い効力に新鮮な汚れを保つ。 iv）の沈殿がUF溶液は-80℃で保存し、使用前に解凍を必要としなければならない防止するため; v）は、最終的にすべてのUFが有害廃棄物として処理する必要があります。低温電子顕微鏡と比較して、のOPNは、どのまだ発見しないアーティファクトのために比較的低解像度画像のない保証を提供します将来的には。

リポ蛋白連銭形成に対するNS操作手続きの効果

29滴ずつ16、55を混合し、洗浄手順：試験16,29-36,55ためのタンパク質を調製するためのNSプロトコルは、方法50の三つの主要なグループに分類することができる。 i）の混合プロトコルは、特定の比率で染色し、タンパク質試料の予備混合を必要とし、そして最後にEM試験55用の空気乾燥の前にろ紙で過剰な溶液を除去し、グリッド上にコーティングされた炭素膜上に混合溶液を塗布する。 ⅱ）滴ずつプロトコルは、その後、汚れの降下（約4μl）を塗布する前に、過剰な試料溶液を除去し、約1分間の炭素せる座り込みでコーティングEMグリッドに直接（〜4μl）のサンプル降下を適用することを含むグリッドの同じ側のソリューションを提供します。インキュベーションの約1分後、excesを削除清潔なろ紙との接触を通じての染色は、最終的に空気乾燥16,56-58のために提出する。 iii）の洗浄プロトコル（ 図7）、右ろ紙3,29,30によって過剰な溶液を毎回除去した後、脱イオン水で3回洗浄し、1分間炭素でコーティングEMグリッドに試料溶液の適用を必要とする。のOPNプロトコルは、この洗浄手順から変更されました。

NS汚れの種類およびリポタンパク質連銭形成に対する影響

NSでは、重金属による汚れに強い電子散乱は、タンパク質17-20,59からコントラストを提供する。 NSサンプルは、さらに大きな放射線量を受けて、シャープな陰性造影8,9,60によるタンパク質の機能を高めることができる。重金属の汚れのように分類することができるリンタングステン酸（PTA）16を含む、アニオン、メチルアミン、タングステン14およびシリコンタングステン酸61;カチオンそのような酢酸ウラニル（UA）62、UF 3,29,30、および硝酸ウラニル（UN）63などのIC、。最も一般的に使用されるアニオン性NS汚れの一つは、PTA 33,64-67ある。 7.5 - PTAは、通常、pHは7.0で使用されているヘテロポリ酸である。 PTAも陽性染色3,16,68に使用することができます。 PTAの負の電荷は正にリポタンパク質とリポソーム両面に、POPCのような頭部基を、荷電飽和脂質との静電相互作用を媒介することができる。 PTAにも定期的なバッファ塩分29,30（ 図1）の下で、この相互作用29,30を通じて連銭形成を引き起こすことがあります。そのようなUA、UF、国連などのウラニルの汚れは、特に頻繁に生物試料62,69,70のさまざまなNSのために使用されるカチオン性重金属の汚れや、UAのための代替選択肢です。実験は、UFは、POPCなどの不飽和脂肪酸の脂質を含み、リポタンパク質のない連銭の原因が見つかりません。しかし、UFはまだRoule駅を誘導することができるそのようなジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び1 - ヘキサデカノイル-2 - オクタデカノイルのsn-グリセロ-3 - ホスホコリン（PSPC）などの飽和脂肪酸、脂質を含有するリポタンパク質上の補助の形成。この相互作用の詳細なメカニズムは不明である。 UA / UF /国連はすべて3.5から4.6までの範囲より低いpH値で動作することができます。このような低いpH値は、pH 14,71に敏感な特定の生体高分子には適していない場合があります。興味深いことに、UA / UFは、未知のメカニズム72を介して、数ミリ秒以内にタンパク質の構造を修正することができます。 PTAとは異なり、UA / UFは酸よりも塩により類似している。

UFは伝えている、UA 73よりも良好な結果を提供することができ、UFと国連汚れ（UFを0.3 nmの国連：〜0.5 nm）のUAよりも小さい粒子径を有するもの3,74。 UFは、以下によりネガティブ染色試薬として使用したとき興味深い例えば、小さなタンパク質（53 kDaのCETP）の二次構造のような詳細が直接生の顕微鏡写真から視覚化することができる以前のクライオ陽性染色（クライオ-PS）法（ 図8）6 を報告した。クライオ-PSでは、染色された試料は、二次構造の崩壊を引き起こす可能性のOPNプロトコルにクライオEMサンプル調製手順の代わりに、乾燥手順に従うことで瞬間凍結であった。クライオ-PSは、小さなタンパク質75の高コントラスト、高分解能イメージングのための方法である。クライオPS画像が報告されたクライオNSプロトコル22からのものと比較して、コントラストを逆転したが、従来の低温電子顕微鏡像からのものと一致した画像コントラストを持っているので、このようにしてそれが低温のPS法と命名された。クライオのPSイメージは染色試薬は、ウラニル、ギは、染色が唯一の外表面構造を可視化することができるという従来の見解に挑戦し、分子表面に浸透することを示している。ウラニルギ分子表面を貫通する方法のメカニズムは不明である。一つの可能​​性はウラニルカチオンが利用可能なタンパク質のカルボキシル基と結合するため、ということであるガラス質氷を囲む、それによってポジティブ染色として作用するタンパク質とウラニルのグループの染色よりも低密度である。クライオ-PS方式は、X線結晶学76-78の位相問題を解決するための一般的なアプローチであった複数の同形置換（MIR）の方法に類似している。 MIRは、結晶試料は、その天然型と同型のフォームを取得するには、ウランを含む重原子溶液で浸漬さ。重原子の添加は、時には結晶形成または単位セル寸法に影響を与えるが、結晶構造決定76-78の追加情報を提供しない。 UFの小粒の恩恵を受けことによって、クライオ-PSは、特にほぼすべてのタンパク質が溶液中で自然に動的かつ不均一であることを考慮すると、タンパク質の構造研究のために重要である単一のタンパク質の高コントラスト及び高解像度画像を提供することができる。このクライオ-PS法の妥当性確認のために、私たちは、EMフィールドからのブラインドテスト用にオープン。 リポ蛋白中の連銭形成に対する塩濃度の影響

従来のPTAネガティブ染色試薬を用いて、観察された連銭形成が可能性が高い代わりに、タンパク質相互作用の脂質の相互作用に関係している。かなりの塩分濃度（0.5 M NaCl）中で調製POPCリポソーム小胞、適度な塩分濃度（0.25 M NaCl）で、比較的弱い塩分濃度（0.1MのNaCl）、および純水（ 図9）のサンプルを撮像する、電子顕微鏡写真は、連銭形成があっ表示塩濃度（ - D図9A）に相関する。 UFとしてネガティブ染色試薬を使用して、何連銭を素早く右に染色する前に、塩濃度を減少させるために洗浄操作を示唆しPOPC関連で連銭を防止するために必要ではなく、独立して、十分なステップであり、POPCリポソーム小胞のサンプル30（ 図2L）は観察されなかったサンプル。

TEMイメージング小さなタンパク質は、近シェルツァーフォーカス条件を必要とします。

高解像度で小さなタンパク質の成功のTEM画像化は、2つの重要な条件が、適切なビームアラインメントと近シェルツァーフォーカス取得条件を必要とします。 ⅰ）適切なビーム位置合わせが比較的高いフォーカスの下で取得したカーボンフィルム画像のフーリエ変換上で可視トーンリング（パワースペクトル）の数を通じて判断することができる。ビームの整列条件より良い、より多くのトーンリングは、視覚化し、測定可能なことができます.. ii）のニアシェルツァーフォーカスの下に画像を取得するもう一つの重要な条件である。生体サンプル像のコントラストを高めることができる79 - （2μmであり、さらに、1）生物学的標本を撮像するための従来の標準的な戦略は、典型的には、高いデフォーカスを利用する。この戦略は、多くの場合、硬質材料の原子分解能構造を画像化するための典型的な戦略とは異なる重要である近くシェルツァーフォーカス（〜50nmのデフォーカス）を利用する。 、より高いデフォーカス生体試料のコントラストを強化することができるが、高解像度の信号が部分的に除去される。その結果、高解像度の信号の共謀は、より高いデフォーカス撮像条件でより低いであろう。その理由は、TEM画像はサンプル構造および機器CTFの畳み込みである、ということである。 CTFは、曲線が頻繁に高い周波数でゼロ振幅を横切る振動させる周波数に対する振動曲線である。 CTFがゼロを越え、この特定の周波数での試料の構造の信号が（ゼロ回、任意の数がゼロになります）解消されるたびに。この周波数で排除信号は、任意のCTF補正アルゴリズム（ゼロで除算したゼロではなく、元の構造の信号の任意のランダムな数とすることができる）によって回収することはできません。より高いデフォーカス画像化の下で、CTFは、多くはより積極的に、このようにしてCTFは、結果として、より頻繁にゼロ振幅を横切る振動する特定の周波数より多くでの構造の信号が除去される。排除される複数の信号、少ない共謀イメージがあります。注目すべきは、画像の共謀が回収またはCTF補正により補正することができない。しかし、異なるデフォーカス下で取得未完了の画像の数が偶数の原子分解能が9-12を達成できる平均化法を介してサンプル構造の完成した構造的シグナルを得相互にそのギャップを埋めるために使用することができる。

平均化法は、いくつかの対称性の高いタンパク質や構造的に関連した剛性のタンパク質の構造を達成するための強力なアプローチである。しかし、それはまだこのような抗体およびHDLのように、特に構造力学と柔軟なタンパク質について、小さな非対称タンパク質の構造研究では依然として厳しい。平均化は、タンパク質粒子の構造およびコンフォメーションが、ジで同一であるという仮定に基づいているfferent向きで、しかし多くのタンパク質は、溶液中で熱力学的変動を受けることが知られている。以前にタンパク質の熱力学的変動の変動を知らなくても平均化法を適用することにより、平均化された構造は、多くの場合、ドメイン10,80または低温電子顕微鏡再構成における解像度81の局所的な変化を引き起こす可能性が欠落している。

単一のタンパク質の小さなタンパク質の3D再構成を達成する成功のような53 kDaのCETP、および3D構造のような160 kDaのIgG1抗体を、適切な位置合わせの条件に近いシェルツァーフォーカス撮像条件を使用することから利益を得る。画像コントラストは、近シェルツァーフォーカス画像に低いと思われるが、コントラストだけで簡単にバックグラウンドで高周波ノイズを低減するためにローパスフィルタリングを適用することによって高めることができる。私たちは信じて、近シェルツァーフォーカス画像は、最大の構造的信号を搬送し、粒子のアライメントの精度を高め、EFFIを高めることができる単一粒子の3次元再構成と個別の粒子電子線トモグラフィー再構成における効率。

Acknowledgments

私たちは、編集やコメント、および博士博士ミッキーヤンに感謝します。支援のためのレイ張ボー鵬。この作品は、科学局、米国エネルギー省のエネルギー基本科学庁（番号DE-AC02-05CH11231契約）、国立心臓、肺、および国立衛生研究所の血液研究所（によってサポートされていましたなし。R01HL115153）、および国立衛生研究所一般医科学研究所（無。R01GM104427）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stain: Uranyl Formate The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc. 02545-AA http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Syringe: 1 ml NORM-JECT VWR 89174-491 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Syringe filter: 0.2 μm  VWR 28145-487 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) Whatman 6809-1002 http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline SIGMA-Aldrich D8537 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US
Parafilm: 4 in. x 125 ft. VWR 470152-246 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh Pacific Grid-Tech Cu-300CN http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh EMS (Electro Microscopy Sciences) CF200-Cu http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Tweezer: Dumont Tweezer L5 EMS (Electro Microscopy Sciences) 72882-D http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System EMD Millipore Milli-Q Advantage A10 http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Filter Paper: Grade 1 circles Whatman 1001-090 http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Aluminum Foil Any type
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors VWR 89174-520 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
Name Company Catalog Number Comments
Glow Discharge Unit Ted Pella 91000 http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors VWR 89174-524 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips VWR 37001-528 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet Pipetman F161201 and F167300 http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx

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環境科学、90号、小さな非対称タンパク質構造、電子顕微鏡検査、最適化されたネガティブ染色
最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル
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Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized … More

Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51087, doi:10.3791/51087 (2014).

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