Summary
Vestibulaire schwannomes (VSS) sont des tumeurs non malignes de cellules de Schwann (SC) origine, associées à des mutations dans le gène suppresseur de tumeur NF2. Nous rapportons, un protocole efficace et reproductible pour l'homme primaire VS culture cellulaire qui permet la manipulation et l'analyse expérimentale moléculaire et cellulaire et récapitule la nature hétérogène de la maladie humaine.
Abstract
Schwannomes vestibulaires (VSS) représentent cellules de Schwann (SC) des tumeurs du nerf vestibulaire, compromettre 10% de toutes les tumeurs intracrâniennes. Commutateurs virtuels se produisent dans (la neurofibromatose de type 2, NF2) soit formes sporadiques ou familiales, à la fois liés à des défauts d'inactivation du gène suppresseur de tumeur NF2 gène. Le traitement de VSS est généralement la résection chirurgicale ou la radiochirurgie, mais la morbidité de ces procédures a conduit des enquêtes sur des traitements moins invasifs. Historiquement, le manque d'accès à des échantillons de tissus frais et le fait que les cellules ne sont pas schwannome immortalisées ont considérablement entravé l'utilisation de cultures primaires d'enquête de schwannome tumorigenèse. Pour remédier à la quantité limitée de cultures primaires, la lignée cellulaire immortalisée HEI193 VS a été générée par transduction avec le HPV oncogènes E6 et E7. Cette transduction oncogène introduit altérations moléculaires et phénotypiques importantes pour les cellules, ce qui limite leur utilisation comme un modèle pour s humainestumeurs du chwannoma. Nous illustrons donc un protocole reproductible simplifiée pour la culture de cellules primaires humaines VS. Cette technique facile à maîtriser permet enquêtes moléculaires et cellulaires qui récapitulent plus précisément de la complexité de la maladie VS.
Introduction
Schwannomes vestibulaires (VSS) représentent cellules de Schwann (SC) des tumeurs du nerf vestibulaire, compromettre 10% de toutes les tumeurs intracrâniennes 1-3. Commutateurs virtuels se produisent dans (la neurofibromatose de type 2, NF2) soit formes sporadiques ou familiales, à la fois liés à des défauts d'inactivation du gène suppresseur de tumeur NF2 gène. Le traitement de VSS est généralement la résection chirurgicale ou la radiochirurgie, mais la morbidité de ces procédures comprend la surdité, les neuropathies faciales, fuite de liquide céphalo-rachidien, le déséquilibre, et la repousse de la tumeur 1. En outre tous les patients sont candidats à la chirurgie ou de radiothérapie acceptables. Cette morbidité ainsi que le manque de thérapies alternatives a conduit une enquête sur la biologie moléculaire unique de commutateurs virtuels dans l'espoir de développer de nouveaux traitements 3,4.
La culture cellulaire permet une analyse rapide, facile, et en profondeur du comportement et de criblage moléculaire et cellulaire de com thérapeutique potentiellelivres. Historiquement, le manque d'accès à des échantillons de tissus frais et le fait que les cellules ne sont pas schwannome immortalisées ont considérablement entravé l'utilisation de cultures primaires d'enquête de schwannome tumorigenèse. Pour remédier à la quantité limitée de cultures primaires, la lignée cellulaire immortalisée HEI193 VS a été générée par transduction avec E6 et E7 de HPV oncogènes 5. Cette transduction oncogène introduit altérations moléculaires et phénotypiques importantes pour les cellules, ce qui limite leur utilisation comme un modèle pour les tumeurs de schwannome humaines. cultures SC issus de lignées de souris transgéniques qui n'ont pas un gène NF2 fonctionnelle représentent une autre alternative pour enquêter NF2 dépendant tumorigenèse SC in vitro. Ces cultures mais ne parviennent pas à récapituler la nature hétérogène des commutateurs virtuels humain ou d'un compte d'un comportement humain spécifique. La plupart des techniques antérieures de culture VS tenus temps de traitement relativement longs et les techniques de culture sélective complexes 6-8.Nous présentons ici un protocole simple, reproductible pour principal VS culture cellulaire avec un traitement complet en moins de 3 heures, avec 95% de pureté des cellules tumorales tel que déterminé par immunomarquage.
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Protocol
Déclaration d'éthique: l'utilisation des échantillons de tumeurs humaines dans ce protocole a été approuvé par l'Université de l'Iowa Institutional Review Board (IRB).
1. Configuration du jour d'avant tumeur récolte
- Culture Manteau cellulaires Plaques: Dans une hotte de culture stérile, ajouter suffisamment de poly-L-ornithine (0,01% solution) pour couvrir le fond d'une culture polystyrène / plastique et / plat, remplacer les couvercles et laisser reposer à température ambiante pendant au moins 2 h. Les lames de verre ou des lamelles couvre-objet peuvent être substitués pour le polystyrène pour des expériences d'imagerie nécessitant.
- Après 2 heures, retirer la poly-L-ornithine solution par aspiration et les plaques permettent de sécher complètement dans un hottes de culture stériles. Ajouter la solution de laminine assez (10 pg / ml dans le Ca 2 + / Mg 2 + sans HBSS [HBSS-/ -]) pour couvrir complètement les plaques de culture, replacer le couvercle, puis soit 1) lieu dans un endroit frais 4 ° C réfrigérateur pendant la nuit, ou 2) placer en incubateur 37 ° C pendant au moins 2 h. Si les plaquesseront stockées une nuit ou plus, envelopper les plaques dans une pellicule de plastique pour éviter l'évaporation / dessiccation.
2. Configuration de la Journée de la tumeur récolte
- Préparer Culture Média: Média est fait frais le jour de la récolte et de la transformation tumorale, conservé à 4 ° C, et chauffé à 37 ° C dans l'incubateur immédiatement avant médias ajouts / modifications.
- des milieux de culture de schwannome est haute glucose (4,5 mg / ml) DMEM (avec du rouge de phénol) avec 0,1 mg / ml de pénicilline et 0,1 mg / ml de streptomycine; Médias N2 complètent dilution finale de 1:100; L'insuline bovine 5 ug / ml; Sérum bovin fœtal à 10% volume total. Filtrez tous les médias de 0,22 um filtre.
- Préparer des échantillons Transport Cooler: Envoyer une glacière remplie de 1-2 (selon le montant de la tumeur à être récoltés) 50 ml tubes coniques stériles avec 25 ml de HBSS avec Ca 2 + / Mg 2 + (HBSS + / +) à la salle d'opération pour le transfert de l'échantillon de la tumeur et le transport.
- Préparer indivtubes de dissociation de la tumeur idual - remplir stériles 2 ml tubes ronds en bas avec 1 ml de HBSS + / + et placer sur la glace. (Tubes sera utilisé pour forte dissection / dissociation des échantillons de tumeurs).
- Pour dissociation, préparer environ un tube de dissociation pour chaque 0,5 cm 3 de tissu prélevé; par exemple, un échantillon de la tumeur mesure 1.0 x 1.0 x 1.0 cm (1 cm 3), il faudra deux tubes + / + de dissociation HBSS.
- stérilisation de lumière ultraviolette: ciseaux Lieu de tissus, de petites pinces, poignée de scalpel, plat 1x normale Petri, P1000 pipette et pointes de pipette dans une hotte de culture stérile et laisser la lumière ultraviolette pour ~ 15 min avant la date d'arrivée et le traitement du tissu tumoral.
3. Isolation des échantillons et des transports
- Isoler des échantillons de tumeurs par résection chirurgicale.
- Immédiatement placer des échantillons de tumeurs dans le glacée HBSS + / + le plus rapidement possible après le retrait du patient. Une fois que tout tissuéchantillons de e sont recueillies, des échantillons de transport (sur la glace) du théâtre opérationnel au laboratoire pour traitement ultérieur.
4. Dissociation de tissus et de trituration
- Après une technique stérile standard dans une hotte à flux laminaire, apporter tube conique avec l'échantillon de la tumeur dans la hotte de culture et laver les échantillons par inversion tube et tumeur 50x. Permettre aux fragments tombent au fond du tube, puis supprimer HBSS + / +. Remplir avec 30 ml de HBSS + / +, et agiter / inverser 50x nouveau. Répétez l'enlèvement inversion / médias pour un total de 4x.
- Re-suspendre des fragments de tumeur dans 30 ml de HBSS + / + pour la dernière fois, puis versez le mélange dans un plat mm de Pétri sterile100, et tumeur distincte dans 0,5 cm 3 groupes. Si des fragments de tumeur plus importants sont rencontrés, utiliser les ciseaux ou d'un scalpel tissus (N ° 11 ou n ° 15 lame) pour couper en petits morceaux.
- Utilisez la pince pour placer des groupes tissulaires 0,5 cm 3 dans l'individu HBSS + / + rempli, 2 ml à fond rond coniquetubes al, tous sur la glace. Utilisez les ciseaux de tissu pour hacher des fragments de tumeur en sous-1 mm fragments-la suspension doit avoir un aspect «snowglobe '(figure 1). Hacher de la tumeur jusqu'à ce que la majorité des fragments sont sous-1 mm; ne pas «sur-mince» des échantillons tumoraux. Placer le tube de tissu complètement hachée retour sur la glace, et répéter avec tous les tubes d'échantillons supplémentaires.
- Transférez tous les échantillons de tumeurs fragmentés en un seul tube conique de 15 ml. Une pipette P1000 avec une pointe stérile coupe / modifié fonctionne bien pour cette étape. Utilisez supplémentaire HBSS + / + pour vider / rincer les 2 tubes ml de dissociation pour s'assurer que tout échantillon de la tumeur ont été recueillies dans 15 ml tube. Centrifuger le mélange à centrifuger à 23 ° C, à 73 g pendant 5 min.
- Aspirer hors du HBSS + / +, laissant le culot cellulaire. Re-suspendre fragments dans un mélange 1:1 de 0,25% de trypsine: 0,2% de collagénase (dissous dans du HBSS-/ -) - ajouter juste assez pour garder des fragments de tumeur dans serré suspension. Remplacer la vis en haut, et le lieu de 37 ° C incubateur pendant 30 min. Agiter mélange de cellules au moins une fois pendant l'incubation de garder fragments en suspension. Placez le support de culture Schwannome dans l'incubateur pour la réchauffer en ce moment ainsi.
- Après incubation, ajouter 100 pl de FBS à chaque tube pour inactiver la trypsine, puis à centrifuger l'échantillon à 23 ° C, 73 g pendant 5 min. Avec une pipette, aspirer soigneusement éteints autant de surnageant sans déranger culot cellulaire. Ajouter au milieu de culture chauffé (N2/insulin/5% de FBS) à des fragments de la tumeur à un rapport final de fragments de tumeur 01:02: milieu de culture (par exemple, s'il existe une ml de fragments de tumeur, ajouter dans 2 ml de réchauffé médias).
- Préparez-vous à la trituration de la tumeur en coupant la pointe hors de la pointe de la pipette P1000 pour un diamètre d'environ 1-2 mm. Triturer lentement la suspension cellulaire à l'aide des conseils diamètre de pipette progressivement plus en plus petits, jusqu'à ce que vous pouvez facilement la pipette la solution à travers un unaltpointe de la pipette Ered P1000. Passer immédiatement à une pointe plus petite une fois que vous pouvez facilement la pipette la solution de la tumeur à travers la pointe - ne pas triturer sur l'échantillon. Si un seul gros morceau de blocs de tissus au cours de l'aspiration trituration, le taraudage de la pointe de pipette sur la partie inférieure du tube conique permet souvent trituration suite.
5. Cellule de placage
- Un 0,5 mm 3 fragment de tissu est assez pour ensemencer 1 x boîte de 100 mm ou 4 x diapositives 8-well/4-well. Juste avant d'ajouter le mélange des médias / cellulaire, éliminer la solution de laminine des plaques de culture mais ne laissez pas les plaques sèches.
- Pour chaque boîte de 100 mm, dissoudre fragment de la tumeur dans 10 ml de milieu de culture réchauffé.
- Pour chaque puits d'une lame 4-bien, utiliser 750 pi de milieu de culture réchauffé (3 ml pour toute la lame).
- Pour chaque puits d'une lame de 8 puits, utiliser 400 pi de milieu de culture chauffée (3,2 ml pour toute la lame).
- Incuber les cultures en 37 &# 160; ° C, 100% d'humidité, 6% de CO 2. Laissez les cultures seul pendant au moins 36 heures, puis modifiez les médias si la solution est jauni (acide). Sinon changer le support à 72 h, puis tous les 2-3 jours ou quand les médias deviennent acides. Si le support devient acide par jour pendant plusieurs jours d'affilée, ce qui est généralement une indication de contamination bactérienne ou de levure potentiel.
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Representative Results
Fragmentation de la tumeur correct est essentiel pour l'ensemencement optimal et l'excroissance dans des boîtes de culture de tissus (figure 1). Identification des cellules de schwannome pendant les premiers jours après placage est souvent difficile, en raison d'obscurcir quantités de débris cellulaires et des globules rouges. Par la 4 e ou 5 e jour, les extensions de cellules proches des fragments de tumeur adhérentes vont créer reconnaissable "laçage" modèles parmi les débris. Changements de supports ultérieurs généralement supprimer la majorité des cellules non adhérentes par la deuxième semaine. En utilisant ce procédé, 90% de confluence peut être prévu entre les jours 7 à 14, en fonction de la vitalité initiale du fragment de la tumeur avant hachage et la densité de placage (Figure 2). Comme décrit précédemment, les cultures de schwannome semblent croître vers l'extérieur à partir de petits fragments de fragments de tumeur adhérentes 9,10. Une telle excroissance est détectable à la fin de la première semaine. Montre la figure 2 bimagerie Rightfield de schwannome cellule excroissance d'un fragment de tumeur unique, indiqué en rouge dans le coin inférieur droit. Figure 3 illustre la conséquence «de transition» qui se produit entre deux fragments de tumeurs, dans des puits de culture immunocoloré avec un anticorps polyclonal de lapin anti-S100. Nous immunomarquage régulièrement cultures avec des anticorps anti-p75 NTR anti-S100 ou pour vérifier la pureté des cultures et positivement identifier les cellules de schwannome pour l'analyse (figure 4). Avec ces méthodes plus> 95% des cellules dans ces cultures représentent cellules schwannome. cellules Schwannome étiqueter également avec la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et ErbB2, parmi d'autres marqueurs 11.
Figure 1. Comparaison du même échantillon de tumeur à la fois avant (A) et arrièreer (B) hachage. échantillon préparé dans 1,5 ml de HBSS + / + avec rouge de phénol dans 2,0 ml tube rond fond conique.
Figure 2. Apparence typique des cultures sur la microscopie en fond clair. Spindled cellule de schwannome excroissance rayonne de fragment de la tumeur, image prise le jour de la culture 10. Barre d'échelle = 100 um.
Figure 3. Immunomarquage de cultures de schwannome vestibulaire primaires avec des anticorps anti-S100 démontrant culture typique et morphologies cellulaires. A) Faible puissance illustrant excroissance de fragments de tumeur plaqués, journée de la culture 14. Barre d'échelle = 200 um. B) pow supérieurvue er des cellules ayant une morphologie schwannome spindled, journée de la culture 14. barre d'échelle = 100 um.
Figure 4. Immunocoloration des cultures de schwannomes vestibulaires primaires pour confirmer la pureté de la culture et de l'identité de la cellule. A) Cultures immunocolorées avec des anticorps anti-S100. Noyaux sont marqués au DAPI. Barre d'échelle = 100 um. B) Cultures méthode avec des anticorps anti-p75 NTR. Noyaux sont marqués au DAPI. Barre d'échelle = 100 um.
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Discussion
Histoire de cultures in vitro dans Schwannome
Les efforts visant à établir dans les cultures de schwannome in vitro ont commencé quelques décennies après la neurinome de l'acoustique initiale résection chirurgicale ouverte a eu lieu en 1894 12. Les premières cultures enregistrées étaient par Kredel dans les années 1920, qui a tenté en vain de se développer tumeur hachée par "méthode de la goutte suspendue" 12 . Plus tard, les Drs. Murray et Stout ont publié leur expérience de la culture in vitro avec neurilemomas cultivés sur le plasma humain coagulé. Fait intéressant, cette technique a révélé que des fragments spécifiques Antoni A et B ont augmenté Antoni différemment, avec la morphologie cellulaire et différentiels des taux uniques d'agar liquéfaction 13. Cravioto et Lockwood publié de nouvelles observations de cultures de neurinome acoustique dans la formation de caillots aviaire sur des bouts de lamelle et des tubes de rouleau. Ils ont également été les premiers à utiliser des chambres Rose pour l'imagerie time-lapse de la croissance tumorale
Avantages des cultures vestibulaire Schwannome primaires
Les études de la tumorigenèse de schwannome humaine utilisent souvent des lignées cellulaires immortalisées homogènes et des modèles de souris transgéniques. Ces outils sont utiles, mais do ne pas refléter exactement les génotypes, phénotypes, et la complexité de la maladie humaine. En revanche, les cultures primaires susceptibles fournissent un modèle plus réaliste. Ils récapitulent plus fidèlement l'hétérogénéité du statut génomique et moléculaire associée à des tumeurs humaines 15.
Pureté des cultures Schwannome
L'un des défis de la culture de tissu primaire est de maintenir la pureté de la cellule cible. Schwannomes majoritairement constitués de cellules de Schwann néoplasiques 6, mais les cultures ne sont pas à l'abri de la contamination des fibroblastes. Historiquement, les méthodes d'optimisation de schwannome cellule pureté se répartissent en trois catégories: 1) sélection par un milieu défini chimiquement et des facteurs de croissance spécifiques; 2) immunopurification (par exemple, avec des cellules par billes magnétiques tri 7), 3) une combinaison des deux méthodes précédentes. Dans nos expériences de fibroblastes ou d'autres cellules non-schwannome comprennent généralement moins que 5% des cellules dans la culture, indépendamment des caractéristiques des patients (âge, sexe), les tumeurs sporadiques ou NF2-associés, résection de la tumeur primaire ou secondaire, ou kystiques vs types de tumeurs solides. Si fibroblastes semblent prendre sur la culture, l'élimination du sérum pour 1-2 changements de médias permettra de réduire considérablement cette population sans nuire à la survie des cellules de schwannome. Pré-traitement de surfaces de culture de cellules avec la laminine facilite également la croissance des cellules schwannome 9. Minimal passages des cultures contribue également à diminuer la contamination cellulaire indésirable - cryoconservation est le mieux réalisé dans les deux premiers passages en culture, et la culture n'est pas recommandé de l'expérimentation au-delà de passage 4-5. Nous trouvons des résultats optimaux lorsque la culture expérimentation est complétée par le passage 1-2 avec des cellules non-cryostored.
Nous utilisons à la fois immunologique (anti-S100, DAPI) et l'aspect microscopique de la morphologie cellulaire et nucléaire que les mesures de contrôle de la qualité dans nos cultures de schwannome. Occasionnellement, ilest utile d'immunocoloration un sous-ensemble des cultures pour des monocytes (CD68) ou des marqueurs spécifiques des fibroblastes de continuer à vérifier la pureté de la culture 9. Pendant analyses expérimentales du comportement cellulaire (par exemple, la prolifération ou mort cellulaire), nous avons toujours immunomarquage avec des anticorps anti-p75 NTR anti-S100 ou pour vérifier que les résultats sont les cellules schwannome spécifique.
les modèles de la morphologie de la Culture et de la croissance
Cultures Schwannome tumorales affichent généralement des modèles de croissance uniques rappelle Antoni A (haute densité cellulaire, bien organisé, les indications de Verocay formations du corps) et rarement d'Antoni B (noyaux relativement rares, les processus cellulaires abondantes, moins l'organisation) tendances observées dans l'histopathologie des schwannomes résection 16 tumeurs. Presque toutes les cellules de schwannome afficher la longue forme classique, monobroche, bipolaire cellule associée à la fois de Schwann et les cellules de schwannome 6,17 toutefois d'autres morpho cellulairelogies, comme décrit par Cravioto (cellules de la microglie amiboïde-comme, cellules fusiformes, des cellules de raquette en forme de cerf-volant, et les cellules de forme), parfois se produisent 14. Globalement, la croissance et la prolifération cellulaire sont très lents dans notre milieu de base (supplément de FBS/Insulin/N2 DMEM/10%). Addition de facteurs connus mitogènes tels que la forskoline et β1-neuréguline augmente de manière significative la prolifération des cellules 18.
Étapes du protocole critiques
Notre protocole de culture de tissus de schwannome est simple et assez indulgent; Mais il ya plusieurs étapes clés qui assurent le succès. Tout d'abord, la manipulation correcte de la tumeur est essentielle. Attendez-vous à de meilleurs résultats lorsque la tumeur est placé directement dans glacée HBSS + / + dès que possible une fois retiré du patient. Ceci est contraire à la pratique chirurgicale habituelle de collecte tumoral prélevé dans une solution saline stérile puis en envoyant le tissu globale pour le traitement de la pathologie à la fin de l'affaire. Deuxièmement, garder samp des tissusles frais que possible pendant le traitement. Il est essentiel que la tumeur réséquée est conservé au froid de la glace, et que le traitement se produit aussi rapidement que possible après l'enlèvement. Faire autant de traitement des tissus que possible sur la glace aussi. Troisièmement, laver énergiquement les échantillons tumoraux. Cela permet de réduire le risque de contamination bactérienne ou de levure. Quatrièmement, ne pas les échantillons de tumeurs sur-hachis. Tumeur trituration dépend d'une évaluation semi-subjective du moment de continuer avec un diamètre pointe de la pipette P1000 petit.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Support: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
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