Summary
שיווי המשקל schwannomas (VSS) הם גידולים לא ממאירים ממוצא שוואן תא (SC), הקשורים עם מוטציות בגן המדכא גידולי NF2. אנו מדווחים על פרוטוקול לשחזור, יעיל לאנושי ראשוני VS תרבית תאים המאפשר מניפולציה ניסויית מולקולרית ותאית וניתוח ומשחזר את האופי הטרוגנית של מחלות בבני אדם.
Abstract
schwannomas שיווי המשקל (VSS) מייצג תא שוואן גידולים (SC) של עצב שיווי המשקל, להתפשר 10% מכלל השאתות תוך גולגולתי. VSS להתרחש ב(, נוירופיברומטוזיס NF2 סוג 2) צורות או ספורדי או משפחתיות, שניהם קשורות עם מומי inactivating במדכאי סרטן NF2 גנים. טיפול VSS הוא בדרך כלל כריתה כירורגית או radiosurgery, עם זאת התחלואה של נהלים כאלה העלתה חקירות לטיפולים פחות פולשניים. מבחינה היסטורית, היעדר הגישה לדגימות רקמה טריות והעובדה שתאי schwannoma לא הונצחו יש הכביד באופן משמעותי את השימוש בתרבויות עיקריות לחקירה של tumorigenesis schwannoma. כדי להתגבר על ההיצע המוגבל של תרבויות עיקריות, שורת תאי HEI193 VS הונצחה נוצרה על ידי התמרה עם אונקוגנים HPV E6 ו-E7. התמרה בשעור זה הציגה שינויים מולקולריים ופנוטיפי משמעותיים לתאים, המגבילים את השימוש בם כמודל לשל אדםגידולי chwannoma. לפיכך, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט יותר, לשחזור לתרבות אנושית ראשוני VS תאים. טכניקה לשלוט בקלות זה מאפשרת לחקירות מולקולריות ותאיות שיותר במדויק לשחזר את המורכבות של המחלה VS.
Introduction
schwannomas שיווי המשקל (VSS) מייצג תא שוואן גידולים (SC) של עצב שיווי המשקל, להתפשר 10% מכלל השאתות תוך גולגולתי 1-3. VSS להתרחש ב(, נוירופיברומטוזיס NF2 סוג 2) צורות או ספורדי או משפחתיות, שניהם קשורות עם מומי inactivating במדכאי סרטן NF2 גנים. טיפול VSS הוא בדרך כלל כריתה כירורגית או radiosurgery, עם זאת התחלואה של נהלים כאלה כוללת חירשות, נוירופתיה פנים, דליפת נוזל השדרה, חוסר איזון, וצמיחה מחודשת גידול 1. בנוסף לא כל החולים הם מועמדים ניתוחיים או קרינה מקובלים. תחלואה כה משמעותית, כמו גם חוסר טיפולים אלטרנטיביים העלתה חקירת הביולוגיה מולקולרית הייחודית של VSS בתקווה לפתח טיפולים חדשניים 3,4.
תרבית תאים מאפשרת ניתוח מהיר, קליל, ומעמיק בהתנהגות והקרנה מולקולריות ותאית של com הטיפולי הפוטנציאליקילו. מבחינה היסטורית, היעדר הגישה לדגימות רקמה טריות והעובדה שתאי schwannoma לא הונצחו יש הכביד באופן משמעותי את השימוש בתרבויות עיקריות לחקירה של tumorigenesis schwannoma. כדי להתגבר על ההיצע המוגבל של תרבויות עיקריות, שורת תאי HEI193 VS הונצחה נוצרה על ידי התמרה עם אונקוגנים HPV E6 ו E7 5. התמרה בשעור זה הציגה שינויים מולקולריים ופנוטיפי משמעותיים לתאים, המגבילים את השימוש בם כמודל לגידולי schwannoma אנושיים. תרבויות SC נגזרות מהקווים עכבר מהונדסים שאין גן NF2 פונקציונלי מייצגות אלטרנטיבה אחרת כדי לחקור tumorigenesis SC NF2 תלוי במבחנה. תרבויות אלה עם זאת יצליחו לשחזר את הטבע הטרוגנית של VSS או חשבון בבני אדם להתנהגות מסוימת של אדם. רוב טכניקות תרבות VS הקודמות נדרשות זמני עיבוד ארוכים יחסית וטכניקות תרבות סלקטיבית מסובכות 6-8.כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט, לשחזור לעיקרי VS תרבית תאים עם עיבוד מלא בפחות מ -3 שעות, עם 95% טוהר תאים סרטניים כפי שנקבע על ידי immunostaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: שימוש בדגימות גידול האנושיים בפרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת איווה דירקטוריון סקירה מוסדית (IRB).
1. התקנת היום לפני קציר גידול
- צלחות תרבית תאי פרווה: במנדף תרבות סטרילי, להוסיף (פתרון 0.01%) פולי-L-ornithine מספיק כדי לכסות את תחתית תרבות קלקר / פלסטיק גם / צלחת, להחליף את המכסים, ולתת לשבת בטמפרטורת חדר למשך לפחות 2 שעות. שקופיות זכוכית או coverslips ניתן להחליף לקלקר לניסויים הדורשים הדמיה.
- לאחר 2 שעות, להסיר-L-ornithine פולי הפתרון עם יניקה ולאפשר הצלחות להתייבש לחלוטין בברדסי תרבות סטרילי. הוסף מספיק פתרון laminin (10 מיקרוגרם / מיליליטר בCa 2 + / Mg 2 + ללא HBSS [HBSS-/ -]) כדי לכסות את צלחות התרבות לחלוטין, להחליף את המכסים, אז גם 1) מקום במקרר של 4 מעלות צלזיוס מגניב הלילה, או 2) מקום בחממת 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2. אם צלחותיאוחסן לילה או יותר, לעטוף את הצלחות בניילון נצמד, כדי למנוע אידוי / התייבשות.
2. הגדרת היום של גידול קציר
- הכן את תרבות מדיה: מדיה מורכבת טרי ביום של קציר גידול ועיבוד, מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, וחיממה עד 37 ° C בחממה מייד לפני תקשורת שנוספו / שינויים.
- תקשורת ותרבות Schwannoma היא גבוה גלוקוז (4.5 מ"ג / מיליליטר) DMEM (עם פנול אדום) עם 0.1 מ"ג / מיליליטר פניצילין ו0.1 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין; תקשורת N2 להשלים דילול סופי 1:100; אינסולין שור 5 מיקרוגרם / מיליליטר; בסרום שור עוברי 10% נפח כולל. לסנן את כל התקשורת דרך 0.22 מסנן מיקרומטר.
- הכן את דגימת התחבורה Cooler: שלח צידנית קרח מלא עם 1-2 (תלוי בכמות של גידול להיות שנקטפו) צינורות חרוטי 50 מיליליטר סטרילי עם 25 מיליליטר HBSS עם Ca 2 + / Mg 2 + (HBSS + / +) לחדר הניתוח להעברת דגימת גידול והובלה.
- הכן indivצינורות דיסוציאציה גידול idual - למלא 2 מיליליטר סטרילי סביב צינורות תחתון עם 1 מיליליטר של HBSS + / + ומניחים על קרח. (צינורות ישמשו לנתיחה / ניתוק חד של דגימות גידול).
- לדיסוציאציה, להכין כ אחד צינור ניתוק לכל 0.5 3 סנטימטר של רקמה שנקטפו; למשל, דגימת גידול מדידת 1.0 1.0 x 1.0 סנטימטר x (1 סנטימטר 3) תדרוש שני צינורות + / + ניתוק HBSS.
- עיקור אור אולטרה סגול: מספריים רקמת מקום, מלקחיים קטנים, ידית אזמל, צלחת פטרי 1x הנורמלית, פיפטה P1000, וטיפים פיפטה במכסת מנוע בתרבית סטרילית, ולהשאיר באור אולטרה סגול ל~ 15 דקות לפני הגעה ועיבוד של רקמת גידול.
3. בידוד דגימה ותחבורה
- לבודד דגימות גידול על ידי כריתה כירורגית.
- מייד למקום דגימות סרטניים לתוך HBSS קר כקרח + / + במהירות אפשרית לאחר ההסרה מהמטופל. ברגע שכל Tissuדגימות דואר נאספות, דגימות תחבורה (על קרח) מהתיאטרון האופרטיבי למעבדה לעיבוד נוסף.
4. דיסוציאציה רקמות וטחינה דקה
- בעקבות טכניקה סטרילית סטנדרטית בזרימה למינרית, להביא את צינור חרוטי עם דגימת גידול למכסת המנוע בתרבית, ולשטוף את הדגימות על ידי היפוך צינור וגידול 50x. הרשה ברים ליפול לתחתית של התחתית, ולאחר מכן להסיר HBSS + / +. למלא עם 30 מיליליטר HBSS + / +, ולהתסיס / להפוך 50x שוב. חזור על הסרת היפוך / תקשורת עבור סכום כולל של 4x.
- Re-להשעות ברי גידול ב30 מיליליטר HBSS + / + בפעם האחרונה, ולאחר מכן יוצק את התערובת לתוך צלחת פטרי מ"מ sterile100, וגידול נפרד ל0.5 סנטימטר 3 קבוצות. אם שברי גידול גדולים יותר הם נתקלו, השתמשו במספרי הרקמה או אזמל (# 11 או # 15 להב) לחתוך לחתיכות קטנות יותר.
- השתמשו במלקחיים כדי למקם את 0.5 סנטימטר 3 קבוצות רקמה לתוך HBSS + / + מולא בודד, 2 מיליליטר חרוטי סיבוב תחתוןצינורות אל, כולם על קרח. השתמש במספרי הרקמה לברר שבברי גידול למשנה 1 מ"מ ברים-ההשעיה צריכה להיות מראה 'snowglobe' (איור 1). לרכך את הגידול רק עד שרוב הברים הם מ"מ משנה 1; לא 'מעל בשר טחון' דגימות גידול. הנח צינור רקמות טחון לחלוטין חזרה על קרח, וחזור עם כל צינורות דגימה נוספים.
- להעביר את כל דגימות הגידול מקוטעות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר אחד. פיפטה P1000 עם טיפ סטרילי לחתוך / שונה עובדת היטב עבור שלב זה. השתמש בתוספת HBSS + / + לשטוף / לשטוף את 2 צינורות דיסוציאציה מיליליטר כדי לוודא שכל מדגם הגידול נאסף ב15 צינור מיליליטר. ספין למטה תערובת בצנטריפוגה ב23 מעלות צלזיוס, ב73 XG במשך 5 דקות.
- יניקה מHBSS + / +, עוזבת את התא גלולה. Re-להשעות ברים ב01:01 תערובת של טריפסין 0.25%: collagenase 0.2% (מומס בHBSS-/ -) - su ההדוק להוסיף רק מספיק כדי לשמור על שברי גידול בspension. החלף בורג העליון, ומקום ב37 חממת מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. להתסיס תערובת תא לפחות פעם אחת במהלך דגירה כדי לשמור על שברים בהשעיה. הנח את התקשורת ותרבות Schwannoma לתוך החממה כדי לחמם בשלב זה גם כן.
- לאחר דגירה, להוסיף FBS 100 μl על צינור אחד כדי להשבית טריפסין, ולאחר מכן מדגם צנטריפוגות ב 23 ° C, 73 XG במשך 5 דקות. בעזרת פיפטה, יניקה בזהירות את supernatant ככל האפשר מבלי להפריע לתא גלולה. מוסיף את התקשורת חיממה התרבות (FBS% N2/insulin/5) לברי גידול ליחס סופי של 1:2 שברי גידול: תקשורת והתרבות (לדוגמא, אם יש 1 מיליליטר של שברי גידול, להוסיף 2 מיליליטר של חימם תקשורת).
- היכונו לטחינה דקה גידול על ידי חיתוך הקצה מעל קצה פיפטה P1000 לקוטר של כ 1-2 מ"מ. לאט triturate ההשעיה התא באמצעות טיפים פיפטה הקוטר בהדרגה יותר ויותר קטנים, עד שאתה יכול בקלות פיפטה הפתרון דרך unaltקצה פיפטה ered P1000. מייד לעבור לטיפ קטן יותר ברגע שאתה יכול בקלות פיפטה פתרון הגידול בקצה - לא על triturate המדגם. אם חתיכה אחת גדולה של שאיפה בלוקים רקמות במהלך טחינה דקה, הקשה על קצה פיפטה על החלק התחתון של צינור חרוטי לעתים קרובות מאפשרת טחינה דקה המשך.
5. נייד ציפוי
- אחד 0.5 מ"מ 3 שבר של רקמה הוא מספיק בקושי ל1 x 100 מנה מ"מ, או 4 x שקופיות 8-well/4-well. רק לפני הוספת תערובת מדיה / תא, להסיר את פתרון laminin מצלחות התרבות, אך לא נותן את הצלחות יבשות.
- לכל מנה 100 מ"מ, לפזר את בר הגידול ב10 מיליליטר תקשורת התרבות חיממה.
- לכל באר של שקופית 4 היטב, השתמש 750 μl תקשורת חיממה תרבות (3 מיליליטר לכל השקופית).
- לכל טוב של שקופית 8 היטב, השתמש 400 μl תקשורת חיממה תרבות (3.2 מיליליטר לכל השקופית).
- דגירה התרבויות ב37 &# 160; ° C, לחות 100%, 6% CO 2. השאר את התרבויות לבד לפחות 36 שעות, ולאחר מכן לשנות את התקשורת, אם הפתרון הוא הצהיב (חומצי). אחרת לשנות את התקשורת ב72 שעה, ולאחר מכן בכל 2-3 ימים, או כאשר אמצעי התקשורת הופכת לחומצי. אם התקשורת הופכת להיות חומצי מדי יום במשך כמה ימים ברציפות, זה בדרך כלל סימן לזיהום חיידקים או שמרים פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיצול גידול נכון הוא חיוני לזריעה אופטימלית ותוצאה במנות בתרבית הרקמה (איור 1). זיהוי של תאי schwannoma בימים הראשונים לאחר ציפוי הוא לעתים קרובות קשה, בשל טשטוש כמויות של פסולת תאית ותאי דם אדומים. על ידי ה 4 או 5 יום ה, הרחבות תא ליד שברי גידול חסיד ייצרו לזיהוי 'סרוגות' דפוסים בין ההריסות. שינויים בתקשורת לאחר בדרך כלל להסיר את רוב התאים שאינם חסיד בשבוע השני. באמצעות שיטה זו, מפגש 90% ניתן לצפות בין ימי 7-14, בהתאם לחיוניות הראשונית של שבר הגידול לפני מיותר וציפוי צפיפות (איור 2). כפי שתואר לעיל, תרבויות schwannoma מופיעות לגדול החוצה מברים קטנים של שברי גידול חסיד 9,10. תוצאה כזו היא לגילוי בסוף השבוע הראשון. איור 2 מראה בההדמיה rightfield של תולדת תא schwannoma מבר גידול יחיד, המפורטים באדום בפינה הימנית תחתונה. איור 3 ממחישה את התוצאה 'גישור' המתרחשת בין שני שברי גידול שונים, בבארות תרבות immunostained עם נוגדן ארנבת polyclonal אנטי-S100. אנו immunostain שיגרתי תרבויות עם אנטי S100 או נוגדנים נגד p75 NTR כדי לאמת את טוהר של תרבויות וחיוביות לזהות תאי schwannoma לניתוח (איור 4). בעזרת שיטות אלה על> 95% מהתאים בתרבויות אלה מייצגים תאי schwannoma. תאי Schwannoma גם תווית עם חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) וErbB2, בין סמנים אחרים 11.
איור 1. השוואה של המדגם זהה הגידול גם לפני () ומאחורמתייפייף אה (ב '). לדוגמא שהוכנה ב1.5 מיליליטר עגול צינור חרוטי תחתון + / + HBSS עם פנול אדום ב2.0 מיליליטר.
איור 2. מראה אופייני של תרבויות במיקרוסקופיה brightfield. תולדת תא schwannoma הצירית מקרינה מבר גידול, תמונה שצולמה ביום התרבות 10. בר סולם = 100 מיקרומטר.
איור 3. Immunostaining של תרבויות schwannoma שיווי המשקל ראשוניות עם נוגדנים אנטי-S100 מפגינים תרבות אופיינית ומורפולוגיה תא. א) תולדה ממחישה תצוגת חשמל נמוך ממצופים שברי גידול, יום התרבות 14. Scale בר = 200 מיקרומטר. B) pow הגבוהתצוגת er של תאי schwannoma עם מורפולוגיה מוארכת, יום התרבות 14. Scale בר = 100 מיקרומטר.
איור 4. Immunostaining של תרבויות schwannoma שיווי המשקל ראשוניות כדי לאשר טוהר התרבות וזהות תא. ) תרבויות immunostained עם נוגדנים אנטי-S100. גרעינים מסומנים עם DAPI. תרבויות בר סולם = 100 מיקרומטר. B) immunostained עם נוגדנים נגד p75 NTR. גרעינים מסומנים עם DAPI. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היסטוריה של במבחנה תרבויות Schwannoma
מאמצים להקים בתרבויות schwannoma מבחנה החלו רק כמה עשרות שנים אחרי נוירומה אקוסטית הראשונית כריתה כירורגית פתוחה התרחשה בשינה 1894 12. התרבויות המתועדות הראשונות היו על ידי Kredel ב1920s, שללא הצלחה ניסה לצמוח גידול טחון ידי "שיטת טיפה התלויה" 12 . בהמשך, בני הזוג. מוריי וסטאוט פורסמו החוויה התרבות שלהם במבחנה עם neurilemomas גדל על פלזמה אנושית קרוש. מעניין לציין, כי טכניקה זו גילתה כי אנטוני ואנטוני B שברים מסוימים גדלו באופן שונה, עם שיעורי מורפולוגיה והפרש סלולריים ייחודיים של עיבוי אגר 13. Cravioto ווקווד פורסמו תצפיות נוספות של תרבויות נוירומה אקוסטית בקרישי עופות בתלושי coverglass וצינורות הרים. הם גם היו הראשונים שהשתמשו בתאי רוז לזמן לשגות הדמיה של גידול
יתרונות של תרבויות שיווי המשקל Schwannoma הראשיים
מחקרים של tumorigenesis schwannoma האנושי לעתים קרובות להשתמש בקווים הומוגנית הנציחו תא ומודלים בעכברים מהונדסים. כלים כאלה הם מועילים, אבל דo לא משקף במדויק את גנוטיפים, פנוטיפים, ואת המורכבות של מחלות אנושיות. לעומת זאת, תרבויות עיקריות צפויות לספק מודל מציאותי יותר. הם נאמנים יותר לשחזר את ההטרוגניות של מעמד הגנומי ומולקולרי הקשורים בגידולים אנושיים 15.
טוהר תרבויות Schwannoma
אתגר של תרבית רקמה העיקרית הוא שמירה על טוהר תא יעד. Schwannomas גורף מורכב מתאי שוואן neoplastic 6, לעומת זאת תרבויות אינן חסינות מפני זיהום פיברובלסטים. מבחינה היסטורית, שיטות לייעול schwannoma טוהר נפילת תא לשלוש קטגוריות: 1) בחירה במדיום הגדרה כימית וגורמי גדילה ספציפיים; 2) immunopurification (למשל, עם תא חרוז מגנטי מיון 7), 3) שילוב של שתי השיטות הקודמות. בfibroblasts הניסיון שלנו או תאים שאינם schwannoma אחרים, בדרך כלל מהווים פחות כי 5% מתאים בcultuמחדש, ללא קשר למאפייני מטופל (גיל, מין), גידולים ספורדיים או קשור-NF2, כריתת גידול ראשונית או משנית, או פיברוזיס לעומת סוגים מוצקים גידול. אם fibroblasts נראה שמשתלט על התרבות, הסרת הסרום ל1-2 שינויי תקשורת להפחית באופן משמעותי אוכלוסייה זו מבלי להשפיע לרעה על הישרדות תא schwannoma. מראש בטיפול משטחי תרבית תאים עם laminin גם מקל על צמיחת תאי schwannoma 9. passaging המינימלי של התרבויות גם עוזר להפחית זיהום סלולארי לא רצוי - cryostorage יושלם הטוב ביותר בתוך שני קטעי התרבות הראשונים, וניסויים בתרבות אינה מומלץ מעבר למעבר 4-5. אנחנו מוצאים את התוצאות אופטימליות כאשר הניסויים התרבות הושלם על ידי מעבר 1-2 עם תאים שאינם cryostored.
אנו משתמשים בשני immunostaining (אנטי-S100, DAPI) ומראה מיקרוסקופי של מורפולוגיה תאית וגרעינית כאמצעי בקרת איכות בתרבויות schwannoma שלנו. לפעמים זהכדאי immunostain משנה של תרבויות למונוציטים (CD68) או סמני פיברובלסטים ספציפיים כדי לוודא תרבות טוהר 9 נוסף. במהלך ניתוחים ניסיוניים של התנהגות תא (לדוגמא, ריבוי או מוות של תאים), אנחנו תמיד immunostain עם אנטי S100 או נוגדנים נגד p75 NTR כדי לוודא שהממצאים הם תא schwannoma ספציפי.
דפוסי מורפולוגיה תרבות וצמיחה
תרבויות גידול Schwannoma בדרך כלל להציג את דפוסי צמיחה ייחודיים המזכירים את אנטוני (צפיפות גבוהה תא, מאורגנים היטב, סימנים של תצורות גוף Verocay) ורק לעתים נדירות של אנטוני B (גרעינים יחסית דלילים, תהליכים תאיים בשפע, פחות ארגון) תבניות ראו בhistopathology של schwannoma resected גידולי 16. כמעט כל תאי schwannoma להציג את הצורה הקלאסית הארוכה, מוארכת, דו קוטבית תאים הקשורים עם שתי שוואן ותאי schwannoma 6,17 morpho תא אחר אולםlogies, כפי שתואר על ידי Cravioto (תאים דמויי Microglia אמבואידית, תאים בצורת-ציר, תאים דמויי מחבט, ותאים בצורת-עפיפונים) מתרחש לעתים 14. בסך הכל, צמיחת תאים והתפשטות הן איטיים מאוד במדיום שלנו הבסיס (DMEM/10% תוספת FBS/Insulin/N2). תוספת של גורמי mitogenic ידועים כגון forskolin וβ1-neuregulin מגבירה באופן משמעותי תא התפשטות 18.
צעדים פרוטוקול קריטיים
פרוטוקול תרבית רקמת schwannoma שלנו הוא פשוט וסלחני למדי; עם זאת יש כמה שלבים עיקריים שיבטיחו הצלחה. ראשית, טיפול בגידול נכון הוא קריטי. מצפה לתוצאות הטובות ביותר כאשר גידול ממוקם ישירות לתוך HBSS קר כקרח + / + בהקדם האפשרי הוסר פעם אחת מהמטופל. זאת בניגוד לפרקטיקה כירורגית הרגילה של איסוף גידול resected בתמיסת מלח סטרילית לאחר מכן לשלוח את הרקמה המצרפי לעיבוד בפתולוגיה בסוף של המקרה. שנית, לשמור SAMP רקמהles הקריר ככל האפשר בזמן העיבוד. זה חיוני כי גידול resected נשמר קר כקרח, והעיבוד המתרחש כexpediently אפשרי לאחר ההסרה. לעשות כמה שיותר מעיבוד הרקמות ככל האפשר על קרח גם כן. שלישית, באגרסיביות לשטוף את דגימות גידול. זה עוזר להפחית את הסיכון לזיהום חיידקים או שמרים. הרביעית, לא דגימות גידול מעל בשר טחון. טחינה דקה גידול תלוי בהערכה למחצה הסובייקטיבית של מתי להמשיך עם קצה פיפטה P1000 בקוטר קטן יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
תמיכה: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
