Summary
Schwannomas vestibulares (VSS) são tumores não-malignos de células de Schwann (SC), origem associados com mutações no gene supressor de tumores de NF2. Apresentamos um protocolo reprodutível e eficiente para humano primário VS cultura celular que permite a manipulação experimental celular e molecular e análise e recapitula a heterogeneidade da doença humana.
Abstract
Schwannomas vestibulares (VSS) representam Schwann célula (SC) tumores do nervo vestibular, comprometendo 10% de todas as neoplasias intracranianas. VSes ocorrer na neurofibromatose tipo 2 (NF2), formas ou esporádica ou familiar, tanto associados inativando defeitos no supressor de tumor NF2 gene. Tratamento para VSS é geralmente a ressecção cirúrgica ou radiocirurgia, porém a morbidade desses procedimentos tem conduzido investigações sobre tratamentos menos invasivos. Historicamente, a falta de acesso a amostras de tecido fresco e ao fato de que as células schwannoma não são imortalizadas têm dificultado significativamente o uso de culturas primárias para a investigação de schwannoma tumorigênese. Para superar o fornecimento restrito de culturas primárias, a linha celular imortalizada HEI193 VS foi gerado através de transdução com o HPV E6 e E7 de oncogenes. Este transdução oncogénica introduzido alterações moleculares e fenotípicas significativas para as células, o que limita a sua utilização como um modelo para es humanostumores chwannoma. Nós, portanto, ilustrar um protocolo simplificado, reprodutível para a cultura do ser humano primário VS células. Esta técnica permite facilmente dominado investigações moleculares e celulares que recapitulam com mais precisão a complexidade da doença VS.
Introduction
Schwannomas vestibulares (VSS) representam Schwann célula (SC) tumores do nervo vestibular, comprometendo 10% de todas as neoplasias intracranianas 1-3. VSes ocorrer na neurofibromatose tipo 2 (NF2), formas ou esporádica ou familiar, tanto associados inativando defeitos no supressor de tumor NF2 gene. Tratamento para VSS é geralmente a ressecção cirúrgica ou radiocirurgia, no entanto, a morbidade de tais procedimentos incluem surdez, neuropatias faciais, vazamento de fluido espinhal, desequilíbrio, e rebrota tumor 1. Além disso nem todos os pacientes são aceitáveis candidatos à cirurgia ou radioterapia. Tal morbidade significativa, bem como a falta de terapias alternativas tem impulsionado a investigação sobre a biologia molecular única de VSes na esperança de desenvolver novos tratamentos 3,4.
Cultura celular permite a análise rápida, fácil, e em profundidade do comportamento molecular e celular e de triagem do potencial terapêutico comlibras. Historicamente, a falta de acesso a amostras de tecido fresco e ao fato de que as células schwannoma não são imortalizadas têm dificultado significativamente o uso de culturas primárias para a investigação de schwannoma tumorigênese. Para superar o fornecimento restrito de culturas primárias, a linha celular imortalizada HEI193 VS foi gerado através de transdução com o HPV E6 e E7 oncogenes 5. Este transdução oncogénica introduzido alterações moleculares e fenotípicas significativas para as células, o que limita a sua utilização como um modelo para tumores schwannoma humanos. Culturas SC derivados de linhas de camundongos transgênicos que não possuem um gene NF2 funcional representam uma outra alternativa para investigar tumorigenesis SC NF2-dependente in vitro. Estas culturas no entanto deixar de recapitular a heterogeneidade dos VSes humano ou conta para o comportamento específico humano. A maioria das técnicas anteriores de cultura VS necessário tempos de processamento relativamente longas e complicadas técnicas de cultura seletivos 6-8.Aqui apresentamos um protocolo simples e reprodutível para a primária VS cultura de células com processamento completo em menos de 3 horas, com 95% de pureza das células tumorais, como determinado por imunocoloração.
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Protocol
Declaração de Ética: Uso dos espécimes tumorais humanas neste protocolo foi aprovado pela Universidade de Iowa Institutional Review Board (IRB).
1. Setup no dia anterior Tumor Colheita
- Placas de cultura de células: casaco Num capuz de cultura estéril, adicionar suficiente poli-L-ornitina (solução a 0,01%) para cobrir o fundo de uma cultura de poliestireno / poço de plástico / prato, substituir as tampas, e deixar repousar à temperatura ambiente durante pelo menos 2 hr. Lâminas de vidro ou de lamelas pode ser substituído por poliestireno para experiências que requerem imagiologia.
- Após 2 horas, remove-L-ornitina poli solução por sucção e permitir que as placas a secar completamente em um estéreis capuzes cultura. Adicionar solução de laminina suficiente (10 ug / ml, em Ca 2 + / Mg 2 + livre HBSS [HBSS-/ -]) para cobrir completamente as placas de cultura, substituir as tampas, em seguida, ou 1) em lugar frio a 4 ° C frigorífico durante a noite, ou 2) colocar em 37 ° C incubadora durante pelo menos 2 horas. Se as placasserão armazenadas durante a noite ou mais, envolver as placas em filme plástico para evitar a evaporação / dessecação.
2. Configuração do Dia da Colheita Tumor
- Prepare Meios de Cultura: Meios é feita fresca no dia da colheita e processamento do tumor, armazenado a 4 ° C, e aqueceu-se a 37 ° C na incubadora imediatamente antes da mídia adições / modificações.
- Meios de cultura de Schwannoma é de alta glucose (4,5 mg / ml) DMEM (com vermelho de fenol) com 0,1 mg / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina; Mídia N2 complementar diluição final de 1:100; A insulina bovina de 5 ug / ml; Soro fetal bovino a 10% volume total. Filtre todos os meios de comunicação através do filtro de 0,22 mM.
- Prepare Specimen Transport Refrigerador: Enviar um cheios de gelo refrigerador com 1-2 (dependendo da quantidade de tumor a ser colhida) estéreis de 50 ml tubos cônicos com 25 ml de HBSS com Ca 2 + / Mg 2 + (HBSS + / +) para a sala de cirurgia para a transferência de amostra de tumor e de transporte.
- Prepare indivtubos de dissociação tumor idual - preencher estéreis 2 ml tubos redondos de fundo com 1 ml de HBSS + / + e colocar no gelo. (Os tubos serão utilizados para dissecção cortante / dissociação de amostras tumorais).
- Para dissociação, prepare aproximadamente um tubo de dissociação para cada 0,5 cm 3 de tecido colhido; por exemplo, uma amostra do tumor medindo 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm3) vai exigir dois tubos HBSS + / + de dissociação.
- Esterilização luz ultravioleta: tesoura Local de tecido, pequenas pinças, cabo de bisturi, 1x prato normal de Petri, P1000 pipeta e pontas de pipeta em uma capa de cultura estéril, e deixar sob a luz ultravioleta para ~ 15 min antes da chegada e processamento de tecido do tumor.
3. Espécime Isolamento e Transporte
- Isolar amostras de tumor por ressecção cirúrgica.
- Colocar imediatamente as amostras de tumor para o HBSS + / + gelada, tão rapidamente quanto possível após a retirada do paciente. Uma vez que todos tissue as amostras são coletadas, as amostras de transporte (no gelo) do teatro operatório para o laboratório para processamento posterior.
4. Dissociação de tecidos e trituração
- Seguindo uma técnica estéril padrão numa câmara de fluxo laminar, trazer tubo cónico com a amostra de tumor no capuz de cultura, e lava-se as amostras por inversão do tubo e do tumor de 50x. Permitir que os fragmentos a cair para o fundo do tubo, e, em seguida, remover HBSS + / +. Recarga com 30 ml HBSS + / +, e agite / inverter 50x novamente. Repita remoção inversão / media para um total de 4x.
- Re-suspender fragmentos do tumor em 30 ml HBSS + / +, pela última vez, em seguida, despeje a mistura em uma placa de Petri sterile100 mm, e tumor separar em 0,5 centímetros 3 agrupamentos. Se fragmentos de tumores maiores são encontradas, usar a tesoura de tecido ou bisturi (# 11 ou # 15 lâminas) para cortar em pedaços menores.
- Use a pinça para colocar os 0,5 centímetros 3 grupos de tecido para o indivíduo HBSS + / + cheia, 2 ml de fundo redondo cônicatubos ai, tudo no gelo. Use as tesouras de tecidos para triturar os fragmentos tumorais em sub-fragmentos de um milímetro-a suspensão deve ter uma aparência 'snowglobe' (Figura 1). Picar o tumor apenas até que a maioria dos fragmentos são sub-1 mm; não 'sobre-mince' as amostras tumorais. Coloque o tubo de tecido completamente picada de volta no gelo, e repita com todos os tubos de amostras adicionais.
- Transfira todas as amostras tumorais fragmentadas em um único tubo cônico de 15 ml. A pipeta P1000 com um corte / modificados ponta estéril funciona bem para essa etapa. Use adicional HBSS + / + para lavar / enxaguar os 2 tubos ml de dissociação para garantir que todos amostra de tumor foi coletado em tubo de 15 ml. Girar mistura em centrífuga a 23 ° C, a 73 g durante 5 min.
- Sucção fora HBSS + / +, deixando o sedimento celular. Re-suspender fragmentos em 1:1 mistura de 0,25% de tripsina: 0,2% de colagenase (dissolvido em HBSS-/ -) - adicionar apenas o suficiente para manter fragmentos do tumor em apertada suspension. Substitua o parafuso-top, e coloque em 37 ° C incubadora por 30 min. Agitar a mistura de células de pelo menos uma vez durante a incubação de manter fragmentos em suspensão. Coloque o meio de cultura Schwannoma na incubadora para aquecê-la neste momento também.
- Após a incubação, adicionar 100 mL de FBS a cada tubo para inactivar a tripsina, e depois centrifugar a amostra a 23 ° C, 73 g durante 5 min. Com uma pipeta, cuidadosamente sucção fora tanto quanto possível sobrenadante sem perturbar pellet celular. Adicionar o meio de cultura aquecido (N2/insulin/5% de FBS) aos fragmentos de tumor a uma razão final de 01:02 tumor: meio de cultura (por exemplo, se houver um ml de fragmentos tumorais, adicionar 2 ml de aqueceu mídia).
- Preparar para a trituração do tumor, cortando a ponta fora da ponta de uma pipeta P1000 com um diâmetro de cerca de 1-2 mm. Lentamente triturar a suspensão de células usando dicas progressivamente menores e menores de pipeta de diâmetro, até que você possa facilmente pipetar a solução através de um unaltponteira ered P1000. Mover-se imediatamente a uma ponta menor, uma vez que pode facilmente pipetar a solução tumor através da ponta - não mais de triturar a amostra. Se um único pedaço maior de blocos de tecido de aspiração durante a trituração, tocando a ponta da pipeta na parte inferior do tubo cónico permite frequentemente a trituração contínua.
5. Celular chapeamento
- Ona 0,5 mm 3 fragmento de tecido é suficiente para semear um prato de 100 mm x, ou 4 x lâminas 8-well/4-well. Pouco antes de adicionar a mistura media / celular, remova a solução laminina das placas de cultura, mas não deixe as placas seco.
- Para cada placa de 100 mm, dissolve-se o fragmento de tumor em 10 ml de meio de cultura aquecido.
- Para cada poço de uma 4-bem corrediça, utilizar 750 ul do meio de cultura aquecido (3 ml para toda a lâmina).
- Para cada poço de um de 8 poços corrediça, utilizar 400 ul do meio de cultura aquecido (3,2 ml de toda a lâmina).
- Incubar as culturas a 37 &# 160; ° C, 100% de humidade, 6% de CO 2. Deixe as culturas sozinho por pelo menos 36 horas, e, em seguida, alterar a mídia, se a solução é amarelado (ácido). Caso contrário, alterar a mídia em 72 horas, em seguida, a cada 2-3 dias ou quando os meios de comunicação tornam-se ácida. Se a mídia se torna ácido diariamente durante vários dias seguidos, isso é geralmente uma indicação do potencial de contaminação por bactérias ou fungos.
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Representative Results
Fragmentação tumor correcta é essencial para a propagação óptima e excrescência em pratos de cultura de tecidos (Figura 1). Identificação de células de schwannoma, durante os primeiros dias após o revestimento é muitas vezes difícil, devido ao obscurecimento quantidades de detritos celulares e as células vermelhas do sangue. Até o 4 º ou 5 º dia, extensões celulares perto de fragmentos tumorais aderentes criará reconhecível 'laçar' padrões entre os escombros. Alterações posteriores mídia geralmente remover a maioria das células não aderentes por a segunda semana. Utilizando este método, 90% de confluência pode ser previsto, entre 7-14 dias, dependendo da vitalidade inicial do fragmento do tumor antes da trituração e plaqueamento densidade (Figura 2). Como descrito anteriormente, as culturas schwannoma parecem crescer para fora a partir de pequenos fragmentos de fragmentos tumorais aderentes 9,10. Essa protuberância é detectável no final da primeira semana. Figura 2 mostra bimaging rightfield de schwannoma conseqüência célula de um fragmento de tumor único, destacados em vermelho no canto inferior direito. Figura 3 ilustra a conseqüência 'ponte' que ocorre entre dois fragmentos tumorais diferentes, em poços de cultura histoquímica com anticorpo policlonal de coelho anti-S100. Rotineiramente immunostain culturas com anti-S100 ou os anticorpos anti-p75 NTR para verificar a pureza da cultura e positivamente identificar células schwannoma para análise (Figura 4). Com estes métodos durante> 95% das células nestas culturas representam células schwannomas. Células Schwannoma também etiquetar com a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e ErbB2, entre outros marcadores 11.
Figura 1. Comparação da mesma amostra do tumor, tanto antes (A) e de popaer (B) picados. Amostra preparada em 1,5 ml de HBSS + / + com Vermelho de Fenol em 2,0 ml rodada tubo cônico de fundo.
Figura 2. Aparência típica de culturas em microscopia de campo claro. Fusiformes conseqüência célula schwannoma irradia de fragmento de tumor, imagem tomada no dia 10 de cultura. Barra de escala = 100 mm.
Figura 3. Imunocoloração das culturas schwannoma vestibular primárias com anticorpos anti-S100 demonstrando cultura típica e morfologias celulares. A) Opinião de baixo poder ilustrar conseqüência a partir de fragmentos tumorais chapeado, cultura dia 14. Escala bar = 200 m. B) pow Superiorvista er de células fusiformes schwannoma com morfologia, cultura dia 14. Escala bar = 100 mm.
Figura 4. Imunocoloração das culturas schwannoma vestibular primárias para confirmar a pureza da cultura e identidade da célula. A) Culturas imunocoradas com anticorpos anti-S100. Os núcleos são rotulados com DAPI. Barra de escala = 100 mm. B) As culturas com os anticorpos anti-p75 NTR. Os núcleos são rotulados com DAPI. Barra de escala = 100 pm.
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Discussion
História das culturas in vitro Schwannoma
Esforços para estabelecer em culturas in vitro schwannoma começou apenas algumas décadas após o neuroma acústico inicial ressecção cirúrgica aberta ocorreu em 1894 12. As primeiras culturas foram gravadas por Kredel na década de 1920, que tentou em vão crescer tumor picada pelo "método da gota pendurado" 12 . Mais tarde, os drs. Murray e Stout publicou sua experiência in vitro com cultura neurilemomas cultivadas em plasma humano coagulado. Curiosamente, esta técnica revelou que Antoni A e Antoni B fragmentos específicos cresceu de forma diferente, com taxas de morfologia celular e diferenciais únicos de agar liquefação 13. Cravioto e Lockwood publicado mais observações das culturas de neurinoma do acústico em coágulos aviária em tiras lamela e tubos de rolo. Eles também foram os primeiros a usar câmaras de Rose por lapso de tempo de imagem do crescimento do tumor
Benefícios de culturas Schwannoma Vestibular primárias
Estudos de tumorigenesis schwannoma humano muitas vezes usam linhagens de células imortalizadas homogêneos e modelos ratos transgênicos. Tais ferramentas são benéficas, mas do não refletir com precisão os genótipos, fenótipos e complexidade da doença humana. Por contraste, as culturas primárias provável proporcionar um modelo mais realista. Eles mais fielmente recapitular a heterogeneidade do estado genômica e molecular associado com tumores humanos 15.
Pureza das Culturas Schwannoma
Um desafio de cultura de tecido principal é manter-alvo pureza celular. Schwanomas esmagadoramente composta por células de Schwann neoplásicas 6, no entanto culturas não estão imunes a contaminação de fibroblastos. Historicamente, os métodos para otimizar schwannoma celular pureza queda em três categorias: 1) seleção de química definida médio e fatores de crescimento específicos; 2) imunopurificação (por exemplo, com a célula de grânulo magnético triagem 7), 3) uma combinação de ambos os métodos anteriores. Na nossa experiência fibroblastos ou outras células não-schwannoma compreendem geralmente menos que 5% das células no blore, independentemente de características do paciente (idade, sexo), os tumores esporádicos ou NF2 associados, a ressecção do tumor primário ou secundário, ou císticos vs tipos de tumores sólidos. Se fibroblastos parecem estar assumindo a cultura, a remoção do soro por 1-2 mudanças de mídia irá reduzir significativamente essa população sem prejudicar a sobrevivência da célula schwannoma. Pré-tratamento de superfícies de cultura celular com laminina também facilita o crescimento de células schwannoma 9. Passaging Minimal das culturas também ajuda a diminuir a contaminação celular indesejado - cryostorage é melhor concluída dentro das primeiras duas passagens de cultura, e experimentação cultura não é recomendado para além passagem 4-5. Nós encontramos os melhores resultados quando a experimentação cultura é completado pela passagem 1-2 com células não-cryostored.
Nós usamos as immunostaining (anti-S100, DAPI) e aparência microscópica da morfologia celular e nuclear como medidas de controle de qualidade em nossas culturas schwannoma. OcasionalmenteÉ útil immunostain um subconjunto de culturas para monócitos (CD68) ou marcadores de fibroblastos específicos para comprovar a pureza da cultura 9. Durante análise experimental do comportamento de células (por exemplo, a proliferação ou morte celular), sempre immunostain com anti-S100 ou anticorpos anti-p75 NTR para verificar se os resultados são células schwannoma específico.
Padrões de cultura e morfologia de crescimento
Culturas tumorais Schwannoma geralmente exibem padrões de crescimento únicas reminiscência de Antoni A (alta densidade celular, muito bem organizados, os indícios de formações corporais Verocay) e raramente de Antoni B (núcleos relativamente escassas, abundantes processos celulares, menos organização) padrões vistos na histopatologia de schwannoma ressecado Tumores 16. Quase todas as células schwannoma exibir a forma clássica longo, fusiformes, bipolar célula associada tanto Schwann e células schwannoma 6,17 no entanto outro morfo celularlogias, como descrito por Cravioto (Cells Amoeboid Microglia-like, as células fusiformes, células em forma de raquete, e Células Kite-shaped), por vezes, ocorrem 14. Em geral, o crescimento e proliferação de células são muito lentas no nosso meio base (DMEM/10% de suplemento FBS/Insulin/N2). A adição de factores mitogénicos conhecidos, tais como forskolina e β1-neuregulina aumenta significativamente a proliferação de células 18.
Críticos do Protocolo de Passos
Nosso protocolo de cultura de tecidos schwannoma é simples e bastante indulgente; no entanto, existem vários passos-chave que garantem o sucesso. Primeiro, manuseio correto do tumor é crítica. Esperar melhores resultados quando tumores é colocada directamente em gelo-HBSS frio + / +, o mais rapidamente possível, uma vez removido do paciente. Isto é contrário à prática cirúrgica usual de coleta de tumor ressecado em solução salina estéril, em seguida, enviar o tecido agregado para o processamento em patologia no final do caso. Em segundo lugar, manter samp tecidoles tão legal quanto possível durante o processamento. É vital que o tumor ressecado é mantida gelada, e que o processamento ocorre tão acelerado quanto possível após a remoção. Faça o máximo de processamento de tecidos quanto possível no gelo também. Terceiro, lavar agressivamente as amostras de tumor. Isto ajuda a reduzir o risco de contaminação bacteriana ou de levedura. Em quarto lugar, não espécimes tumorais sobre-pique. Tumor trituração depende de uma avaliação semi-subjetiva de quando a continuar com um diâmetro P1000 ponteira menor.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Apoio: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
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