Summary
Вестибулярная Шванномы (VSS) не являются злокачественные опухоли Шванн клеток (СК) происхождения, связанные с мутациями в гене опухолевого супрессора NF2. Мы сообщаем о воспроизводимой, эффективный протокол для первичных человеческих VS культуре клеток, которая позволяет молекулярной и клеточной экспериментальной манипуляции и анализа и повторяет гетерогенную природу болезни человека.
Abstract
Вестибулярные шванном (VSS) представляют Шванн клетки (СК) опухолей вестибулярного нерва, ущерба 10% всех внутричерепных новообразований. VSs произойти в любом спорадических или семейных (нейрофиброматоз типа 2, NF2) формах, как связанных с инактивирующих дефектов в супрессоров опухолей NF2 ген. Лечение VSS, как правило, хирургическая резекция или радиохирургия, однако заболеваемость таких процедур привела расследования менее инвазивных процедур. Исторически сложилось так, отсутствие доступа к образцов свежих тканей и тем, что шваннома клетки не увековечена значительно затрудняло использование первичных культур для исследования шваннома опухолей. Чтобы преодолеть ограниченный запас первичных культурах, увековечены клеточная линия HEI193 В.С. был сгенерирован трансдукции ВПЧ Е6 и Е7 онкогенов. Это онкогенного трансдукции внесены существенные молекулярные и фенотипические изменения в клетках, которые ограничивают их использование в качестве модели для человека сchwannoma опухоли. Поэтому мы иллюстрируют упрощенную, воспроизводимое протокол для культуры первичных человеческих VS клеток. Это легко освоен метод позволяет для молекулярных и клеточных исследований, которые более точно воспроизводят сложность заболевания VS.
Introduction
Вестибулярные шванном (VSS) представляют Шванн клетки (СК) опухолей вестибулярного нерва, ущерба 10% всех внутричерепных новообразований 1-3. VSs произойти в любом спорадических или семейных (нейрофиброматоз типа 2, NF2) формах, как связанных с инактивирующих дефектов в супрессоров опухолей NF2 ген. Лечение VSS, как правило, хирургическая резекция или радиохирургия, однако заболеваемость таких процедур включает глухота, лица невропатии, утечка спинномозговой жидкости, дисбаланс и опухоли отрастания 1. Кроме того не все пациенты являются приемлемыми хирургические или радиационные кандидатов. Столь значительный заболеваемости, а также отсутствие альтернативных методов лечения загнал расследование уникальной молекулярной биологии VSS в надежде разработке новых методов лечения 3,4.
Клеточные культуры позволяет быстро, легкому, и углубленного анализа молекулярной и клеточной поведения и скрининга потенциального терапевтического комфунтов. Исторически сложилось так, отсутствие доступа к образцов свежих тканей и тем, что шваннома клетки не увековечена значительно затрудняло использование первичных культур для исследования шваннома опухолей. Чтобы преодолеть ограниченный запас первичных культурах, увековечены клеточная линия HEI193 В.С. был сгенерирован трансдукции ВПЧ Е6 и Е7 онкогенов 5. Это онкогенного трансдукции внесены существенные молекулярные и фенотипические изменения в клетках, которые ограничивают их использование в качестве модели для опухолей шваннома человека. SC культуры, полученные из трансгенных линий мышей, которые не имеют функциональный ген NF2 представляют другую альтернативу для расследования УХЛ2-зависимую SC туморогенез в пробирке. Эти культуры, однако не в состоянии повторять гетерогенную природу человека VSS или счета для конкретного поведения человека. Большинство предыдущих методы VS культуры требуется относительно длинные сроки обработки и сложных методов селективного культуры 6-8.Здесь мы представляем простой, воспроизводимый протокол для первичной VS культуре клеток с полной переработки в рамках 3 часов, с 95%-ной чистоты опухолевых клеток, как определяется иммунной окраски.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: использование человеческих образцов опухоли в этом протоколе было одобрено Университета Айовы Institutional Review Board (IRB).
1. Настройка за день до опухоли урожая
- Пальто Сотовые Культура Пластины: В стерильной капот культуре, добавить достаточно поли-L-орнитин (0,01% раствор), чтобы покрыть дно полистирол / пластической культуры хорошо / блюдо, заменить крышки, и пусть сидят при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 часа. Предметные стекла или покровные может быть заменен на полистирола для экспериментов, требующих визуализации.
- Через 2 часа, удалить поли-L-орнитин решение с вакуумом и позволяют пластины полностью высохнуть в стерильной культуры капюшонами. Добавьте достаточно решение ламинин (10 мкг / мл в Ca 2 + / Mg 2 +-свободный HBSS [HBSS-/ -]), чтобы полностью покрыть культуральные планшеты, замените крышки, то либо 1) место в холодном 4 ° C холодильнике в течение ночи или 2) разместить в 37 ° C инкубаторе в течение по крайней мере 2 часов. Если плитыбудут сохранены на ночь или дольше, оберните пластины в полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения / высыхание.
2. Настройка День опухоли урожая
- Подготовка Культура СМИ: Медиа что приготовлено на день урожая и обработки опухоли, хранить при температуре 4 ° С, и нагревают до 37 ° С в инкубаторе непосредственно перед СМИ добавления / изменения.
- Шваннома культуральные среды является высоким содержанием глюкозы (4,5 мг / мл) DMEM (с фенолового красного) с 0,1 мг / мл пенициллина и 0,1 мг / мл стрептомицина; N2 СМИ дополнить конечное разведение 1:100; Бычьего инсулина 5 мкг / мл; Эмбриональной бычьей сыворотки до 10% общего объема. Фильтр все средства массовой информации через 0,22 мкм фильтр.
- Подготовка Транспортировка образцов Cooler: Отправить фразу заполнено кулер с 1-2 (в зависимости от количества опухоли быть собраны) стерильные 50 мл конические пробирки с 25 мл HBSS с Ca 2 + / Mg 2 + (HBSS + / +) в операционную для передачи образца опухоли и транспорта.
- Подготовка Individual опухоли диссоциации трубы - разливают в стерильные 2 мл с круглым дном трубки 1 мл HBSS + / + и место на льду. (Трубы будут использованы для резкого рассечение / диссоциации образцов опухоли).
- Для диссоциации, подготовить около одного диссоциации трубку для каждого 0,5 см 3 заготовленной ткани; например, опухоли образец измерительные 1,0 х 1,0 х 1,0 см (1 см 3) потребуется два ССРХ + / + диссоциации трубки.
- Ультрафиолетовый свет стерилизации: Место ткани ножницы, небольшие щипцы, скальпель ручка, 1x нормально чашку Петри, P1000 пипетки и наконечники для пипеток в стерильной капот культуры и оставить под ультрафиолетовым светом в течение ~ 15 мин до приезда гостя и обработки ткани опухоли.
3. Образец Выделение и Транспорт
- Изолировать образцы опухолевых по хирургической резекции.
- Сразу же место образцы опухолевых в ледяной ССРХ + / + как можно быстрее после снятия с пациента. После того как все Тканье образцы собираются, образцы транспорта (на льду) от оперативного театра в лабораторию для дальнейшей обработки.
4. Ткани Диссоциация и Растирание
- Следуя стандартной стерильных в ламинаре, принести коническую трубку с образцом опухолевых в капот культуры, и мыть образцы путем обращения трубки и опухоль 50x. Разрешить фрагменты падать на дно пробирки, а затем удалить HBSS + / +. Залейте 30 мл HBSS + / +, и агитировать / инвертировать 50x снова. Повторите удаление инверсия / медиа в общей сложности 4x.
- Повторное приостановить фрагментов опухоли в 30 мл HBSS + / +, в последний раз, а затем залить смесь в sterile100 мм чашки Петри, и отдельный опухоли в 0,5 см 3 группировок. Если более крупные фрагменты опухоли встречаются, используйте ножницы ткани или скальпель (# 11 или # 15 блейд), чтобы разрезать на мелкие куски.
- Используйте пинцет, чтобы разместить группы 0,5 см 3 ткани в индивид ССРХ + / + заполнено, 2 мл с круглым дном коническаяаль трубы, все на льду. Используйте ножницы ткани рубить фрагментов опухоли в суб-1 мм фрагменты-подвески должны иметь 'Snowglobe' внешний вид (рис. 1). Фарш опухоли только до тех пор, большинство из фрагментов не являются суб-1 мм; Не 'над-фарш "Образцы опухоли. Поместите полностью фарш ткани трубку обратно на лед, и повторить со всеми дополнительными образцами труб.
- Перенесите все фрагментированные образцы опухоли в единый 15 мл коническую трубку. P1000 пипетки со стерильным наконечником резки / изменение работает хорошо для этого шага. Используйте дополнительные ССРХ + / +, чтобы смыть / промыть 2 мл диссоциации трубы, чтобы убедиться, что все образцы опухоли была собрана в 15 мл трубки. Спином вниз смесь в центрифуге при 23 ° С, при 73 мкг в течение 5 мин.
- Всасывания с HBSS + / +, оставив осадок клеток. Повторное приостановить фрагменты в смеси 1:1 0,25% трипсина: 0,2% коллагеназы (растворенного в HBSS-/ -) - добавить достаточно, чтобы держать фрагментов опухоли в тесном суspension. Заменить винт-топ, и место в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин. Перемешайте смесь клеток, по крайней мере один раз во время инкубации, чтобы сохранить фрагменты в виде суспензии. Поместите питательных сред шваннома в инкубатор, чтобы нагреть его в это время, а также.
- После инкубации 100 мкл FBS в каждую пробирку для инактивации трипсина, а затем образец центрифуге при 23 ° C, 73 мкг в течение 5 мин. С помощью пипетки, тщательно всасывания от столько супернатант, как это возможно, не нарушая осадок клеток. Добавить нагретого культуральной среды (N2/insulin/5% FBS) в опухолевых фрагментов до конечной соотношении 1:02 фрагментов опухоли: культуральные среды (например, если есть 1 мл фрагментов опухоли, добавьте в 2 мл нагревали СМИ).
- Подготовка к опухоли растиранием, сокращая наконечник от наконечника P1000 пипетки до диаметра примерно 1-2 мм. Медленно растирают клеточной суспензии с помощью постепенно все меньше и меньше советы диаметр пипетки, пока вы не можете легко пипетки раствора через unaltEred P1000 пипетки. Сразу перейти к меньшим кончика, как только вы можете легко пипетки решение опухоли через наконечник - не более растирают образца. Если один больше, кусочек ткани блоков аспирации во время растирания, нажав пипетки на дно конической трубе часто позволяет продолжать растирание.
5. Сотовый Покрытие
- Один 0,5 мм 3 фрагмент ткани достаточно, чтобы отобрать 1 х 100 мм блюдо, или 4 х 8-well/4-well горки. Просто перед добавлением смеси СМИ / клеток, удалите ламинин раствора из пластин культуры, но не позволяйте планшеты сухой.
- Для каждого 100 мм блюдо, распустить фрагмент опухоли в 10 мл нагревают культура СМИ.
- Для каждой лунки слайда 4-а, используйте 750 мкл нагревали культура СМИ (3 мл для всей слайде).
- Для каждую лунку слайд 8-а, используйте 400 мкл нагревали культура СМИ (3,2 мл для всей слайде).
- Инкубируют культуры в 37 &# 160; ° C, 100% влажность, 6% СО 2. Оставьте культур в покое в течение по крайней мере 36 часов, а затем изменить носитель если решение пожелтевшей (кислый). В противном случае измените носитель при 72 ч, затем каждые 2-3 дня или когда средства массовой информации стали кислой. Если носитель становится кислой ежедневно в течение нескольких дней подряд, это, как правило признаком возможного бактериального или дрожжевого заражения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Правильное фрагментации опухоли имеет важное значение для оптимального посева и выроста в чашках для культуры ткани (рис. 1). Идентификация шваннома клеток в течение первых дней после посева часто бывает трудно, из-за затемнения количество продуктов распада клеток и красных кровяных телец. К 4-й или 5-й день, расширения клеток вблизи прилипших фрагментов опухоли создаст узнаваемый 'шнуровкой' модели среди обломков. Последующие изменения медиа вообще удалить большинство неадгезивных клеток на второй неделе. С помощью этого метода, 90% слияния можно ожидать между 7-14 дней, в зависимости от начальной жизнеспособности фрагмента опухоли до измельчения и покрытие плотность (рис. 2). Как описано выше, шваннома культуры появляются расти наружу от небольших фрагментов адгезивных фрагментов опухоли 9,10. Такой результат может быть обнаружено к концу первой недели. Рисунок 2 показывает бrightfield визуализации шваннома нарост клеток от одного фрагмента опухоли, изложенной в красный в правом нижнем углу. Рисунок 3 иллюстрирует "связующей" вырост, который происходит между двумя различными фрагментами опухоли, в культуре скважин иммуноокрашиванию с поликлональной кроличьей анти-S100 антитела. Мы регулярно immunostain культур с анти-S100 или анти-р75 NTR антител проверить чистоту культур и точно определить шваннома клетки для анализа (рис. 4). С помощью этих методов более> 95% клеток в этих культурах представляют Шваннома клетки. Шваннома клетки также этикетка с глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) и ErbB2, среди других маркеров 11.
Рисунок 1. Сравнение том же образце опухоли и до (а) и кормовойэ (В) мясорубки. образец, полученный в 1,5 мл HBSS + / + с фенолового красного в 2,0 мл с круглым дном коническую трубку.
Рисунок 2. Типичный вид культур на микроскопии по методу светлого. Веретенообразной шваннома клеток следствием излучается из фрагмента опухоли, изображение, полученное по культуре 10-й день. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 3. Иммуноокрашивание первичных вестибулярных культур шваннома с анти-S100 антитела демонстрируя типичный культуру и клеточной морфологии. А) вид низкой мощности, иллюстрирующий результат от металлизированными фрагментов опухоли, культуры 14-й день Масштаб. Бар = 200 мкм. B) Высшее военнопленныхэ вид шваннома клеток с веретенообразной морфологии, культуры день 14. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 4. Иммуноокрашивание первичных вестибулярных культур шваннома для подтверждения чистоты культуры и самобытности клеток. А) Культуры иммуноокрашиванию с анти-S100 антител. Ядра помечены DAPI. Шкала бар = 100 мкм. B) Культур иммуноокрашиванию с анти-р75 NTR антител. Ядра помечены DAPI. Шкала бар = 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
История в пробирке шваннома культур
Усилия по созданию в пробирке культур шваннома начал всего несколько десятилетий после первоначального невриномы слухового нерва открытая хирургическая резекция произошло в 1894 12. Первые записанные культуры были на Кредель в 1920, который безуспешно пытались расти фарш опухоль на "висит капельным методом" 12 . Позже, д-ра. Мюррей и Стаут опубликовал свой опыт культуры в пробирке с neurilemomas выращенных на свернувшейся плазмы крови человека. Интересно, что эта техника показала, что Антони А и Антони B конкретные фрагменты вырос по-разному, с уникальными клеточной морфологии и дифференциальных ставок агар сжижения 13. Cravioto и Локвуд опубликованы дальнейшие наблюдения культур акустической невриномы в птичьих сгустков на покровного стекла промахи и роликовых труб. Они также были первыми в использовании Rose камеры для покадровой съемки роста опухоли
Преимущества вестибулярного Шваннома первичных культурах
Исследования человеческого шваннома опухолей часто используют однородные увековечены клеточных линий и трансгенных моделей мышей. Такие инструменты являются полезными, но го совсем точно отражает генотипы, фенотипы и сложность человеческих болезней. С другой стороны, первичные культуры вероятно обеспечить более реалистичную модель. Они более точно воспроизводят гетерогенность геномной и молекулярной статуса, связанного с опухолей человека 15.
Чистоту шваннома культур
Задача первичной культуры ткани является поддержание чистоты клеток-мишеней. Шванномы подавляющем большинстве состоят из опухолевых клеток Шванн 6, однако культур не защищены от загрязнения фибробластов. Исторически сложилось так, методы оптимизации падение шваннома клеток чистоты на три категории: 1) отбор по химически определенной среде и специфических факторов роста; 2) иммуноочистки (например, с магнитной сортировки клеток шарик 7), 3) сочетание обоих предыдущих методов. По нашему опыту фибробласты или других не-шваннома клетки обычно содержат менее 5% клеток в Cultuповторно, независимо от пациента характеристик (возраст, пол), спорадические или УХЛ2-связанные опухоли, первичной или вторичной резекции опухоли или кистозные против солидных опухолей. Если фибробласты по всей видимости, взяв на себя культуры, удаление сыворотки в течение 1-2 смены носителя позволит значительно снизить это население без ущерба выживание шваннома клеток. Предварительно обработки поверхностей культуре клеток ламинином также облегчает рост шваннома клеток 9. Минимальный пассажи культур также помогает уменьшить нежелательные сотовой загрязнения - cryostorage лучше завершен в течение первых двух пассирования культуры и культуры эксперименты не рекомендуется за проход 4-5. Мы находим оптимальные результаты при культура экспериментирование завершается прохождения 1-2 с не cryostored клеток.
Мы используем как иммуноокрашивания (анти-S100, DAPI) и микроскопических появление клеточной и ядерной морфологии как меры контроля качества в наших шваннома культур. Иногда этополезно immunostain подмножество культур для моноцитов (CD68) или фибробластов специфических маркеров для дальнейшего проверить чистоту культуры 9. Во время экспериментального анализа поведения клеток (например, оружия или гибели клеток), мы всегда immunostain с анти-S100 или анти-р75 NTR антител проверить, что выводы шваннома клеток конкретных.
Культура морфология и рост клеток
Культуры опухолевых Шваннома обычно отображают уникальные модели роста напоминает Антонио А (высокой плотности клеток, плотно организованы, признаки Verocay образований тела) и редко Антони B (сравнительно редкие ядра, обильные клеточные процессы, менее организация) модели видели в гистопатологии резецированной шванномы опухоли 16. Почти все шваннома клетки отображения классический длинный, растягивался, биполярное форму клеток, связанный как с Шванн и шваннома клеток 6,17 однако другие мобильные морфоLogies, как описано Cravioto (амебоидных Микроглия-подобных клеток, веретенообразных клеток, рэкет-формы клеток, а Кайт формы клеток) иногда встречаются 14. В целом, рост клеток и пролиферация очень медленно в нашей базовой среды (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 дополнения). Добавление известными митогенных факторов, таких как форсколин и β1-нейрегулина значительно увеличивает пролиферацию клеток 18.
Критические шаги протокола
Наш протокол культура шваннома ткань простой и довольно прощать; Однако есть несколько ключевых шагов, которые обеспечивают успех. Во-первых, корректная обработка опухоли имеет решающее значение. Лучшие результаты получаются, когда опухоль находится непосредственно в ледяную HBSS + / +, как можно скорее после удаления из пациента. Это противоречит обычной хирургической практике сбора удаленной опухоли в то стерильного физиологического раствора отправки совокупную ткани для обработки в патологии в конце корпуса. Во-вторых, держать тканей SAMPле так круто, как это возможно во время обработки. Очень важно, что резекция опухоли сохраняется ледяной, и что обработка происходит в целесообразно, насколько это возможно после удаления. Делай, как большая часть обработки ткани, как это возможно на льду, а также. В-третьих, активно мыть образцы опухоли. Это помогает снизить риск бактериального или дрожжевого заражения. В-четвертых, не чрезмерно сладкие опухолевые образцы. Опухоль растирание зависит от полу-субъективной оценки, когда продолжить с меньшим диаметром кончика пипетки P1000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов не раскрывать.
Acknowledgments
Поддержка: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
