Mer enn halvparten av proteiner er små proteiner (molekylvekt <200 kDa) som er utfordrende for både elektronmikroskop bildebehandling og tredimensjonale rekonstruksjoner. Optimalisert negativ farging er en robust og høy gjennomstrømming protokollen for å oppnå høy kontrast og relativt høy oppløsning (~ 1 nm) bilder av små asymmetriske proteiner eller komplekser under ulike fysiologiske forhold.
Strukturbestemmelse av proteiner er ganske utfordrende for proteiner med molekylmasser mellom 40-200 kDa. Tatt i betraktning at mer enn halvparten av naturlige proteiner har en molekylvekt mellom 40 til 200 kDa 1,2, er et robust og high-throughput-metoden med en nanometer oppløsningsevne er nødvendig. Negativ farging (NS) elektronmikroskopi (EM) er en enkel, rask og kvalitativ metode som ofte er blitt brukt i forskningslaboratorier for å undersøke protein-struktur, og protein-protein interaksjoner. Dessverre, konvensjonelle NS protokoller ofte generere strukturelle gjenstander på proteiner, spesielt med lipoproteiner som danner vanligvis presentere rouleaux gjenstander. Ved å bruke bilder av lipoproteiner fra Cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) som en standard, ble de viktigste parametrene i NS prøveopparbeidelse forhold nylig vist og rapportert som den optimaliserte NS-protokollen (OpNS), en modifisert konvensjonell NS-protokollen tre. Gjenstander som rouleaux kan bli sterkt begrenset av OpNS, i tillegg gir høy kontrast sammen med rimelig høy oppløsning (nær 1 nm) bilder av små og asymmetriske proteiner. Disse høy oppløsning og høy kontrast bilder er også fordelaktig for en individuell protein (et enkelt objekt, uten snitt) 3D-rekonstruksjon, slik som et 160 kDa-antistoff, ved å følge prosedyren i elektron tomografi 4,5. Videre kan OpNS være en high-throughput verktøy for å undersøke hundrevis av prøver av små proteiner. For eksempel, tidligere publisert mekanismen for 53 kDa kolesteryl-ester overføringsprotein (CETP) involvert screening og avbildning av hundrevis av prøver 6. Vurderer cryo-EM sjelden vellykket bilder proteiner mindre enn 200 kDa har ennå ikke publisere noen studie som involverer screening over hundre prøveforhold, er det rimelig å kalle OpNS en høy gjennomstrømming metode for å studere små proteiner. Forhåpentligvis OpNS protokoll som presenteres her kan være et nyttig verktøy for å presse grensene for EM og akselerere EM studier i liten protein struktur, dynamikk og mekanismer.
Forstå protein funksjonen krever kunnskap om proteinstruktur. Strukturbestemmelse er utfordrende for proteiner som molekylær massene er innenfor 40-200 kDa. Røntgenkrystallografi er begrenset av protein krystallisering; kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi er begrenset til molekylmasser mindre enn 40 kDa, mens kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har vanskeligheter både bildeopptak og tredimensjonale (3D) rekonstruksjoner av små proteiner, som molekylære masser er mindre enn 200 kDa. Spesielt, mer enn 50% proteiner har en molekylvekt innen området fra 40 til 200 kDa 1,2, som dagens metoder er utfordrende å studere proteiner av denne størrelse, er en ny metode nødvendig.
Selv om de fleste transmisjonselektronmikroskop (TEMS) er i stand til atom-oppløsning, det vil si bedre enn tre en løsning, å oppnå enda en nær nanometer oppløsning struktur fra en biologiske prøver er heller Challenging 7. Stråleskader, lav kontrast, strukturelle avvik, samt gjenstander som dehydrering alle hindre høy oppløsning TEM avbildning 3,8.
Blant ulike TEM tilnærminger, er cryo-EM en avansert og nyskapende metode for å oppnå atom oppløsning strukturer av svært symmetriske store makromolekyler i henhold nærheten fysiologiske forhold 9-12. Den kryo-EM prøve fremstilles flash-frysing prøveløsningen, innebygging av makromolekyler i glasslegemet is, som deretter avbildes ved kryogene temperaturer slik som flytende nitrogen eller heliumtemperatur 13. Cryo-EM er en fordel i at prøvene presentere ingen artefakter og er nesten innfødte i struktur 8-12. Cryo-EM har sine ulemper: i) flere enheter kreves for å bli installert eller kjøpt for å oppgradere en standard TEM instrument for en cryo-EM evne. Enheter inkluderer: anti-contaminator, cryo-holder, lavdose-modus programvare og lavdose sensitive CCD-kamera, selv om prisene på disse enhetene er mye lavere enn prisen på TEM instrument i seg selv; ii) cryo-EM drift trenger lengre tid enn NS drift. Undersøke en cryo-EM prøven ofte krever lengre tid til å forberede prøver og drive TEM instrument enn NS fordi cryo-EM krever adressering ytterligere vanskeligheter, inkludert: flytende nitrogen temperatur drift, sample lading, bildebehandling drift, temperaturgradienter, low-dose modell drift, sample stråling følsomhet og dosering begrensninger. Disse ekstra trinn vil senke hastigheten for å anskaffe nyttige data i forhold til NS datainnsamling, selv om noen få cryo-EM bilder kan sikkert fås i 1 time eller mindre av cryo-EM eksperter med instrumentet forberedt med en balansert temperaturgradient; iii) brukere trenger ekstra opplæring, for eksempel håndtering av flytende nitrogen, frysing cryo-EM rutenett, lavdose drift, dose måling, håndtering lade, drivende og kunnskap i bildebehandling procEssing; iv) mangel på repeterbare bildebehandling for de samme Cryo-prøven under forskjellige TEM økter. Cryo-EM prøver blir lett skadet av is forurensning under prøven lasting og lossing til / fra TEM instrument. Denne skade er spesielt et problem når prøvene er vanskelige å bli isolert / renset 14; v) små proteiner (<200 kDa molekylvekt) er utfordrende å bli avbildet på grunn av lav kontrast; vi) lav kontrast og høy støy av kryo-em-bilder reduserer krysskorrelasjonsverdi mellom bilder, og derfor redusere nøyaktigheten i bestemmelse av protein orienteringer, konformasjoner og grupperinger, spesielt for proteiner som er strukturelt fleksibel og naturligvis svinge i løsningen 4,5.
Negativ farging (NS) er et relativt "gamle" og historisk metode som helst laboratorium, med hvilken som helst type EM, kan utnytte for å undersøke protein-strukturen. Brenner og Horne først utviklet konseptet of negativ farging et halvt århundre siden for å undersøke virus 15. NS oppnås gjennom belegg prøven med ladede tunge metallsalter. Dette konseptet opprinnelig kommer fra lysmikroskopi og praksisen med å bygge bakterier inn i en flekk løsning som gir mørke rundt prøvene, slik at høyere bilde kontrast når du ser det negative bildet 16. Siden de tunge metall-ioner har en større evne til å dispergere elektroner i forhold til mindre tette atomer i proteiner 17 til 20, og belegget tungmetall flekken tillater en høyere dose begrensning med forbedret kontrast. NS prøven kan gi bilder med høy kontrast 8 for enklere partikkel orientering besluttsomhet og 3D rekonstruksjon enn bilder fra cryo-EM.
Tradisjonelle NS, dessverre, kan produsere gjenstander indusert av flekken-protein interaksjoner, for eksempel generell samling, molekylær dissosiasjon, flatere og stabling 8,21,22. For lipid relatert proteins, så som lipoproteiner 16,23-30, en felles gjenstand resulterer i partikler som er stablet og pakket sammen til en rouleaux (figur 1) 31-36. Mange lipoprotein studier, som nondenaturing polyakrylamid gradient gel elektroforese, studerer cryo-EM 13,29,37-40, massespektrometri 39,41, og små vinkel røntgendiffraksjon data 42 alle showet lippoproteinpartikler er isolerte partikler i stedet for naturlig stablet sammen danner en rouleaux 21,29,30,35,42-45. Observasjonen av rouleaux dannelse ved konvensjonelle NS er muligens forårsaket av dynamiske vekselvirkninger mellom lipoproteiner sammensatt av apolipo-proteiner (apo) og fosfolipider som er strukturelt fleksibel i løsning 13,29,30,46-49 og følsomhet for standard NS-protokollen. Å identifisere denne gjenstanden ble apolipoprotein E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) high-density lipoprotein (HDL) prøve brukt som en prøve og cryo-EM bilder for en gjenstand gratis standard 29, screening NS prøvene utarbeidet under en rekke forhold. Ved å sammenligne de partikkelstørrelser og former fremstilt av NS, og kryo-EM, ble den spesifikke type av flekker reagens og saltkonsentrasjon funnet å være to viktige parametre forårsaker de kjente rouleaux fenomener. Således ble en optimalisert negativ farging (OpNS) protokoll rapportert.
Av OpNS, ble den kjente rouleaux fenomenet apoE4 HDL elimineres ved OpNS (figur 2A). Statistisk analyse viste OpNS utbytter meget lignende bilder (mindre enn 5% avvik) i størrelse og form i forhold til de fra kryo-EM, ble imidlertid kontrasten eliminert. Valideringer av OpNS ble utført ved å undersøke eliminering av rouleaux gjenstand av nesten alle klasser eller subklasser av lipoprotein prøver 6,29,30,50,51, inkludert ApoA-I 7.8 nm (figur 2B), 8.4 nm (figur 2C) , 9.6 nm discoidal rekonstituert HDL (rHDL) (figur 2D), 9.3 nm sfærisk rHDL (2E), human plasma HDL (figur 2F), lipid gratis ApoA-I (figur 2G), plasma HDL (figur 2H), low density lipoprotein (LDL ) (figur 2I), middels-density lipoprotein (IDL) (figur 2J), svært lav tetthet lipoprotein (VLDL) (figur 2K), og POPC liposom (figur 2L) 30. Ytterligere valideringer ble utført av tenkelig små og asymmetriske proteiner, inkludert de 53 kDa kolesteryl ester transfer protein (CETP) (figur 3A – C) 6,29, og svært fleksibel 160 kDa IgG antistoff (figur 4A og B) 4,5,29 , 52, og to strukturelt kjente proteiner, GroEL og proteasomet (figur 2 M og N). For å kreve noen ytterligere kontroll og godkjenning fra colleagues, er vi åpne for eventuelle blindtester på denne OpNS metoden.
OpNS som en high-throughput-protokollen er også blitt brukt til å studere protein mekanismen via undersøke hundrevis av prøver av små proteiner, slik som CETP som ble binding til forskjellige proteiner under en serie tilstander (inkludert CETP samspill til fire klasser av lipoproteiner, rekombinert HDL, plasma HDL, LDL og VLDL, med / uten to antistoffer, H300 og N13, under 9 inkubasjonstid, inkludert 3 min, 20 min, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timers, 24-timers, 48 timer og 72 timer, under 4 molare forhold, dvs. 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, og tre fortynninger, dvs. 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml og 0.001 mg / ml, pluss ytterligere kontrollprøver, inkludert CETP alene, LDL alene, og VLDL alene, med trippel tester av ovennevnte eksperimenter av forskjellige personer) 6,29. OpNS bilder av CETP gitt bilder med høy kontrast med rimelig gode strukturelle detaljer; tillater oss å kunne rekonstruere en 3D tetthet kart over 53 kDa SMAll protein CETP (Figur 3D – F) av enkelt partikkel gjenoppbygging. Videre har de høy kontrast OpNS bilder gir oss et tilstrekkelig signal fra en enkelt protein (figur 4A – C), noe som tillot oss å oppnå mellomprodukt-oppløsning (~ 1,5 nm) av et enkelt (ett objekt, uten snitt) IgG-antistoff 3D-struktur via den enkelte-partikkel electron tomography (Ipet) metode (figur 4E – J) 5. Den detaljerte beskrivelsen av Ipet rekonstruksjon strategi, metodikk, trinn-for-trinn-prosesser og strukturelle variasjonsanalyse ble tidligere rapportert fire. En film om Ipet antistoff gjenoppbygging prosedyrer, inkludert RAW-bildene og mellomresultater, 3D tetthet kart og strukturelle docking var også tilgjengelig for offentligheten av lastet opp til YouTube fem. Sammenligning av 3D rekonstruksjoner fra ulike individuelle antistoff partiklene kan avsløre protein dynamikk og conformational endringer i kjemiske reaksjoner 4,5.
Tatt i betraktning at over 50% av proteiner har molekylvekt som strekker seg 40 til 200 kDa 1,2, lykkes i å avbilde disse små proteiner dokumentert at OpNS metoden er et nyttig verktøy for å skyve på konvensjonell EM grensen mot små og asymmetriske strukturbestemmelser og mekanisme funn . Således er den detaljerte protokollen gitt som nedenfor.
Sammenlignet med konvensjonelle NS teknikker, kan OpNS hindre rouleaux artefakter (figur 1 og 9), som gir pålitelig og rimelig høy oppløsning (~ 1nm) strukturelle detaljer av små proteiner (figur 2). Sammenlignet med kryo-EM, gir OpNS en høy gjennomstrømning fremgangsmåte og kan undersøke et bredt utvalg av proteiner og protein-protein interaksjoner 6. Imidlertid har OpNS fremdeles sine ulemper. Sammenlignet med konvensjonelle NS, innebærer OpNS: i) mer kompliserte trinn i prøven forberedelse; ii) ved hjelp av et radioaktivt stoff, UF; iii) å holde flekken friskt på grunn av den kortere potens av UF-flekken på grunn av sin lysfølsomhet; iv) for å hindre nedbør i UF-løsning skal lagres i -80 ° C og krever tining før bruk; v) og til slutt alle UF skal håndteres som farlig avfall. Sammenlignet med cryo-EM, gir OpNS relativt lavere oppløsning og ingen garanti for noen ennå ikke oppdaget artefakti fremtiden.
NS drift prosessuelle effekter på lipoprotein rouleaux dannelse
NS protokoller for å forberede proteiner for undersøkelse 16,29-36,55 kan deles inn i tre hovedgrupper av metoder 50: Blandings 55, drop-by-slipp 16, og vaskeprosedyrer 29. i) blande protokollen krever den innledende blanding av flekken og proteinprøven med en bestemt forhold, og deretter påføre den blandede løsning til karbonfilm belagt på et rutenett, endelig fjerning av overskytende løsning med filterpapir før lufttørking for EM-undersøkelse 55. ii) drop-by-slipp-protokollen innebærer å bruke (~ 4 mL) prøve dråpe direkte til et EM rutenett belagt i karbon la sit for ~ 1 min, deretter fjerne overflødig prøveløsningen før påføring av en dråpe (~ 4 mL) av flekken Løsningen på den samme side av gitteret. Etter ~ 1 min av inkubasjon fjerne excess flekken gjennom kontakt med rent filterpapir, endelig sender for lufttørking 16,56-58. iii) vasking protokollen (figur 7) som krever prøveoppløsning søknad til en EM rutenett belagt på karbon i 1 min, og deretter vasket med deionisert vann tre ganger i rett etter fjerning av overskytende løsning hver gang av filterpapir 3,29,30. OpNS protokollen ble endret fra denne vaskeprosedyren.
NS typer beis og effekter på lipoprotein rouleaux dannelse
I NS, sterkere elektron spredning på grunn av heavy metal flekker gi kontrast fra proteiner 17-20,59. NS prøvene kan i tillegg lider større stråledoser, og forbedre protein funksjoner ved et skarpere negativ kontrast 8,9,60. Flekker av tungmetaller kan klassifiseres som: anioniske, inkludert Fosfovolframsyre (PTA) 16, -metylamin tungstate 14 og silisium tungstate 61; og kationic, for eksempel Uranyl acetat (UA) 62, UF 3,29,30, og uranylnitrat- (FN) 63. En av de anioniske NS flekker som er mest brukt er PTA 33,64-67. PTA er en heteropoly syre, som brukes vanligvis rundt en pH 7,0 til 7,5. PTA kan også brukes til positiv farging 3,16,68. De negative anklager om PTA kan megle elektrostatiske interaksjoner med umettede lipider positivt ladede hode grupper, som POPC, på begge lipoprotein og liposomprøvene overflater. PTA kan forårsake rouleaux formasjon gjennom denne interaksjonen 29,30 selv under vanlig buffer saltholdighet 29,30 (figur 1). Uranyl flekker, som UA, UF og FN er alternative valg for kationiske tungmetaller flekker og UA særlig brukes ofte for NS av en rekke biologiske prøver 62,69,70. Forsøk funnet UF forårsaker ingen rouleaux av lipoproteiner som inneholder umettede fett syre lipider, slik som POPC. Imidlertid kan UF fremdeles indusere rouleaux formasjon på lipoprotein som inneholder mettede fettsyrelipider, for eksempel dimyristoyl-fosfatidylkolin (DMPC) og 1-hexadecanoyl-2-octadecanoylklorid-sn-glycero-3-fosfocholin (PSPC). Den detaljerte mekanisme av denne interaksjonen er ukjent. UA / UF / FN kan alt arbeid ved lavere pH-verdier spenner 3,5 til 4,6. Slike lavere pH-verdier kan ikke egnet for visse biologiske makromolekyler som er følsomme for pH 14,71. Interessant nok kan UA / UF fikse proteinstruktur i løpet av noen få millisekunder gjennom en ukjent mekanisme 72. I motsetning PTA, er UA / UF mer lik et salt enn en syre.
UF velig kan gi bedre resultater enn UA 73, der, UF og FN flekker har mindre kornstørrelser enn UA (UF: 0.3 nm, FN: ~ 0,5 nm) 3,74. Et interessant eksempel sekundærstrukturlignende detaljene i et lite protein (53 kDa CETP) kan visualiseres direkte fra rå mikrografer når UF ble brukt som negativ-flekk-reagens ved å følgetidligere rapporterte kryo-positiv-farging (cryo-PS)-metoden (figur 8) 6. I Cryo-PS, farget prøven var flash frosset ved å følge cryo-EM prøveopparbeidelse prosedyre i stedet for tørkeprosedyren i OpNS protokollen, noe som kan føre til at sekundære strukturell kollaps. Den kryo-PS er en fremgangsmåte for høy kontrast og høy oppløsning avbildning av små proteiner 75. Siden Cryo-PS bildene har snudd kontrast i forhold til de fra den rapporterte cryo-NS protokoll 22, men har konsekvent bilde kontrast til de fra konvensjonelle cryo-EM bilder, slik at det ble kalt cryo-PS metoden. Den kryo-PS-bilder viser at det farvende reagens, Uranyl formiat, trenger inn i den molekylære overflaten, utfordrende den konvensjonelle oppfatning av at fargingen kan visualisere kun den ytre overflatestruktur. Mekanismen for hvordan Uranyl formiat penetrerer den molekylære overflaten er ukjent. En mulighet er at den Uranyl kation binder tilgjengelige protein karboksylgrupper, og dermedomgivende glasslegemet is er av lavere tetthet enn farging av proteinet og uranyl grupper, for derved å fungere som en positiv flekk. Den kryo-PS metoden er lik multippel isomorf erstatning (MIR)-metoden, noe som var en vanlig tilnærming for å løse problemet fase i røntgenkrystallografi 76-78. I MIR, er krystallprøver dynket med en tung atom løsning, inkludert uran, for å få en isomorphic skjema til sin opprinnelige form. Tillegg av den tunge atom noen ganger påvirker ikke krystalldannelse eller enhetscelle dimensjoner, men gir ytterligere informasjon av krystallstrukturbestemmelse 76-78. Ved å dra nytte av de små korn av UF, kan kryo-PS gi en høy kontrast og høy oppløsning av et enkelt protein, noe som er viktig for proteinstrukturstudier, spesielt tatt i betraktning at nesten alle proteiner som er naturlig dynamisk og heterogene i løsning. For validering av denne Cryo-PS-metoden, åpner vi for noen blindtest fra EM-feltet. </p>
Saltkonsentrasjon virkninger på rouleaux formasjonen i lipoproteiner
Bruke tradisjonell PTA negativ farging reagens, er observert rouleaux dannelse mer sannsynlig relatert til lipid interaksjoner i stedet for protein interaksjon. Imaging prøver av POPC liposom-vesikler fremstilt under betydelig saltinnhold (0,5 M NaCl), middels salinitet (0,25 M NaCl), relativt svake saltinnhold (0,1 M NaCl), og renset vann (figur 9), er elektronmikrografer viser rouleaux dannelsen var korrelert til saltkonsentrasjon (figur 9A – D). Ved hjelp av UF som negativ farging reagens, ble det ikke observert i rouleaux POPC liposom-vesikkel prøven 30 (Figur 2L), noe som tyder på at vaskeprosedyren for raskt å redusere saltkonsentrasjonen rett før farging er en nødvendig, men ikke tilstrekkelig uavhengig skritt for å hindre rouleaux i POPC relatert prøver.
<p class="Jove_content"> TEM bildebehandling lite protein krever en nær-Scherzer fokus tilstand.Vellykket TEM avbildning av små proteiner med høyere oppløsning krever to kritiske forhold, en skikkelig strålejustering og en nær-Scherzer fokus oppkjøpet tilstand. i) En riktig stråleinnretning kan bli bedømt ved antall synlige Thon ringer (effektspekter) på Fourier overføring av et filmbilde karbon anskaffet under et forholdsvis høyt for uskarp. Jo bedre justeringen tilstand av strålen, kan jo flere Thon ringene bli visualisert og målbar .. ii) Innhente bilde under en nær-Scherzer fokus er et annet kritisk tilstand. En tradisjonell standard strategi for avbilding av biologiske prøver som vanligvis benytter høy defokuseringen (1 – 2 um og enda mer), som kan øke den biologiske prøven bildekontrasten 79. Denne strategien er vesentlig forskjellig fra den typiske strategi for avbilding av atomstrukturen oppløsning av harde materialer, som oftebenytter en nær Scherzer fokus (~ 50 nm uskarp). Selv om, kan en høyere styrke defokuseringen biologisk prøve kontrast, vil høy oppløsning signaler være delvis elimineres. Som et resultat, ville medvirkning av høyoppløselig signal være lavere ved høyere uskarp avbildning tilstand. Grunnen er at den TEM bildet er foldingen av prøven struktur og instrumentet CTF. Den CTF er en oscillerende kurve mot frekvens, hvor kurven ofte oscilleres krysser null amplitude ved høy frekvens. Hver gang når CTF over null, prøven strukturelle signal ved denne spesifikke frekvens vil bli eliminert (null hvilket som helst antall ganger vil være null). Den eliminert signal ved denne frekvens aldri kan utvinnes ved en hvilken som helst CTF korreksjonsalgoritme (en null dividert med en null kan være en hvilken som helst tilfeldig tall i stedet for den opprinnelige strukturelle signal). Under høyere uskarp avbildning, vil CTF oscillere mye mer aggressivt, krysser således CTF null amplitude oftere, som et resultat,de strukturelle signaler ved et større antall bestemte frekvenser vil bli eliminert. Jo flere signaler som elimineres, jo mindre medvirkning bildet vil ha. Spesielt, kan medvirkning av bildet ikke bli gjenvunnet eller korrigeres av noen CTF korreksjon. Imidlertid kan brukes en rekke ufullstendig bilde ervervet under forskjellige uskarp å fylle sine hull til hverandre for å oppnås et ferdig konstruksjons signal av prøven strukturen via en gjennomsnittsmetoden, hvor enda en atom oppløsning kan oppnås 9-12.
Den gjennomsnitt-metoden er en kraftig metode for å oppnå strukturen av noen svært symmetriske proteiner og som er strukturelt beslektet stive proteiner. Imidlertid gjenstår det en utfordring i det strukturelle studier av små og asymmetriske proteiner, spesielt for strukturelle dynamikk og fleksible proteiner, slik som antistoffer og HDL. Gjennomsnitt er basert på antagelsen om at proteinpartikler er identiske i struktur og konformasjon men different i orientering, er imidlertid mange proteiner kjent for å gjennomgå termodynamisk svingninger i løsning. Ved bruk av gjennomsnittsmetoden uten tidligere å vite proteintermodynamiske svingninger svingninger, kan den gjennomsnittlige strukturen forårsaker ofte mangler domener 10,80 eller lokal variasjon i oppløsning 81 i cryo-EM rekonstruksjoner.
Det lykkes i å oppnå den 3D rekonstruksjon av små proteiner, slik som 53 kDa CETP, og 3D-struktur av et enkelt protein, slik som 160 kDa IgG1 antistoff, drar fordel ved å bruke nær-Scherzer fokusavbildning tilstand under et riktig justering tilstand. Selv om bildekontrasten virker lav i nær-Scherzer fokus bilder, kan kontrasten lett bli forbedret ved ganske enkelt å anvende et lavpass-filtrering for å redusere høyfrekvent støy i bakgrunnen. Vi tror, nær-Scherzer fokusere bildene bære de maksimale strukturelle signaler, og kan øke nøyaktigheten av partikkel justering og forbedre enereffektivitet i single-partikkel 3D rekonstruksjon og enkelt partikkel electron tomography gjenoppbygging.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Mickey Yang for redigering og kommentarer, og DRS. Lei Zhang og Bo Peng for å få hjelp. Dette arbeidet ble støttet av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences i USA Department of Energy (kontrakt nei. DE-AC02-05CH11231), det nasjonale hjerte, lunge og blod Institute of National Institutes of Health (ingen . R01HL115153), og National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health (ingen. R01GM104427).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stain: Uranyl Formate | The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc. | 02545-AA | http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml |
SYRINGE: 1ML NORM-JECT | VWR | 89174-491 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491 |
Syringe filter: 0.2 μm | VWR | 28145-487 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487 |
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) | Whatman | 6809-1002 | http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-Aldrich | D8537 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US |
Parafilm: 4 in. x 125 ft. | VWR | 470152-246 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A |
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh | Pacific Grid-Tech | Cu-300CN | http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon |
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh | EMS (Electro Microscopy Sciences) | CF200-Cu | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx |
Tweezer: Dumont Tweezer L5 | EMS (Electro Microscopy Sciences) | 72882-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5 |
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System | EMD Millipore | Milli-Q Advantage A10 | http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117 |
Filter Paper: Grade 1 circles | Whatman | 1001-090 | http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx |
Aluminum Foil | NA | NA | Any type |
Glow Discharge Unit | Ted Pella | 91000 | http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors | VWR | 89174-520 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520 |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors | VWR | 89174-524 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524 |
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips | VWR | 37001-528 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528 |
Pipet | Pipetman | F161201 and F167300 | http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx |