Summary
שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.
Abstract
השיטה המתוארת כאן מאפשרת הלימוד של נדידת תאים תחת כליאה בממד אחד. היא מבוססת על השימוש בערוצי microfabricated, המטילים הפנוטיפ מקוטב לתאים על ידי אילוצים פיזיים. ברגע שערוצים פנימיים, יש תאים רק שתי אפשרויות: לנוע קדימה או אחורה. ההגירה פשוטה הזה שבו כיווניות מוגבלת מאפשרת מעקב האוטומטי של תאים והחילוץ של פרמטרים כמותיים כדי לתאר את תנועת תא. פרמטרים אלה כוללים תא מהירות, שינויי כיוון, והפסקות בזמן התנועה. Microchannels גם תואם את השימוש בסמני ניאון ולכן מתאימים ללמוד לוקליזציה של האברונים ומבנים תאיים במהלך נדידת תאים ברזולוציה גבוהה. לבסוף, את פני השטח של הערוצים יכולים להיות פונקציונליות עם מצעים שונים, המאפשרים שליטה על מאפייני ההדבקה של הערוצים או המחקר של haptotaxis. לסיכום, מערכת שעותפה תאר נועד לנתח את ההגירה של מספרים סלולריים גדולים בתנאים שבהם הן את הגיאומטריה והטבע ביוכימיים של הסביבה מבוקרות, להקל על הנורמליזציה ושחזור של ניסויים בלתי תלויים.
Introduction
הגירה היא פונקצית הסלולר מורכבת שחשובה לתהליכים פיסיולוגיים רבים באורגניזמים רב תאיים, כוללים פיתוח, תגובות חיסוניים, והתחדשות רקמות. בנוסף, במצבים מסוימים פתולוגיים כגון פלישת גידול וגרורות להסתמך על תא תנועתיות 1. מסיבות אלה, נדידת תאים הפכה לשדה עיקרי של מחקר בהקשר של מחקר בסיסי והן translational. בvivo, רוב הרקמות מאופיינות במטריצה תאית עשירה וצפיפות תאים גבוהה. נדידת תאים ולכן, בתנאים פיסיולוגיים, מתרחשת בסביבה מוגבלת מורכבת. קלסי, ככל הנראה בשל סיבות היסטוריות ומגבלות טכניות, נדידת תאים נחקרה במערכות 2D שטוחות שלא מתרבות רבים של מאפייני הסביבה שנמצאו ברקמות, כגון כליאה. יתר על כן, גורמים כמו הידבקות תא, שהם חיוניים לתנועתיות ב2D, כבר הראו לאחרונה לא להיות necessarily נדרש להגירה in vivo או בתוך ג'לים, טוען כי המנגנונים השולטים תנועת תאים ב2D ובסביבות אחרות נבדלים 2. מספר מערכות פותחו כדי לחקות את התכונות מורכבות של רקמות, ג'ל קולגן להיות המפורסם ביותר, אשר מכוונות למשחזר את המאפיינים של הרכב המטריצה תאי 3. כאן אנו מציעים microchannels כשיטה משלימה פשוט, המאפשרת נדידת תאי מחקר בממד אחד תחת סביבה מוגבלת.
במערכת זו תאים נודדים לאורך microchannels שלתוכו הם נכנסים באופן ספונטני. תאים נודדים ולאחר מכן לרכוש את הצורה של הערוצים, אימוץ גיאומטריה צינורי שסביר להניח שמחזקת את הקוטביות שלהם. התנועה ליניארית של התאים בערוצים מאפשרת מעקב תא אוטומטי והחילוץ של פרמטרים כמותיים מניסויים. מנקודת מבט הטכנית, מערכת זו היא קלה וגמישה. Coatinגרם של קירות הערוץ ניתן להשפיע, בגודל ובצורה של הערוצים יכולים להיות מותאם, ומספר גדול של תאים ניתן לנתח בניסויים אחת. מערכת זו ניתן לשנותם למעלה גם לבצע ניתוח מסך לטווח בינוני של מולקולות מעורבות בתנועתיות תא. הפרוטוקול המתואר כאן כבר טופל תוך שימוש בתאים דנדריטים (DC) כמודל סלולארי. תאים אלה הם מפתח למערכת החיסונית כפי שהוא להשתתף בייזום והאחזקה של תגובות חיסוניים ספציפיות 4. במבחנה, DCS הוכחו להעביר באופן ספונטני בסביבות מוגבלות ולכן הם מודל טוב ללמוד תנועתיות תא בmicrochannels 5,6 . חשוב מכך, מערכת זו ניתנת להארכה לניתוח הגירה של כל סוג תא אחר ניעתי כלימפוציטים מסוג T, נויטרופילים, או תאים סרטניים 7-9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה חשובה: בפרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שהעובש המכיל את הצורה לmicrochannels הרצויה כבר כבר עשה. מידע נוסף על ההכנה של העובש כבר פורסם כבר 10. פרוטוקול זה גם בהנחה שתרבות DCs מח עצם ידועה.
1. ייצור שבבים
- מערבבים את שמן PDMS וסוכן ריפוי ב10:01 יחס משקל בכוס פלסטיק. מערבבים את שני התרכובות ביסודיות.
- להטיל את התערובת מעל microchannels נושאות העובש. הגובה הכולל חייב להיות בין 0.5-1 סנטימטר.
- הסר בועות אוויר בפעמון צנצנת ואקום בשעה 1.
- PDMS הרדן בעובש על ידי הנחת האחרון בתנור במשך שעה 2 ב 65 ° C.
- ברגע PDMS הוא בטמפרטורת חדר, לחתוך חתיכה סביב המבנה גדולה עם להב כירורגים ולקלף אותו מהתבנית (איור 1 א).
- לקדוח חורים שבו תא יהיה מוזרק (בדרך כלל 2 מ"מ) ולשנות את גודל PDMSעם להב כירורגים בהתאם לגודל לזכוכית תחתונה מנות שבהגירה תיבחן (איור 1). לפני שימשיך, להסיר אבק שנותר בצלחת באמצעות ניקוי עדשות נייר. זה מעדיף מחייב של PDMS לזכוכית מתוארת בשלב 1.10.
- נקה את שבב PDMS לשנות את הגודל המכיל את הערוצים על ידי דבק וקילוף נייר דבק בצידי המבנה.
- Sonicate חתיכות PDMS 30 שניות ב70% אתנול להסיר אבק וחלקיקי PDMS קטנים. ייבש אותם במהירות לאחר מכן על ידי נשיפת אוויר נקי.
- הפעל את PDMS (מבנים כלפי מעלה) ומנות תרבות בדרך אוויר (או חמצן) טיפול פלזמה במהלך 30 שניות ב300 mTorr.
- הנח שני משטחים מופעלים במגע להישאר באופן קבוע PDMS למצע. במידת הצורך, להשתמש במלקחיים מתכתיים ללחוץ מעט על החלק העליון של PDMS לכפות המגע בין הפולימר והזכוכית של הצלחת (איור 1 ג).
- דגירה השבב בתנור ב 65 מעלות צלזיוס עבורr 1 שעות כדי לחזק את מחייב.
2. ציפוי של microchannels
- הפעל את כל המבנה על ידי פלזמה אוויר ב300 mTorr דקות 1. זה יקדם את הכניסה של נוזל לערוצים בשלב הבא.
- מלאו במהירות את חורי הכניסה של השבב עם פיברונקטין ב10 מיקרוגרם / מיליליטר במים. מצעים אחרים כגון PEG עשויים לשמש כדי לשנות היצמדות תא לקירות הערוץ. שים לב שהנוזל מתפשט בכל המבנה כולו. זה ניתן לבדוק בקלות על ידי העין תחת אור רגיל או באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל.
הערה: במבנים קטנים מאוד, שבו דיפוזיה היא קשה יותר, כניסה של נוזל בערוצים ניתן לכפות על ידי הצבת המבנה בפעמון צנצנת ואקום בלפחות 15 דקות. כדי לוודא את היעילות של הציפוי ניתן להשתמש במצעי ניאון (איור 2). - דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר לספיחה של פיברונקטין או כל subst ציפוי אחרשיעור לקירות של הערוצים.
- לשטוף את המבנים 3x עם PBS להסיר את מצע nonbound.
- לאחר כביסה, להמשיך לפרוטוקול 3 או לאחסן את השבב על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר (24 מקסימום שעה).
3. טעינה נייד
- הסר את PBS מהצלחת ולמלא את microsystem עם מדיום סלולרי. בואו דגירה עבור שעה 1 כדי להרוות את הערוצים עם המדיום.
הערה: לניסויים הכוללים תרופות כמו מעכבי מולקולה, מומלץ לpreincubate ערוצים עם מדיום המכיל את התרופה בריכוז הנכון. יתר על כן, תרופות מסוימות נוטות solubilize במבנה PDMS אשר מפחית את הריכוז היעיל. כמה פתרונות הוצעו כדי לנטרל נושא זה 11-12. - הסר DCs הצף ולשחזר תאים למחצה חסיד על ידי שטיפה עם מדיום לתרבות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
הערה: לקבלת הדמיה גרעין, מכתים Hoechst 33342 יכול להיות מושגת על ידי מראש בcubating 2 x 10 6 תאים במהלך 30 דקות עם הצבע ב200 / מיליליטר ng במדיום שלם. לשטוף פעמיים על ידי צנטריפוגה כדי להסיר את העודפים של צבע לפני שתמשיך את הפרוטוקול. - צנטריפוגה התאים ב XG 300 במהלך 5 דקות (זמן ומהירות יכולים להיות שונים בהתאם לסוג התא) וזורקים את המדיום. לדלל את גלולה להגיע לריכוז של 20 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- להסיר את העודפים של מדיום מהצלחת ורוקן את חורי הכניסה במבנה PDMS באמצעות micropipette. מלא את הערכים עם 5 μl של פתרון תא להגיע לסכום של 1 x 10 5 תאים בכל חור כניסה.
הערה: צפיפות תאים גבוהה נדרשת להעדיף את הקשר של התאים עם הערוצים. צפיפות תא נמוכה עלולה לגרום למספר הנמוך של תאים בתוך ערוצים וכישלון של הניסוי. - דגירה השבב ל30 דקות ב 37 ° C בחממה. הוסף 2 מיליליטר של מדיום שלם לצלחת הניסוי.
הערה: מבנה PDMS כולה צריך bדואר מכוסה על מנת למנוע התייבשות של התאים במהלך הניסוי. אם 2 מיליליטר זה לא מספיק, להוסיף עוד מדיום כדי לכסות את מבנה PDMS לחלוטין.
4. הדמיה
- נקה את המשטח התחתון החיצוני של המנות עם רקמת ניקוי עדשה לפני ששם את הצלחות מתחת למיקרוסקופ.
- כדי לנתח את ההגירה במספר גדול של תאים, השתמש 10X ההגדלה ותאורה בשדה רחב בוידאו מיקרוסקופ מצויד CO 2 וטמפרטורה (איור 3). כדי להקל על מעקב תא, אור מכתים וUV Hoechst יכול לשמש (ראה שלב 3.2). הגירה יכולה להיות גם נותחה באמצעות מיקרוסקופיה confocal כדי לקבל רזולוציה גבוהה יותר של מבנים הסלולר במהלך נדידה.
- למיקרוסקופיה זמן לשגות ב10X, בחר בתדירות זמן בהתאם למהירות התאים הצפויה (בדרך כלל 2 דקות לתאי דנדריטים נודדים עם מהירות של 5 מיקרומטר / min).
הערה: הפרוטוקול המתואר כאן עושה not כולל ניתוח של הפרמטרים נדידת תאים. כמה נקודות מפורטות בדיון על מנת להודיע לקוראים על איך להמשיך כדי לחלץ מידע מהזמן לשגות סרטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בכל ניסוי את פני השטח של PDMS הוא מצופה במולקולה המותאמת לאינטרס של המחקר. איור 2 ערוצי הופעות מצופים במולקולת ניאון, PLL-G-PEG, לפני ואחרי שטיפה (שלב 2.4). ניסוי כזה מאפשר שליטה על ההומוגניות של הציפוי בערוצים.
לאחר טעינה סלולרי, מיקרוסקופ וידאו ניתן לבצע כדי לעקוב אחר נדידת תאים. איור 3 א מציג דוגמא של DC הנודד בmicrochannels בצפיפות מתאימה כדי לעקוב אחר התאים. שניהם, בניגוד שלב ומכתים Hoechst יכולים לשמש למטרה זו (ראה דיון). הטכניקה היא גם תואמת עם מיקרוסקופיה confocal ניאון ברזולוציה גבוהה יותר, וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר האברונים או מבנים הסלולר. איור 4 מראה דוגמא של הדינמי של אקטין polymerized בנודד DCs להביע LifeActGFP.
דוגמא לכימות של תאתנועתיות ניתחו בDCs הנודד מוצגת באיור 5. איור 5A תערוכות kymographs נוצר מWT או Y27632 DCs טופל. Y27632 הוא מעכב מאופיין היטב של התכווצות תא והגירה, ושימש כדי לאמת את יכולתה של המערכת לזהות שינויים במהירות. Kymographs ניתן לנתח נוסף כדי לחלץ מיקום וגודל של תאים כפונקציה של זמן, המאפשר הלימוד של פרמטרים שונים כדי לתאר את נדידת תאים. איור 5 מציג את המהירות של הגירת מעקב מיצוב גרעין הדמיה באמצעות תוכנה מתוצרת בית 13. יש לי DCs ממוצע מהירות קרובה ל6 מיקרומטר / min. טיפול עם Y27632 מקטין באופן משמעותי את המהירות שלהם. דוגמא זו מראה את כוחה של הטכניקה, המאפשרת כימות של מספר הגדול של תאים בניסויים יחיד ואת התועלת של המערכת לזהות הבדלים הנגרמים על ידי טיפולים תרופתיים. זה יכול להיות מורחב לשימוש של siRNA וההקרנה של שומה cules מעורב בשליטה על ההגירה.
איור 1. שלבים בהרכבת ערוצים. שבב PDMS היה משוכפל מעובש ערוץ. () השבב המכיל את הערוצים הופק ישירות מהעובש. (ב) לשנות את גודל השבב כדי להתאים את המנה הניסיונית וחור נעשה על מנת לאפשר את כניסתם של התאים. (C) השבב סוף סוף הודבק על גבי צלחת הזכוכית. ייצוג סכמטי (D ו-E) של המכשיר. מבט מלמעלה (ד '). מבט צד (E). אובייקטים ירוקים מייצגים תאים באו ערוצים החוצה (כחול). בר 1 סנטימטר.
"Src =" es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
איור 2. ציפוי של ערוצים עם מצע ניאון. () 5 מיקרומטר x 5 מיקרומטר ערוצים הודגרו עם PEG ניאון ב100 מיקרוגרם / מיליליטר בשעה 1. (ב) נציג תמונה של PEG הניאון שנותר לאחר שטיפת PBS של הערוצים. בר 50 מיקרומטר.
איור 3. תאים נודדים לאורך microchannels. בניגוד שלב צביעה (אפורה) וגרעין (כחולה) של תאים נודדים ב5 מיקרומטר x 5 מיקרומטר ערוצי microfabricated. (א) תמונה יחידה שחולצה מסרט של DCs הנודד לאורך ערוצים. (ב) Montage מראה את התזוזה של אין תמיכה בבחירהטד DC הנודד לאורך ערוצים. חצים לבנים מצביעים על תאים נודדים. img / 2 דקות לוח זמנים 1. בר 50 מיקרומטר.
איור 4. דוגמא של תאים ברזולוציה גבוהה בmicrochannels. הדמיה ברזולוציה גבוהה של DCs נודד יחד microchannels אחת. () מונטאז' של תמונות בניגוד שלב (1 שניות img/20) של DC הנודד בmicrochannel (הגדלה 100X). (ב) Montage של lifeact להביע DC (מדגיש polymerized אקטין) מראה תאימות של המערכת עם דימות פלואורסצנטי (1 שניות img/20, הגדלה 60x, סעיף אופטי יחיד). אקטין polymerized מוצג בשחור. גודל ערוץ 10 מיקרומטר מיקרומטר x 5 הרחב גבוהים. בר 10 מיקרומטר.
איור 5. נציג תוצאות של DCs נודד יחד microchannels. נתון זה ממחיש את סוג הניתוח שאפשר לעשות מסרטים של תאים נודדים לאורך microchannels. 5A איור מראה kymographs שנוצר מתמונות שלב הזמן לשגות ניגודיות של WT או Y27632 DCs טופל נודדים ב microchannels (10X, img / 2 1 דקות). איור 5 מראה דוגמא של כימות של תא מהירות המתקבלת לאחר מעקב גרעין DC באמצעות מכתים Hoechst ותוכנה מתוצרת בית 13. הנתונים נותחו באמצעות מבחן t פרמטרית (מבחן מאן ויטני). בר 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים מכשיר המורכב מmicrochannels כשיטה כדי ללמוד את מאפייני הנדידה של מספר הגדול של תאים בניסויים אחת. מערכת ניסיונית זה מחקה את הסביבה האילוצים מוגבלים נמצאים ברקמות על ידי תאים נודדים אנדוגני. עם זאת, על ידי אילוץ הגירה בממד אחד, זה מקל על מעקב תא אוטומטי והחילוץ של measurables (איור 5). כמו כן, אנו מראים כי המכשיר שלנו הוא בקנה אחד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכן ניתן להתאים ללמוד מיצוב אברון במהלך השלבים השונים של תנועתיות תא (איור 4).
שלב קריטי בפרוטוקול הוא באיכות של הערוצים. זה חשוב כדי לשלוט בדבק הטוב של PDMS על משטח הזכוכית. כאשר צרות של דבק מופיעות הדברים הראשונים שיש לבדוק הם את הניקיון של שני משטחים ואחד של שואב הפלזמה. פרמטר נוסף שעשויה להיות קריטי הוא הצפיפות דואר של תאים טעונים. ההגירה הספונטנית דורשת סמיכות של התאים לערוצים כדי להקל על כניסתו לצינורות, והמספר האופטימלי צריך להיות מוערך לכל סוג תא.
כדוגמא, יש לנו לראות את הנדידה הספונטנית של DCS, אבל המערכת יכולה לשמש גם כדי לנתח את ההגירה של תאים מסוגים אחרים. במעבדה, אנחנו צריכים לבדוק לימפוציטים עיקריים T, מקרופאגים, כמו גם שורות תאי גידול (מידע לא מוצג ואזכור 7-9).
כדי לנתח את נדידת תאים בערוצים, שני פרוטוקולים עיקריים נבדקו. הראשון דורש הדמיה בניגוד שלב (10X), והוא מבוסס על זיהוי האוטומטי ודור של kymographs מתאים נודדים 3 (איור 5 א). מהירות, גודל תא והתמדה הם, בין יתר, פרמטרים שניתן לחלץ מkymographs. מערכת זו היא מוגבלת על ידי איכות kymographs ולפיתוח שלהתוכנה כדי ליצור ולנתח אותם. דרך שנייה וקלה יותר לכמת את הנתונים מבוססת על המעקב-automatized חצי של הגרעין באמצעות מכתים Hoechst (איור 3). השימוש בקרינה מאפשרת מעקב וניתוח של הגירה עם תוכנת הדמיה סטנדרטית. דוגמא לאסטרטגיה כזו פותחה למרוץ הסלולרי הראשון בעולם 12.
בהתחשב בכך את פני השטח של PDMS ניתן נספחת עם כמעט כל חלבון, יכולה לשמש microchannels כדי להעריך את ההשפעה של חלבוני מטריצת חוץ תאיים בנדידת תאים. הגיאומטריה של הערוצים יכולה להיות גם שונה, להקל על המחקר של ההשפעה של אילוצים פיזיים בנדידת תאים.
לבסוף, מערכת ניסיונית זו יכולה להיות מותאמת לרכישה מספר תנאים בניסויים אחת. זה, יחד עם ניתוח automatized למחצה, תואם את הקרנות תפוקה בינונית לגילוי שחקנים החדשים כרוךד בהגירה של תאי סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים באופן משמעותי את פלטפורמת PICT IBiSA במכון קירי (CNRS UMR144). עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ: המועצה האירופית למחקר לAM.LD (Strapacemi 243,103), Nationale האיגוד לשפוך la משוכלל ונדיר (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), קרן InnaBiosanté (Micemico) ל MP וPM. LD ומענק ERC חוקר הצעיר Strapacemi לAM.LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H.
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
