研究微加工通道细胞迁移的

Summary

研究细胞的自发迁移的一维密闭微环境的定量方法。此方法采用微加工通道的优势，并可以用来在单个实验中在不同条件下研究了大量的细胞迁移。

Abstract

这里所描述的方法允许在一个维度在封闭条件下细胞迁移的研究。它是基于使用微加工渠道，通过物理约束施加极化表型的细胞。一旦进入通道，细胞只有两种可能：向前或向后移动。这个简化的迁移，其中方向性限制有助于细胞的自动跟踪和量化参数来描述小区移动的提取。这些参数包括运动过程中细胞的速度，改变方向，并暂停。微通道也与使用荧光标记兼容，因此适合在高分辨率细胞迁移过程中，研究细胞内的细胞器和结构的定位。最后，该通道的表面可以用不同的基底进行官能化，允许的信道或haptotaxis的研究的粘合性能的控制。总之，本系统HERE的描述是为了分析大细胞数目的迁移中，其中两个的几何形状和对环境的生化性质受到控制的条件下，方便的独立实验的正常化和可重复性。

Introduction

迁移是一个复杂的细胞功能，是许多生理过程中的多细胞生物体，包括发育，免疫应答，和组织再生很重要。此外，某些病理情况下，如肿瘤的侵袭和转移依赖于细胞运动^1。由于这些原因，细胞迁移已成为研究的一个主要领域中的基本和平移研究的背景下， 在体内 ，大部分组织的特征在于丰富的细胞外基质和高细胞密度。细胞迁移，因此，在生理条件下，发生在一个复杂的密闭环境中。古典的，很有可能是由于历史的原因和技术的限制，细胞迁移进行了研究，2D平面系统不重现许多组织，如坐月子中发现的环境属性。此外，因素如细胞粘附，这对于运动中的2D必不可少的，最近已表明，以不necessarily需要在体内或内部凝胶迁移，这表明该规则的运动细胞在二维和在其他环境中的机制是不同的^2。几个系统已经发展到模仿的组织，最有名的是胶原蛋白凝胶，在扼要的细胞外基质成分³的性质，目的的复杂性。在这里，我们提出了微通道作为一个简单的补充方法，它允许一个密闭的环境下，在一个维度研究细胞迁移。

在这个系统中的细胞沿微通道进入，他们自发地进入迁移。迁移细胞然后获得的信道的形状，采用管状的几何形状，最有可能增强其极性。该细胞在信道的线性运动使自动跟踪单元和从实验定量参数的提取。从技术角度来看，这个系统很容易和灵活。该金属 -克的通道壁可以被操纵，所述通道的尺寸和形状可以适应，并有大量的细胞可以在单一实验中进行分析。该系统还可以按比例放大进行参与细胞运动的分子中程屏幕分析。这里所描述的协议已经使用的树突状细胞（DC）作为细胞模型已经标准化。这些细胞是关键的免疫系统，因为它们参与的特异性免疫反应的引发和维持^4。 在体外 ，议会已经显示自发迁移在密闭的环境中，因此，研究细胞运动中的微通道^5,6的良好模型。重要的是，该系统可以扩展到分析的任何其他能动的细胞类型如T淋巴细胞，中性粒细胞，或肿瘤细胞^7-9的迁移。

Protocol

重要提示：本协议假定已经被制成含形状所需的微模具。在模具的制备方法的进一步信息已经被发表^10。该协议还假定骨髓DCs培养是已知的。

1。芯片制造

1. 混合的PDMS油和固化剂在塑料杯中的重量比为10:1。调匀两种化合物。
2. 投组合在模具轴承微通道。的总高度应该为0.5-1厘米之间。
3. 中1小时，在真空罐钟除去气泡。
4. 在模具中硬化的PDMS由在65℃下放置后在烘箱中2小时
5. 一旦PDMS是在室温下，切断周围的结构一大块用手术刀片和从模具中（ 图1A）剥开。
6. 钻孔，其中的细胞会被注入（通常为2毫米）和调整的PDMS用手术刀片，以适应大小的玻璃底培养皿中的迁移进行评估（ 图1B）。在继续之前，使用擦镜纸盘子去除残留的灰尘。这有利于PDMS到在步骤1.10中描述玻璃的结合。
7. 通过结构面粘连，剥离胶带清理含有渠道调整的PDMS芯片。
8. 超声处理的PDMS片30秒70％乙醇中以除去灰尘和小颗粒的PDMS。吹清洁的空气干他们很快之后。
9. 中30秒，在300毫乇通过空气（或氧气）激活的PDMS（结构向上）和培养皿等离子体处理。
10. 放置两个活性表面在接触到永久粘PDMS到衬底上。如果需要的话，可以使用金属镊子轻压在PDMS的顶部，迫使聚合物和菜（ 图1C）的玻璃之间的接触。
11. 孵育在烤箱芯片在65℃下FO，R 1小时，以加强约束力。

2。微通道的涂层

1. 由空气等离子体激活整个结构在300毫乇，持续1分钟。这将促进液体进入该通道的下一个步骤。
2. 快速填充纤连蛋白芯片的入口孔在10μg/ ml的水。其它衬底，如PEG可用于修改细胞黏附到通道壁上。注意使液体扩散在整个结构。这可以通过眼睛的定期光或使用常规的亮视野显微镜检查容易。
   注意：在非常小的结构，在这种扩散是困难，在通道入口的液体可以通过至少15分钟内将所述结构在真空罐钟被迫。以验证荧光底物可用于涂料的效率（ 图2）。
3. 孵育1小时，在室温下，以允许吸附在纤连蛋白，或任何其它涂层实名词率的信道的壁上。
4. 洗了3倍的结构用PBS以除去未结合的基板。
5. 洗涤后，进行协议3或4°C的存储芯片为以后使用（24小时最大值）。

3。电池装入

1. 从板块中删除的PBS，并填写与微细胞培养基。让孵育1小时，以饱和的通道与平台。
   注：对于涉及药物如分子抑制剂的实验，它是应垫上预温育的渠道与含有药物在合适的浓度的媒介。此外，一些药物往往在PDMS结构从而降低了有效浓度溶解。有些解决方案已经被提出来抵消这一问题^11-12。
2. 除去浮区议会，并通过与培养液冲洗恢复半贴壁细胞。使用血细胞计数器计数细胞。
   注：对于核成像中，赫斯特33342染色可以通过事先取得中在30分钟内用染料cubating 2×10 ⁶细胞在完全培养基200毫微克/毫升。通过离心洗两次持续的协议之前，以去除多余的染料。
3. 在5分钟（时间和速度可以不同，这取决于细胞类型）离心所述细胞以300×g离心并弃去培养基。稀释沉淀，达到20×10 ⁶细胞/ ml的浓度。
4. 从板块中删除多余的介质，并使用微量清空PDMS结构的入口孔。填写中的条目与5微升的细胞溶液，以达到在每个条目中孔1×10 ⁵个细胞的量。
   注：高细胞密度必须有利于细胞与渠道的接触。低细胞密度可能导致内部通道和实验失败的细胞数量低。
5. 孵育微芯片进行30分钟，在37℃的培养箱中培养。加入2 ml完全培养基的实验菜。
   注意：整个PDMS结构必须bë覆盖，以避免在实验过程中的细胞干燥。如果2毫升是不够的，添加更多的介质来完全覆盖PDMS结构。

4。成像

1. 把板在显微镜下才清洁与镜头清洁纸餐具外底面。
2. 来分析大量细胞的迁移，可使用10倍放大倍率和宽视场照明，在CO ₂和温度搭载视频显微镜（ 图3）。以促进细胞的跟踪，Hoechst染色和UV光，可以使用（参见步骤3.2）。移民可以同时分析利用共聚焦显微镜才能迁移过程中获得更高分辨率的细胞结构。
3. 对于时间推移显微镜在10X，选择根据预期的细胞的速度（一般为2分钟为树突状细胞与5微米/分钟的速度迁移）时间频率。
   注：这里所描述的协议确实ÑOT包括细胞迁移参数的分析。有几点列在讨论建议读者就如何着手从定时短片中提取信息。

Representative Results

在每个实验中的PDMS的表面涂有适于研究的感兴趣的分子， 图2示出了通道涂覆有荧光分子，PLL-G-PEG，前和洗涤（步骤2.4）之后。这样的实验可以在通道中的涂层的均匀性的控制。

后细胞加载，视频显微镜可以执行遵循细胞迁移。 图3A示出的微通道的DC迁移至适当的浓度来跟踪小区的例子。既，相衬和Hoechst染色可以用于此目的（见讨论）。该技术也用荧光共焦显微镜在更高的分辨率兼容，并且可以被用来追踪细胞器或细胞结构。 图4B示出聚合的肌动蛋白的迁移的DC表达LifeActGFP动态的一个例子。

细胞的量化的一例蠕动迁移的DC分析示于图5，图 5a示出了从WT或Y27632处理的DC产生kymographs。 Y27632是细胞收缩和迁移的良好表征的抑制剂，并且被用于验证系统的检测速度的变化的能力。该kymographs可进一步分析，提取位置和细胞作为时间的函数的大小，允许不同参数的研究来描述细胞迁移。 图5B示出迁移通过使用自制的软件¹³的成像细胞核定位跟踪的速度。区议会有一个平均速度接近60微米/分钟。治疗Y27632显著降低它们的速度。这个例子显示了该技术，它允许大量的细胞中单个实验的定量和系统来检测引起的药物治疗不同的实用程序的权力。这可以扩展到使用的siRNA和摩尔的筛选 cules参与迁移的控制。

图1中的步骤组装渠道。PDMS芯片是从一个通道模复制。 （A）含有的通道的芯片是直接从模具中取出。 （B）调整为适合实验皿和空穴的芯片被制成以使细胞的入口。 （C）该芯片终于粘贴在玻璃盘的顶部。该设备的（D和E）示意图。 （ 四）顶视图。 （五 ）侧视图。绿色对象表示细胞或缩小通道（蓝色）。栏1厘米。

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图2。涂层频道与荧光底物的（A）5微米×5微米的通道孵育荧光PEG在期间1小时100微克/毫升。 （B）信道的PBS洗涤后剩余的荧光PEG的图像代表。酒吧50微米。

图3。细胞迁移沿微通道。相衬细胞在5微米×5微米的微细加工通道迁移的（灰色）和核染色（蓝色）。从发达国家的电影频道一起迁移提取（A） 单图像。 （B）的蒙太奇表示选择位的位移沿着通道特德直流迁移。白色箭头指示细胞迁移。时间刻度1张图片/ 2分钟。酒吧50微米。

图4例高分辨细胞在微通道中。区议会的高分辨率成像以及单个微通道迁移。相位对比图像（A）蒙太奇（1 img/20秒）的DC在微通道迁移（放大100倍）。 （B）的DC表达lifeact（亮点聚合肌动蛋白）示出与荧光成像（1 img/20秒，60X放大倍率，单一的光学部分）的系统的兼容性的蒙太奇。肌动蛋白聚合的显示为黑色。通道尺寸10μm宽×5微米高。杆10微米。

图5中的DC迁移沿微代表性的成果。这个数字说明的分析，可以从细胞的电影来完成沿微通道迁移的类型。 图5A显示了WT的时间推移相衬图像或Y27632处理的DC迁移产生kymographs微通道（10X，1张图片/ 2分钟）。 图5B示出了利用Hoechst染色和自制软件¹³跟踪DC核后获得的细胞速度的量化的例子。数据是使用非参数t检验（Mann-Whitney检验）分析。杆100微米。

Discussion

这里，我们描述了微通道构成，以研究大量的细胞中单个实验的迁移特性的方法的设备。该实验系统由模拟内源性游走细胞在组织中发现的密闭环境的制约。然而，通过强制迁移在单个维度，它有利于细胞自动跟踪和衡量指标的提取（ 图5）。我们还表明，我们的设备是用荧光显微镜兼容的，因此可以适用于细胞运动的不同阶段（ 图4）来研究细胞器的定位。

本协议中的一个关键步骤是渠道的质量。它以控制在玻璃表面上的硅橡胶的良好粘附是重要的。当粘贴的麻烦出现，检查的第一件事是两个表面的清洁度和等离子清洗机之一。这可能是重要的另一参数为第加载细胞电子密度。自发迁移需要的细胞的通道靠近方便进到管中，并且最优数量应评估为不同的细胞类型。

作为一个例子，我们已经表明DC的自发迁移，但是该系统可以用来分析其他类型的细胞的迁移。在实验室中，我们已经测试主T淋巴细胞，巨噬细胞以及肿瘤细胞系（数据未示出并参照^7-9）。

为了分析渠道细胞迁移，两个主要协议已经过测试。所述第一成像需要通过相衬（10X），并基于自动检测和生成kymographs从迁移细胞^3（ 图5A）。速度，细胞的大小和持续性是，除其他外，可从kymographs被提取的参数。该系统是由kymographs的质量和发展的限制的软件来生成和分析它们。量化数据的第二个和更简单的方法是基于使用Hoechst染色（ 图3）核的半自动化程度的跟踪。使用荧光允许与标准的成像软件移植的跟踪和分析。这种策略的例子已经开发了第一个世界细胞赛跑^12。

鉴于PDMS的表面能吸附几乎任何蛋白质，微通道可以用于评估细胞迁移的细胞外基质蛋白的影响。该通道的几何形状也可以修改，促进细胞迁移的物理约束的影响的研究。

最后，本实验体系可以被用于获取多个条件在单个实验。这一点，再加一个半自动化程度的分析，是具有中等通量筛检新的行动者的发现涉及到兼容D在肿瘤细胞的迁移。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254