Summary
Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d'un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples.
Abstract
La méthode décrite ici permet l'étude de la migration des cellules sous confinement dans une dimension. Il est basé sur l'utilisation de canaux micro-usinés, qui imposent un phénotype de cellules polarisées par des contraintes physiques. Une fois à l'intérieur des canaux, les cellules n'ont que deux possibilités: aller de l'avant ou vers l'arrière. Cette migration simplifié dans lequel la directivité est limitée facilite le suivi automatique des cellules et l'extraction des paramètres quantitatifs pour décrire le mouvement des cellules. Ces paramètres comprennent la vitesse de la cellule, les changements de direction, et les pauses pendant le mouvement. Microcanaux sont également compatibles avec l'utilisation de marqueurs fluorescents et sont donc appropriés pour étudier la localisation des organites intracellulaires et des structures au cours de la migration cellulaire à haute résolution. Enfin, la surface des canaux peut être fonctionnalisé avec des substrats différents, ce qui permet le contrôle des propriétés adhésives des canaux ou l'étude des haptotaxis. En résumé, le système havant que décrit est destiné à analyser la migration des grands nombres de cellules dans des conditions dans lesquelles à la fois la géométrie et la nature biochimique de l'environnement sont contrôlées, ce qui facilite la normalisation et la reproductibilité des expériences indépendantes.
Introduction
La migration est une fonction cellulaire complexe qui est important pour de nombreux processus physiologiques chez les organismes multicellulaires, y compris le développement, les réponses immunitaires, et la régénération des tissus. En outre, certaines situations pathologiques telles que l'invasion tumorale et les métastases reposent sur la motilité cellulaire 1. Pour ces raisons, la migration cellulaire est devenu un domaine d'étude dans le cadre de la recherche à la fois fondamentale et translationnelle. In vivo, la plupart des tissus sont caractérisés par une matrice extracellulaire riche et haute densité cellulaire. La migration cellulaire par conséquent, dans des conditions physiologiques, se produit dans un environnement confiné complexe. Classiquement, probablement pour des raisons historiques et des limites techniques, la migration cellulaire a été étudiée dans les systèmes 2D plats qui ne se reproduisent pas beaucoup des propriétés de l'environnement présentes dans les tissus, tels que l'isolement. De plus, des facteurs comme l'adhésion cellulaire, qui sont essentiels pour la motilité en 2D, ont été récemment montré à ne pas être necessacipalement requis pour la migration in vivo ou à l'intérieur des gels, ce qui suggère que les mécanismes qui régissent la locomotion cellulaire en 2D et dans d'autres environnements sont distincts 2. Plusieurs systèmes ont été développés pour imiter les propriétés complexes des tissus, le plus célèbre des gels de collagène les être, qui visent à récapituler les propriétés de la composition de la matrice extracellulaire 3. Ici, nous proposons des micro-canaux en tant que méthode complémentaire simple qui permet la migration des cellules d'étude dans une dimension dans un environnement confiné.
Dans ce système, les cellules migrent le long des microcanaux dans lesquels ils entrent spontanément. Cellules migratrices acquièrent alors la forme des canaux, l'adoption d'une géométrie tubulaire qui renforce probablement leur polarité. Le mouvement linéaire des cellules dans les canaux de la cellule permet un suivi automatique et l'extraction des paramètres quantitatifs à partir d'expériences. Du point de vue technique, ce système est facile et souple. Le Revêtementsg des parois de canal peut être manipulée, la taille et la forme des canaux peuvent être adaptées, et un grand nombre de cellules peut être analysée dans des expériences simples. Ce système peut également être mis à l'échelle en place pour effectuer l'analyse moyen de l'écran de gamme de molécules impliquées dans la motilité cellulaire. Le protocole décrit ici a été normalisé en utilisant des cellules dendritiques (DC) comme un modèle cellulaire. Ces cellules sont la clé du système immunitaire car ils participent à l'initiation et le maintien de réponses immunitaires spécifiques 4. In vitro, les PED ont été montré pour migrer spontanément dans des environnements confinés et sont donc un bon modèle pour étudier la motilité cellulaire dans des microcanaux 5,6 . Surtout, ce système peut être étendu pour analyser la migration de tout autre type de cellules mobiles comme les lymphocytes T, les neutrophiles, les cellules tumorales ou 9.7.
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Protocol
Note importante: Ce protocole suppose que le moule contenant la forme pour les microcanaux désirés ont déjà été accomplis. Pour plus d'informations sur la préparation du moule a été déjà publié 10. Ce protocole suppose aussi que la culture des pays en développement de la moelle osseuse est connu.
Une. Fabrication de puces
- Mélanger l'huile PDMS et l'agent de durcissement dans un rapport pondéral 10:01 dans un gobelet en plastique. Mélanger soigneusement les deux composés.
- Jetez le mélange sur les microcanaux d'appui du moule. La hauteur totale doit être comprise entre 0,5-1 cm.
- Retirer les bulles d'air dans une cloche de pot sous vide pendant 1 heure.
- PDMS durcir dans le moule, en plaçant celle-ci dans un four pendant 2 heures à 65 ° C.
- Une fois que le PDMS est à température ambiante, couper un gros morceau autour de la structure avec une lame chirurgicale et le retirer du moule (figure 1A).
- Percez des trous où les cellules seront injectées (généralement de 2 mm) et redimensionner le PDMSavec une lame chirurgicale pour s'adapter à la taille des récipients en verre à fond dans lequel la migration sera évaluée (figure 1B). Avant de commencer, enlever la poussière résiduelle de l'antenne à l'aide du papier optique. Cela favorise la liaison de PDMS de verre décrit à l'étape 1.10.
- Nettoyez la puce PDMS redimensionnée contenant les canaux par collage et le pelage du ruban adhésif sur les côtés de la structure.
- Soniquer les morceaux PDMS 30 sec à 70% d'éthanol pour éliminer les poussières et les petites particules de PDMS. Séchez-les rapidement par la suite par soufflage d'air propre.
- Activer le PDMS (structures vers le haut) et des boîtes de culture à l'air (ou d'oxygène) traitement au plasma pendant 30 secondes à 300 mTorr.
- Placez les deux surfaces activées au contact de coller définitivement les PDMS sur le substrat. Si nécessaire, l'utilisation de pinces métalliques à presser légèrement sur le dessus du PDMS pour forcer le contact entre le polymère et le verre de la cuvette (figure 1C).
- Incuber la puce à l'étuve à 65 ° C for 1 h à renforcer la liaison.
2. Revêtement de microcanaux
- Activer l'ensemble de la structure par plasma dans l'air à 300 mTorr pendant 1 min. Cela favorisera l'entrée de liquide dans les canaux à l'étape suivante.
- Remplir rapidement les trous de la puce avec la fibronectine d'entrée à 10 pg / ml dans l'eau. D'autres substrats tels que le PEG peuvent être utilisés pour modifier l'adhérence des cellules aux parois du canal. Veillez à ce que le liquide se répand dans l'ensemble de la structure. Ceci peut être facilement vérifié par l'œil sous la lumière régulière ou en utilisant un microscope ordinaire de champ lumineux.
NOTE: Dans les très petites structures, dont la diffusion est plus difficile, entrée de liquide dans les canaux peut être forcée en plaçant la structure dans une cloche de pot à vide pendant au moins 15 min. Pour vérifier l'efficacité de l'enrobage des substrats fluorescents peuvent être utilisés (figure 2). - Incuber 1 heure à température ambiante pour permettre l'adsorption de la fibronectine ou tout autre revêtement de substévaluer les parois des canaux.
- Lavez les structures 3x avec PBS pour éliminer le substrat nonbound.
- Après le lavage, procéder au protocole 3 ou stocker la puce à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (24 heures maximum).
3. Cellule Chargement en cours
- Retirer le PBS de la plaque et de remplir le microsystème avec du milieu cellulaire. Laissez incuber pendant 1 heure à saturer les canaux avec le milieu.
NOTE: Pour les expériences portant sur des médicaments comme les inhibiteurs de molécules, il est conseillé de pré-incuber les canaux avec un milieu contenant le médicament à la bonne concentration. De plus, certains médicaments ont tendance à se solubiliser dans la structure PDMS qui réduit la concentration efficace. Certaines solutions ont été proposées pour contrer ce problème 11-12. - Retirer les PED flottants et récupérer les cellules semi-adhérentes par balayage avec un milieu de culture. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
REMARQUE: Pour l'imagerie noyau, un Hoechst 33342 coloration peut être obtenue au préalable par decubating 2 x 10 6 cellules pendant 30 min avec le colorant à 200 ng / ml dans du milieu complet. Laver deux fois par centrifugation pour éliminer l'excès de colorant avant de poursuivre le protocole. - Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min (temps et la vitesse peuvent être différents selon le type de cellule) et jeter le milieu. On dilue le culot pour atteindre une concentration de 20 x 10 6 cellules / ml.
- Éliminer l'excès de milieu de la plaque et vider les trous d'entrée dans la structure PDMS à l'aide d'une micropipette. Remplir les entrées avec 5 pl de solution de cellules pour atteindre une quantité de 1 x 10 5 cellules dans chaque trou d'entrée.
REMARQUE: La forte densité de cellule est nécessaire pour favoriser le contact des cellules avec les canaux. La faible densité de cellules peut donner lieu à un faible nombre de cellules à l'intérieur des canaux et l'échec de l'expérience. - Incuber la puce pendant 30 min à 37 ° C dans l'incubateur. Ajouter 2 ml de milieu complet à la boîte de test.
NOTE: L'ensemble de la structure de PDMS doit be couvert afin d'éviter le séchage des cellules au cours de l'expérience. Si 2 ml n'est pas suffisant, ajouter plus de moyen pour couvrir complètement la structure PDMS.
4. Imagerie
- Nettoyer la surface externe du fond des plats avec le tissu de nettoyage de lentille avant de placer les plaques sous le microscope.
- Pour analyser la migration en grand nombre de cellules, utiliser un grossissement de 10X et éclairage grand champ en CO 2 et la température équipée vidéo-microscope (Figure 3). Pour faciliter le suivi de la cellule, coloration de Hoechst et aux rayons UV peut être utilisé (voir l'étape 3.2). La migration peut être également analysée en utilisant la microscopie confocale afin d'obtenir une meilleure résolution des structures cellulaires au cours de la migration.
- Pour la microscopie time-lapse à 10X, pour choisir une fréquence de temps selon la vitesse de cellule attendu (typiquement de 2 min pour les cellules dendritiques migrent à une vitesse de 5 um / min).
Remarque: Le protocole décrit ici ne not comprennent l'analyse des paramètres de migration cellulaire. Quelques points sont répertoriés dans la discussion d'informer les lecteurs sur la façon de procéder pour extraire des informations à partir de films de time-lapse.
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Representative Results
Dans chaque expérience, la surface du PDMS est revêtue d'une molécule adaptée à l'intérêt de l'étude. Figure 2 montre les canaux revêtus d'une molécule fluorescente, PLL-g-PEG, avant et après le lavage (étape 2.4). Une telle expérience permet de contrôler l'homogénéité du revêtement dans les canaux.
Après chargement de la cellule, la microscopie vidéo peut être effectuée pour suivre la migration cellulaire. Figure 3A montre un exemple de la migration des DC dans des microcanaux à une densité appropriée pour suivre les cellules. Deux, contraste de phase et coloration de Hoechst peuvent être utilisés à cette fin (voir Discussion). La technique est également compatible avec la microscopie confocale de fluorescence à résolution plus élevée, et peut être utilisé pour suivre des organites ou des structures cellulaires. Figure 4B montre un exemple de la dynamique de l'actine polymérisée dans les PED exprimant LifeActGFP migration.
Un exemple de cellule de quantificationmotilité analysé dans les PED migration est représentée sur la figure 5. figure 5A montre kymographs générés par WT ou Y27632 PED traités. Y27632 est un inhibiteur bien caractérisé de la contractilité et de la migration des cellules, et a été utilisé pour vérifier la capacité du système pour détecter des changements dans la vitesse. Les kymographs peuvent être en outre analysées pour en extraire la position et la taille des cellules en fonction du temps, ce qui permet l'étude des paramètres différents pour décrire la migration cellulaire. Figure 5B représente la vitesse de migration suivi par le positionnement du noyau de formation d'image à l'aide d'un logiciel maison 13. PED ont une vitesse moyenne de près de 6 um / min. Le traitement par Y27632 diminue considérablement leur vitesse. Cet exemple montre la puissance de la technique, ce qui permet la quantification d'un grand nombre de cellules dans des expériences simples et l'utilité du système pour détecter des différences induites par les traitements médicamenteux. Ceci peut être étendue à l'utilisation de siRNA et le criblage de moles cules impliqués dans le contrôle de la migration.
Figure 1. Étapes de canaux ensemble. Puce PDMS a été reproduit à partir d'un moule de canal. (A) La puce contenant les canaux a été extrait directement du moule. (B) La puce redimensionnée pour s'adapter à l'antenne expérimentale et un trou a été fait pour permettre l'entrée des cellules. (C) La puce a finalement été collé sur le dessus du verre plat. (D et E) Représentation schématique de l'appareil. (D) Vue d'en haut. (E) Vue de côté. Objets verts représentent les cellules dans ou sur les canaux (bleu). Bar 1 cm.
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Figure 2. Revêtement de canaux avec un substrat fluorescent. (A) 5 x 5 um um canaux incubées avec du PEG de fluorescence à 100 pg / ml pendant 1 heure. (B) représentatif de l'image fluorescente PEG restant après lavage PBS des canaux. Bar 50 um.
Figure 3. Cellules qui migrent le long des microcanaux. Contraste de phase (gris) et le noyau coloration (bleu) des cellules qui migrent dans 5 um x 5 um canaux micro-usinés. (A) Une seule image extraite d'un film de DC migration le long des canaux. (B) Montage montrant le déplacement d'une sélectionted DC migration le long des canaux. Les flèches blanches indiquent les cellules qui migrent. Échelle de temps 1 img / 2 min. Bar 50 um.
Figure 4. Exemple de cellules à haute résolution dans des microcanaux. Imagerie à haute résolution des PED qui migrent le long des microcanaux simples. (A) Montage des images à contraste de phase (1 img/20 sec) d'une migration de DC dans un microcanal (grossissement 100X). (B) Montage d'un LifeAct exprimant DC (faits saillants polymérisés actine) montrant la compatibilité du système avec l'imagerie de fluorescence (1 img/20 sec, 60x, section optique unique). Actine polymérisée est en noir. taille de la chaîne 10 m de large x 5 um élevé. Bar 10 um.
Figure 5. Des résultats représentatifs de pays en développement qui migrent le long des microcanaux. Ce chiffre illustre le type d'analyse qui peut être fait à partir de films de cellules qui migrent le long des microcanaux. Figure 5A montre kymographs générés à partir d'images de contraste de phase de temps de déchéance de WT ou Y27632 PED traités migrateurs dans microcanaux (10X, 1 img / 2 min). figure 5B montre un exemple de quantification de la vitesse de cellules obtenu après le suivi du noyau DC en utilisant la coloration de Hoechst et un logiciel maison 13. Les données sont analysées en utilisant un t test non paramétrique (test de Mann-Whitney). Bar 100 um.
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Discussion
Ici, nous décrivons un dispositif composé de microcanaux comme une méthode pour étudier les propriétés migratoires des grand nombre de cellules dans des expériences simples. Ce système expérimental imite les contraintes environnementales confinés trouvés dans les tissus par des cellules migratoires endogènes. Cependant, en forçant la migration dans une seule dimension, il facilite le suivi automatique de la cellule et l'extraction de paramètres mesurables (Figure 5). Nous montrons également que notre appareil est compatible avec la microscopie par fluorescence et peut donc être adapté pour étudier le positionnement des organites durant les différentes phases de la motilité cellulaire (Figure 4).
Une étape critique dans le protocole, c'est la qualité des canaux. Il est important de contrôler la bonne adhérence des PDMS sur la surface du verre. Quand les problèmes de collage apparaissent les premières choses à vérifier sont la propreté des deux surfaces et celui du filtre à plasma. Un autre paramètre qui peut être critique est ee de la densité de cellules chargées. La migration spontanée nécessite de la proximité des cellules des canaux pour faciliter l'entrée dans les tubes, et le nombre optimal doit être évaluée pour chaque type de cellule.
A titre d'exemple, nous avons montré la migration spontanée des CD, mais le système peut être utilisé pour analyser la migration d'autres types de cellules. Au laboratoire, nous avons testé les lymphocytes T primaires, les macrophages ainsi que des lignées de cellules de tumeur (données non présentées et les références 7-9).
Afin d'analyser la migration des cellules dans les canaux, deux protocoles principaux ont été testés. La première nécessite l'imagerie par contraste de phase (10X), et est basé sur la détection automatique et la génération de la migration des cellules de kymographs 3 (figure 5A). La vitesse, la taille des cellules et la persistance sont, entre autres, les paramètres qui peuvent être extraits à partir de kymographs. Ce système est limitée par la qualité des kymographs et au développement d'le logiciel pour générer et analyser. Une deuxième manière et plus facile à quantifier les données est basée sur le suivi des semi-automatisée de noyau en utilisant la coloration de Hoechst (Figure 3). L'utilisation de la fluorescence permet le suivi et l'analyse de la migration avec le logiciel d'imagerie standard. Un exemple de cette stratégie a été élaborée pour la première course de la cellule du monde 12.
Étant donné que la surface du PDMS peut être adsorbé avec pratiquement n'importe quelle protéine, les microcanaux peuvent être utilisés pour évaluer l'impact des protéines de la matrice extracellulaire dans la migration cellulaire. La géométrie des canaux peut également être modifié, ce qui facilite l'étude de l'impact des contraintes physiques dans la migration cellulaire.
Enfin, ce système expérimental peut être adapté pour acquérir plusieurs conditions dans les expériences individuelles. Ceci, combiné avec une analyse semi-automatisé, est compatible avec les projections de débit moyen pour la découverte de nouveaux acteurs impliquerd dans la migration des cellules cancéreuses.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient grandement la plate-forme IBiSA PICT à l'Institut Curie (CNRS UMR 144). Ce travail a été financé par des subventions de: le Conseil européen de la recherche à AM.LD (Strapacemi 243103), l'Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-Piri-0027-CPV), la fondation InNaBioSanté (Micemico) à MP et AM. LD et l'ERC Strapacemi jeune subvention de chercheur à AM.LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
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