Summary
Vestibular schwannomas (VS) son tumores no malignos de células (SC) origen Schwann, asociadas a mutaciones en el gen supresor de tumores NF2. Se presenta un protocolo reproducible, eficiente para la enseñanza primaria humanos VS cultivo celular que permite la manipulación experimental molecular y celular y el análisis y recapitula la naturaleza heterogénea de la enfermedad humana.
Abstract
Schwannomas vestibulares (VSS) representan Schwann células (SC), los tumores del nervio vestibular, lo que compromete el 10% de todas las neoplasias intracraneales. VS ocurre en (neurofibromatosis tipo 2, NF2) formas ya sea esporádica o familiar, tanto asociados a defectos de inactivación del gen supresor tumoral NF2 gen. El tratamiento para la VS es generalmente la resección quirúrgica o radiocirugía, sin embargo, la morbilidad de estos procedimientos ha conducido investigaciones sobre los tratamientos menos invasivos. Históricamente, la falta de acceso a los especímenes de tejido fresco y el hecho de que las células no se inmortalizan schwannoma han obstaculizado significativamente el uso de cultivos primarios para la investigación de la tumorigénesis schwannoma. Para superar la limitada oferta de los cultivos primarios, la línea celular inmortalizada HEI193 VS se generó por transducción con VPH E6 y E7 oncogenes. Esta transducción oncogénico introdujo alteraciones moleculares y fenotípicos significativos a las células, que limitan su uso como un modelo para s humanostumores chwannoma. Por lo tanto, ilustramos un protocolo reproducible simplificado para la cultura de los derechos humanos primaria células VS. Esta técnica permite dominar fácilmente para investigaciones moleculares y celulares que recapitulan con más precisión la complejidad de la enfermedad de VS.
Introduction
Schwannomas vestibulares (VSS) representan Schwann células (SC), los tumores del nervio vestibular, lo que compromete el 10% de todas las neoplasias intracraneales 1-3. VS ocurre en (neurofibromatosis tipo 2, NF2) formas ya sea esporádica o familiar, tanto asociados a defectos de inactivación del gen supresor tumoral NF2 gen. El tratamiento para la VS es generalmente la resección quirúrgica o radiocirugía, sin embargo, la morbilidad de estos procedimientos incluyen sordera, neuropatías faciales, fuga de líquido cefalorraquídeo, el desequilibrio, y el nuevo crecimiento del tumor 1. Además no todos los pacientes son candidatos para la cirugía o la radiación aceptables. Tal morbilidad significativa, así como una falta de terapias alternativas ha impulsado la investigación en la biología molecular única de VS en la esperanza de desarrollar nuevos tratamientos de 3,4.
El cultivo celular permite el análisis rápido, fácil, y en profundidad del comportamiento molecular y celular y la detección del potencial terapéutico comlibra. Históricamente, la falta de acceso a los especímenes de tejido fresco y el hecho de que las células no se inmortalizan schwannoma han obstaculizado significativamente el uso de cultivos primarios para la investigación de la tumorigénesis schwannoma. Para superar la limitada oferta de los cultivos primarios, la línea celular inmortalizada HEI193 VS se generó por transducción con VPH E6 y E7 oncogenes 5. Esta transducción oncogénico introdujo alteraciones moleculares y fenotípicos significativos a las células, que limitan su uso como un modelo para los tumores schwannoma humanos. Culturas SC derivados de líneas de ratones transgénicos que carecen de un gen NF2 funcional representan otra alternativa para investigar la tumorigénesis SC NF2 in vitro dependiente. Estas culturas, sin embargo no pueden recapitular la naturaleza heterogénea de las VS humana o dar cuenta de la conducta humana específica. La mayoría de las técnicas anteriores cultura VS requieren tiempos de procesamiento relativamente largas y complicadas técnicas de cultivo selectivos 6-8.Aquí se presenta un protocolo simple, reproducible para primaria VS cultivo celular con un proceso completo en menos de 3 horas, con un 95% de pureza de las células tumorales como se determina por inmunotinción.
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Protocol
Declaración de Ética: el uso de las muestras de tumores humanos en este protocolo fue aprobado por la Universidad de Iowa Junta de Revisión Institucional (IRB).
1. Configuración del día de antes de la cosecha del tumor
- Placas de cultivo Escudo celulares: En una campana de cultivo estéril, añadir una cantidad suficiente (solución al 0,01%) de poli-L-ornitina para cubrir el fondo de una cultura de poliestireno / plástico y / plato, reemplace las tapas, y deje reposar a temperatura ambiente durante al menos 2 hr. Los portaobjetos de vidrio o cubreobjetos pueden ser sustituidos por poliestireno para los experimentos que requieren imágenes.
- Después de 2 horas, retire el-L-ornitina poli solución con succión y permiten que las placas se sequen por completo en unas capuchas de cultivo estériles. Añadir la solución de laminina suficiente (10 g / ml de Ca 2 + / Mg 2 + libre de HBSS [HBSS-/ -]) para cubrir completamente las placas de cultivo, reemplace las tapas, a continuación, ya sea 1) lugar en fresco 4 ° C refrigerador durante la noche, o 2) colocar en 37 ° C incubadora durante al menos 2 h. Si las placasse almacenará toda la noche o más tiempo, envuelva las placas en una envoltura de plástico para evitar la evaporación / desecación.
2. Configuración del Día del Tumor Harvest
- Preparar Cultura Medios: Medios es recién hecho en el día de la cosecha y el procesamiento del tumor, se almacena a 4 ° C, y se calienta a 37 ° C en una incubadora inmediatamente antes de los medios de comunicación adiciones / cambios.
- Medios de cultivo Schwannoma es de alta glucosa (4,5 mg / ml) de DMEM (con rojo de fenol) con 0,1 mg / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina; Medios N2 complementan dilución final 1:100; Insulina bovina 5 g / ml; De suero fetal bovino al volumen total del 10%. Filtrar todos los medios de comunicación a través de filtro de 0,22 micras.
- Preparar Transporte de muestras del refrigerador: Enviar un refrigerador lleno de hielo con 1-2 (dependiendo de la cantidad de tumor que se recogerá a) 50 ml tubos cónicos estériles con 25 ml de HBSS con Ca 2 + / Mg 2 + (HBSS + / +) a la sala de operaciones para la transferencia de la muestra del tumor y el transporte.
- Preparar indivtubos de disociación tumor iDual - llenan estériles de 2 ml tubos redondos de fondo con 1 ml de HBSS + / + y colocar en hielo. (Tubos será utilizado para disección aguda / disociación de muestras de tumor).
- Para la disociación, preparar aproximadamente un tubo de disociación para cada 0,5 cm 3 de tejido recogido; Por ejemplo, una muestra de tumor de 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm 3) requerirán dos tubos de + / + de disociación de HBSS.
- La luz ultravioleta de esterilización: Tijeras Place tejido, pinzas pequeñas, mango de bisturí, 1x plato normal de Petri, P1000 pipeta y puntas de pipeta en una campana de cultivo estéril y dejar a la luz ultravioleta durante aproximadamente 15 minutos antes de la llegada y el procesamiento de tejido tumoral.
3. Aislamiento de muestras y transporte
- Aislar las muestras de tumor mediante resección quirúrgica.
- Colocar inmediatamente las muestras de tumor en el HBSS enfriado con hielo + / + tan rápidamente como sea posible después de retirarlos del paciente. Una vez que todos tissuSe recogen muestras de correos, el transporte de muestras (en hielo) desde el teatro operativo al laboratorio para su posterior procesamiento.
4. La disociación de tejidos y la trituración
- Siguiendo una técnica estéril estándar en una campana de flujo laminar, traiga tubo cónico con muestras tumorales en la campana de cultivo, y lavar las muestras por tubo y tumor 50x invirtiendo. Permitir fragmentos caigan a la parte inferior del tubo, y luego retire HBSS + / +. Vuelva a llenarlo con 30 ml de HBSS + / +, y agitar / 50x invertir de nuevo. Repetir la extracción de inversión / media para un total de 4 veces.
- Vuelva a suspender fragmentos de tumor en 30 ml de HBSS + / +, por última vez, a continuación, vierta la mezcla en un plato de petri mm sterile100 y tumorales separados en 0,5 cm 3 agrupaciones. Si se encuentran fragmentos de tumor más grandes, use las tijeras de tejidos o bisturí (# 11 o # 15 cuchillas) para cortar en pedazos más pequeños.
- Utilice las pinzas para colocar los 0,5 cm 3 grupos de tejidos en el individuo HBSS + / + lleno, 2 ml de fondo redondo cónicatubos al, todo el hielo. Utilice las tijeras de tejidos para picar fragmentos de tumor en sub-1 mm fragmentos-la suspensión debe tener un aspecto 'globo de nieve' (Figura 1). Picar el tumor sólo hasta que la mayoría de los fragmentos son sub-1 mm; no "sobre-mince 'las muestras tumorales. Coloque el tubo de tejido completamente picada de nuevo en hielo, y repita con todos los tubos de muestras adicionales.
- Transferencia de todas las muestras tumorales fragmentados en un único tubo cónico de 15 ml. Una pipeta P1000 con una punta estéril cortar / modificado funciona bien para este paso. Utilice adicional HBSS + / + para lavar / enjuagar los tubos ml de disociación 2 para asegurarse de que todas las muestras de tumor que se ha recogido en el tubo de 15 ml. Centrifugar la mezcla en centrifugar a 23 ° C, a 73 × g durante 5 min.
- Aspirar fuera HBSS + / +, dejando el sedimento celular. Vuelva a suspender los fragmentos en una mezcla 1:1 de tripsina al 0,25%: 0,2% de colagenasa (disuelto en HBSS-/ -) - añadir lo suficiente para mantener los fragmentos tumorales en estrecha dospension. Vuelva a colocar el tornillo de la parte superior, y el lugar en el 37 ° C incubadora durante 30 min. Agite la mezcla de células al menos una vez durante la incubación para mantener los fragmentos en suspensión. Coloque el medio de cultivo Schwannoma en la incubadora para que se caliente en este momento también.
- Después de la incubación, añadir 100 ml de FBS a cada tubo para inactivar la tripsina, y luego la muestra se centrifuga a 23 ° C, 73 xg durante 5 min. Con una pipeta, aspirar con cuidado tanto sobrenadante como sea posible sin molestar sedimento celular. Añadir los medios de cultivo calentado (N2/insulin/5% de FBS) a los fragmentos de tumor a una relación final de 01:02 fragmentos de tumor: medios de cultivo (por ejemplo, si hay 1 ml de fragmentos de tumor, añadir en 2 ml de calentado los medios de comunicación).
- Prepararse para la trituración del tumor cortando la punta fuera de una punta de pipeta P1000 a un diámetro de aproximadamente 1-2 mm. Poco a poco se tritura la suspensión celular utilizando puntas de pipeta de diámetro cada vez más pequeños y más pequeños, hasta que pueda pipetear fácilmente la solución a través de un unaltpunta de la pipeta Ered P1000. Desplácese inmediatamente a una punta más pequeña una vez que usted puede pipetear fácilmente la solución del tumor a través de la punta - no más de triturar la muestra. Si una sola pieza más grande de bloques de tejido aspiración durante la trituración, tocando la punta de la pipeta en la parte inferior del tubo cónico a menudo permite la trituración continua.
5. Celular Plating
- Un 0,5 mm 3 fragmento de tejido es suficiente para sembrar 1 x 100 mm de plato, o 4 x diapositivas 8-well/4-well. Justo antes de la adición de la mezcla de medios de comunicación / celular, eliminar la solución de laminina de las placas de cultivo, pero no deje que las placas secas.
- Para cada placa de 100 mm, disolver el fragmento de tumor en 10 ml de medios de cultivo calentado.
- Para cada pocillo de un portaobjetos de 4-bien, utilizar 750 l de medios de cultivo calentado (3 ml para toda la diapositiva).
- Para cada pocillo de un porta-8, así, utilizar 400 l de medios de cultivo calentado (3,2 ml para toda la diapositiva).
- Los cultivos se incuban en 37 &# 160; ° C, humedad del 100%, 6% de CO 2. Deje las culturas solo durante por lo menos 36 horas, y luego cambiar los medios de comunicación si la solución está amarilleado (ácido). De lo contrario, cambiar los medios de comunicación a las 72 horas, y después cada 2-3 días o cuando los medios de comunicación se convierten en ácido. Si los medios de comunicación se convierte en ácido al día durante varios días seguidos, esto es generalmente un indicio de contaminación bacteriana o de levadura potencial.
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Representative Results
La fragmentación del tumor correcta es esencial para la siembra óptima y el crecimiento en las placas de cultivo de tejido (Figura 1). Identificación de células schwannoma durante los primeros días después de la siembra es a menudo difícil, debido a oscurecer cantidades de residuos celulares y las células rojas de la sangre. Por el 4 º o 5 º día, las extensiones celulares cerca de fragmentos tumorales adherentes crearán reconocible 'cordón' patrones entre los escombros. Cambios de medio posteriores generalmente eliminan la mayoría de las células no adherentes a la segunda semana. Utilizando este método, 90% de confluencia se puede esperar entre 7-14 días, dependiendo de la vitalidad inicial del fragmento de tumor antes del picado y chapado densidad (Figura 2). Como se ha descrito anteriormente, los cultivos schwannoma parecen crecer hacia el exterior desde pequeños fragmentos de fragmentos tumorales adherentes 9,10. Tal consecuencia es detectable por el final de la primera semana. La figura 2 muestra Bimágenes rightfield de schwannoma crecimiento externo celular desde un fragmento de tumor único, se indica en rojo en la esquina inferior derecha. Figura 3 ilustra la consecuencia "puente" que se produce entre dos fragmentos de tumores diferentes, en pocillos de cultivo immunostained con un anticuerpo policlonal de conejo anti-S100. Rutinariamente immunostain culturas con anti-p75 NTR anticuerpos anti-S100 o para verificar la pureza de los cultivos y positivamente identificar células schwannoma para el análisis (Figura 4). Con estos métodos más de> 95% de las células en estos cultivos representan células schwannoma. Células Schwannoma también etiquetan con la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y ErbB2, entre otros marcadores 11.
Figura 1. Comparación de la misma muestra de tumor tanto antes (A) y de popaer (B) de picar carne. Muestra preparada en 1,5 ml HBSS + / + con rojo fenol en 2,0 ml tubo cónico de fondo redondo.
Figura 2. Aspecto típico de las culturas en la microscopía de campo claro. Fusiformes crecimiento externo celular schwannoma irradia del fragmento de tumor, imagen tomada el día 10 de cultivo. Barra de escala = 100 micras.
Figura 3. Inmunotinción de las culturas schwannoma vestibular primaria con anticuerpos anti-S100 que demuestra la cultura típica y morfologías celulares. A) Bajo el poder ilustrar consecuencia de fragmentos de tumor plateado, cultura día 14. Barra de escala = 200 m. B) pow Superiorvista er de las células con morfología schwannoma spindled, cultura día 14. Barra de escala = 100 micras.
Figura 4. Inmunotinción de las culturas schwannoma vestibular primarias para confirmar la pureza del cultivo y la identidad de la célula. A) Culturas immunostained con anticuerpos anti-S100. Los núcleos están etiquetados con DAPI. Barra de escala = 100 m. B) Cultivos immunostained con anticuerpos anti-p75 NTR. Los núcleos están etiquetados con DAPI. Barra de escala = 100 micras.
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Discussion
Historia de cultivos in vitro Schwannoma
Los esfuerzos por establecer en cultivos in vitro schwannoma comenzaron tan sólo unas décadas después de que el neuroma acústico inicial resección quirúrgica abierta se produjo en 1894 12. Los primeros cultivos fueron grabadas por Kredel en la década de 1920, que intentó sin éxito para crecer tumor triturado por "método de la gota colgante" 12 . Más tarde, los Dres. Murray y Stout publicaron su experiencia de cultivo in vitro con neurilemomas cultivadas en coagulada plasma humano. Curiosamente, esta técnica reveló que Antoni A y Antoni B fragmentos específicos crecieron de manera diferente, con tasas únicas morfología celular y diferenciales de licuefacción de agar 13. Cravioto y Lockwood publicaron nuevas observaciones de las culturas neuroma acústico en coágulos aviar en tiras cubreobjetos y tubos de rodillos. Ellos también fueron los primeros en utilizar cámaras Rose para time-lapse del crecimiento tumoral
Beneficios de las Culturas schwannoma vestibular primarias
Los estudios de tumorigénesis schwannoma humano suelen utilizar líneas de células inmortalizadas homogéneas y modelos de ratones transgénicos. Estas herramientas son beneficiosos, pero do no reflejar con precisión los genotipos, fenotipos, y la complejidad de las enfermedades humanas. Por el contrario, los cultivos primarios probable que proporcionan un modelo más realista. Ellos más fielmente recapitulan la heterogeneidad de estado genómico y moleculares asociados con tumores humanos 15.
La pureza de las Culturas Schwannoma
Un reto de la cultura del tejido principal es el mantenimiento de la pureza de la célula diana. Schwannomas abrumadoramente consisten en células de Schwann neoplásicas 6, sin embargo las culturas no son inmunes a la contaminación de los fibroblastos. Históricamente, los métodos para la optimización de schwannoma caída pureza de células en tres categorías: 1) de selección por medio químicamente definido y factores de crecimiento específicos; 2) inmunopurificación (por ejemplo, con células con perlas magnéticas de clasificación 7), 3) una combinación de los dos métodos anteriores. En nuestros fibroblastos experiencia u otras células no schwannoma comprenden generalmente menos que 5% de las células en el culre, independientemente de las características del paciente (edad, sexo), tumores esporádicos o asociados-NF2, la resección del tumor primario o secundario, o quísticos vs tipos de tumores sólidos. Si los fibroblastos parecen estar tomando el control de la cultura, la eliminación del suero para 1-2 cambios de medio reducirá significativamente esta población, sin afectar negativamente a la supervivencia celular schwannoma. Pre-tratamiento de superficies de cultivo celular con laminina también facilita el crecimiento celular schwannoma 9. Passaging Minimal de las culturas también ayuda a disminuir la contaminación celular no deseada - crioalmacenamiento se realiza mejor en los dos primeros pases de cultivo, y la cultura de experimentación, no se recomienda el paso más allá de 4-5. Encontramos resultados óptimos cuando la cultura de experimentación se completa con el paso 1-2 con células no cryostored.
Utilizamos tanto inmunotinción (anti-S100, DAPI) y el aspecto microscópico de la morfología celular y nuclear como medidas de control de calidad en nuestras culturas schwannoma. De vez en cuandoEs útil inmunoteñir un subconjunto de culturas para monocitos (CD68) o marcadores de fibroblastos específicas para comprobar la veracidad de la cultura pureza 9. Durante los análisis experimentales de comportamiento de la célula (por ejemplo, proliferación o muerte celular), que siempre inmunotinción con anti-p75 NTR anticuerpos anti-S100 o para verificar que los resultados son schwannoma celular específica.
Patrones morfológicos cultura y crecimiento
Culturas tumores Schwannoma suelen mostrar patrones de crecimiento únicas reminiscencias de Antoni A (alta densidad celular, bien organizada, las indicaciones de Verocay cuerpo formaciones) y rara vez de Antoni B (núcleos comparativamente escasos, abundantes procesos celulares, menos organización) patrones vistos en la histopatología de schwannoma resecado tumores 16. Casi todas las células schwannoma muestran el largo spindled forma clásica,, bipolar celular asociada tanto con células de Schwann y schwannoma 6,17 sin embargo otro morfo celularlogías, según lo descrito por Cravioto (Células ameboide Microglia similares, las células en forma de huso, células en forma de raqueta, y células con forma-Kite) a veces se producen 14. En general, el crecimiento celular y la proliferación son muy lentos en nuestro medio de base (DMEM/10% de suplemento FBS/Insulin/N2). La adición de factores mitogénicos conocidos tales como forskolina y β1-neuregulina aumenta significativamente la proliferación celular 18.
Pasos del protocolo críticos
Nuestro protocolo de cultivo de tejidos schwannoma es simple y bastante indulgente; sin embargo, hay varios pasos claves que aseguran el éxito. En primer lugar, la manipulación del tumor correcta es crítica. Esperar mejores resultados cuando el tumor se coloca directamente en HBSS enfriado con hielo + / + tan pronto como sea posible una vez retirado del paciente. Esto es contrario a la práctica quirúrgica habitual de la recogida de tumor resecado en solución salina estéril a continuación, enviar el tejido agregada para el procesamiento en la patología en el extremo de la caja. En segundo lugar, mantener samp tejidoles lo más fresco posible durante el proceso. Es vital que el tumor resecado se mantiene fría con hielo, y que el procesamiento se produce como convenientemente como sea posible después de la extracción. Haz lo que gran parte del procesamiento de tejidos como sea posible en el hielo también. En tercer lugar, lavar agresivamente las muestras tumorales. Esto ayuda a reducir el riesgo de contaminación bacteriana o de levadura. En cuarto lugar, no lo hacen muestras de tumores sobre-pique. Trituración del tumor depende de una evaluación semi-subjetiva de cuándo continuar con un diámetro de la punta de la pipeta P1000 menor.
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Disclosures
No hay conflictos de interés a revelar.
Acknowledgments
Soporte: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
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