Summary
일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
Abstract
여기에 설명 된 방법은 하나의 차원에 감금에서 세포 이동의 연구를 할 수 있습니다. 그것은 물리적 제약에 의해 세포에 편광 표현형을 부과 미세 채널의 사용에 기초한다. 앞으로 또는 뒤로 이동 : 내부 채널되면, 세포는 두 가지 가능성이있다. 방향성이 제한되어있는이 지연 마이그레이션 세포의 자동 추적 및 세포의 움직임을 설명하기 위해 정량적 파라미터의 추출을 용이하게한다. 이러한 매개 변수는 이동 중에 휴대 속도, 방향 변경 및 일시 정지 (가) 있습니다. 마이크로 채널은 형광 마커의 사용과 호환이 가능하며 높은 해상도의 세포 이동하는 동안 세포 내 소기관과 구조의 현지화를 연구하는 것이 적합하다. 마지막으로, 채널의 표면은 채널 또는 haptotaxis의 연구의 접착 특성의 조절을 허용하는 다른 기판으로 작용 될 수있다. 요약하면, 시스템 H설명 감수는 독립적 인 실험의 정규화 및 재현성을 용이 기하학과 환경의 생화학 적 성질 양쪽이 제어 된 상태에서 대 세포 수의 마이그레이션을 분석하기위한 것이다.
Introduction
마이그레이션 개발, 면역 반응 및 조직 재생 등의 다세포 생물의 많은 생리적 과정에 대한 중요한 복잡한 세포 기능입니다. 또, 종양의 침윤과 전이 같은 특정한 병리학 적 상황은 세포 운동성 하나에 의존한다. 이러한 이유로, 세포의 이동은 기본 및 번역 두 연구의 맥락에서 연구의 주요 분야가되고있다. 생체 내 대부분의 조직이 풍부한 세포 외 기질 (extracellular matrix)과 높은 세포 밀도를 특징으로하고 있습니다. 세포의 이동, 따라서 생리적 인 조건 하에서, 복잡한 제한 환경에서 발생합니다. 고전적으로, 가장으로 인해 역사적인 이유와 기술적 한계와 가능성, 세포의 이동은 제한 등의 조직에서 발견되는 환경의 여러 속성을 복제하지 않는 평면 2D 시스템에서 연구되고있다. 또한, 2 차원 운동에 필수적인 세포 부착과 같은 요인은 최근 necessa하지에 보여 주었다되었습니다RILY 2D와 다른 환경에서 세포의 운동을 지배하는 메커니즘이 2 별개 것을 제안, 생체 내에서 또는 젤 내부의 마이그레이션이 필요합니다. 몇몇 시스템은 세포 외 매트릭스 조성물 (3)의 특성을 recapitulating 목표 조직, 가장 유명한 존재 콜라겐 겔의 복잡한 특성을 모방하기 위해 개발되었다. 여기에서 우리는 제한된 환경에서 한 차원에서 연구 세포 이동을 할 수있는 간단한 상호 보완적인 방법으로 마이크로을 제안한다.
이 시스템에서 세포가 자발적으로 입력 할 수로 마이크로를 따라 이동한다. 이동성 세포는 대부분 그들의 극성을 강화 관형 형상을 채용하는, 채널의 형상을 취득. 채널에있는 세포의 선형 이동은 자동 세포 추적 및 실험으로부터 정량적 파라미터의 추출을 허용한다. 기술적 인 관점에서 볼 때이 시스템은 간단하고 유연합니다. 코팅 된채널 벽의 g는 채널의 크기 및 형상이 적용될 수있다, 조작 될 수 있고, 다수의 셀은 하나의 실험에서 분석 될 수있다. 이 시스템은 또한 스케일 업 할 수있다 세포 운동성에 관련된 분자의 중거리 화면 분석을 수행. 여기에 설명 된 프로토콜은 셀룰러 모델로서 수지상 세포 (DC)를 이용하여 표준화되었다. 그들은 4. 시험관, DC가 자발적으로 제한된 환경에서 마이그레이션하는 것으로 나타났다 특정 면역 반응의 개시 및 유지 보수에 참여하고, 따라서 마이크로 5,6에서 세포 운동성을 연구하는 좋은 모델이기 때문에이 세포는 면역 체계의 핵심이다 . 중요한 것은,이 시스템은 T 림프구, 호중구, 또는 종양 세포 7-9과 같은 다른 세포 운동성 분류 마이그레이션을 분석하기 위해 확장 될 수있다.
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Protocol
중요 사항 :이 프로토콜은 원하는 마이크로의 형태를 포함하는 형이 이미 만들어진 것으로 가정합니다. 금형의 준비에 대한 자세한 정보가 이미 10을 발표했습니다. 이 프로토콜은 또한 골수 DC의 문화를 알고 있다고 가정합니다.
1. 칩 제조
- 플라스틱 컵의 중량비 10:1 PDMS 오일 및 경화제를 혼합한다. 철저하게 두 화합물을 혼합.
- 금형 베어링 마이크로에 믹스를 캐스팅합니다. 총 높이가 0.5 cm 사이 여야합니다.
- 1 시간 동안 진공 항아리 종에 공기 방울을 제거합니다.
- 65 ℃에서 2 시간 동안 오븐에서 후자를 배치하여 금형 강화 PDMS
- PDMS는 실온에서되면, 수술 칼날 구조의 주위에 큰 조각을 잘라 금형 (그림 1A)에서 벗긴다.
- 세포가 주입 할 구멍 (일반적으로 2mm)를 드릴 PDMS에게 크기를 조정마이그레이션 (그림 1B)를 평가한다있는 유리 바닥 요리에 크기에 맞게 수술 블레이드. 계속 진행하기 전에 용지를 청소 렌즈를 사용하여 요리에서 잔여 먼지를 제거합니다. 이 단계 1.10에 설명 된 유리에 PDMS의 바인딩을 선호한다.
- 구조 측면에 접착 테이프를 부착 박리하여 채널을 포함하는 크기를 조정 PDMS 칩을 청소합니다.
- 먼지와 작은 PDMS 입자를 제거하기 위해 70 % 에탄올에 PDMS 조각 30 초 초음파 처리. 깨끗한 공기를 불어 빨리 나중에 그들을 건조.
- 300 mTorr로 30 초 동안 공기 (산소)에 의해 (위쪽 구조) PDMS와 배양 접시를 활성화 플라즈마 처리.
- 영구적으로 기판에 PDMS를 고집 접촉을 모두 활성화 된 표면을 놓습니다. 필요한 경우, 폴리머 및 접시 (그림 1C)의 유리 사이의 접촉을 강제로 PDMS의 상단에 약간 눌러 금속 집게를 사용합니다.
- 65 ° C에서 FO 오븐에서 칩을 품어바인딩을 강화하기 위해 R 1 시간.
2. 마이크로 채널의 코팅
- 1 분 동안 300 mTorr의에서 공기 플라즈마에 의해 전체 구조를 활성화합니다. 이것은 다음 단계에서 채널로의 액체의 침입을 촉진 할 것이다.
- 물에 10 ㎍ / ml로 빠르게 피브로넥틴과 칩의 항목 구멍을 채우십시오. 예컨대 PEG와 같은 다른 기판은 상기 채널 벽에 세포 부착을 수정하기 위해 사용될 수있다. 액체가 전체 구조에 걸쳐 펼쳐지는주의를 기울이십시오. 이것은 쉽게 일반 조명 아래 또는 일반 밝은 필드 현미경을 사용하여 눈으로 확인할 수 있습니다.
참고 : 확산이 어렵게되는 매우 작은 구조에서 채널에있는 액체의 항목은 적어도 15 분 동안 진공 항아리 종의 구조를 배치하여 강제 할 수 있습니다. 형광 기질이 사용될 수 코팅 효율 (도 2)를 확인하기 위해. - 피브로넥틴의 흡착 또는 기타 코팅 SUBST을 허용하도록, 실온에서 1 시간 부화채널의 벽에 속도.
- 구조는 nonbound 기판을 제거하는 PBS로 3 배 씻으십시오.
- 세탁 후, 프로토콜 3로 이동하거나 나중에 사용하기 (24 시간 최대)에 4 ° C에서 칩을 저장합니다.
3. 셀 로딩
- 플레이트에서 PBS를 제거하고 세포 매체로 마이크로를 입력합니다. 매체와 채널이 포화에 1 시간 동안 품어 보자.
참고 : 분자 억제제와 같은 약물을 포함하는 실험을 위해, 그것은 오른쪽 농도로 약물을 포함하는 매체 채널을 preincubate하는 것이 좋습니다. 또한, 일부 약물의 유효 농도를 감소 PDMS 구조에 용해하는 경향이있다. 일부 솔루션은이 문제 11-12 대응하기 위해 제안되었다. - 부동의 DC를 제거하고 배지로 세척하여 반 부착 세포를 복구 할 수 있습니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
참고 : 핵 영상의 경우, 훽스트 33342 염색에 사전에 달성 될 수있다완전 배지에서 200 겨 / ㎖에서 염료로 30 분 동안 2 × 10 6 세포를 cubating. 프로토콜을 계속하기 전에 색소의 과잉을 제거하는 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. - 5 분 (시간 및 속도는 세포 유형에 따라 상이 할 수 있음) 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리하고 배지를 폐기. 20 × 106 세포 / ml의 농도에 도달하는 펠릿을 희석.
- 플레이트로부터 배지를 제거하고 과량의 마이크로 피펫을 이용하여 PDMS 구조 진입 구멍을 비우. 각 항목의 구멍에 1 × 10 5 세포의 양에 도달하는 세포 용액 5 μL가있는 항목을 입력합니다.
참고 : 높은 세포 밀도가 채널 세포의 접촉을 선호하는 데 필요합니다. 낮은 세포 밀도는 채널과 실험의 실패 세포 내부의 낮은 숫자가 발생할 수 있습니다. - 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 마이크로 칩을 품어. 실험 접시에 완전 배지 2 ㎖를 추가합니다.
참고 : 전체 PDMS 구조는 ㄱ합니다E 실험 기간 동안 셀의 건조를 방지하기 위해 덮여있다. 2 ㎖가 충분하지 않다면, 완전히 PDMS 구조를 덮도록 더 배지를 추가한다.
4. 영상
- 현미경으로 번호판을하기 전에 렌즈 청소 조직과 요리의 외부 바닥면을 청소합니다.
- 세포의 많은 수의 이동을 분석하기 위해, CO 2 및 온도 갖춘 비디오 현미경 10X 확대와 폭 넓은 분야의 조명 (그림 3)를 사용합니다. 세포의 추적을 용이하게하기 위해, 훽스트 염색 및 UV 광 (단계 3.2 참조) 사용할 수있다. 마이그레이션 또한 이송시 세포 구조의 높은 해상도를 얻기 위해 공 초점 현미경을 사용하여 분석 할 수있다.
- 10 배의 시간 경과 현미경의 경우, 예상되는 셀 속도 (5 μm의 / 분의 속도로 마이그레이션하는 수지상 세포에 대한 일반적으로 2 분)에 따라 시간 주파수를 선택합니다.
참고 : 여기에 설명 된 프로토콜은 N을 수행구약은 세포 이동 파라미터들의 분석을 포함한다. 몇 가지 포인트는 시간 경과 영화에서 정보를 추출하기 위해 진행하는 방법에 대한 독자 조언을 토론에 나와 있습니다.
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Representative Results
각 실험에서 PDMS의 표면이 연구의 관심에 적응 분자로 코팅된다. 전에 (단계 2.4)으로 세척 한 후에 형광 분자, PLL-g-PEG로 코팅이 방송 채널 도표. 이러한 실험은 채널의 코팅의 균일 성을 제어 할 수 있습니다.
셀 로딩 후, 비디오 현미경은 세포 이동을 따라 수행 될 수있다.도 3a는 DC가 세포를 추적하기 위해 적절한 밀도로 마이크로 채널 마이그레이션의 일례를 나타낸다. , 위상차 및 훽스트 염색 모두 (설명 참조) 이러한 목적을 위해 사용될 수있다. 기술은 또한 더 높은 해상도에서 형광 공 초점 현미경과 호환 가능하며,.도 4b는 LifeActGFP 발현 수지상 마이그레이션 중합 액틴의 동적의 예를 도시 소기관 또는 셀룰러 구조를 추적하는 데 사용될 수있다.
세포의 정량의 예이주의 DC 분석 운동성이 그림 5에 나와있다. 그림 (a)는 WT 또는 Y27632 처리의 DC에서 생성 kymographs을 보여줍니다. Y27632 세포 수축 및 마이그레이션의 잘 특징의 억제제 및 속도의 변화를 감지하는 시스템의 능력을 확인하는 데 사용 하였다. kymographs 더욱 다른 매개 변수의 연구는 세포 이동을 설명 할 수 있도록, 위치 및 시간의 함수로서 셀의 크기를 추출하도록 분석 될 수있다.도 5b는 제 소프트웨어 (13)를 이용하여 촬상 핵 위치가 추적 이동의 속도를 나타낸다. DC가 6 μm의 / 분에 가까운 평균 속도가있다. Y27632과 치료는 크게 자신의 속도를 감소시킨다. 이 예에서는 하나의 실험에서 세포의 다수의 정량화 및 약물 치료에 의해 유도의 차이를 검출하는 시스템의 실용성을 허용하는 기술의 능력을 나타낸다. 이는 siRNA를 사용 몰 스크리닝으로 확장 될 수있다 cules 이주의 제어에 관여.
그림 1. 채널 조립의 단계. PDMS 칩은 채널 형에서 복제되었다. (A) 채널을 포함하는 칩은 금형에서 직접 추출 하였다. (B) 실험 접시 구멍에 맞게 조절 칩은 셀의 엔트리를 허용하도록 만들어졌다. (C) 칩 최종적 유리 접시 위에 붙여졌다. 장치의 (D 및 E) 도식 표현. (D)의 상위 뷰. (E) 측면보기. 녹색 객체 (파란색) 또는 채널 중 세포를 나타냅니다. 1cm 바.
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형광 기판과 채널의 그림 2. 코팅. (A) 1 시간 동안 100 ㎍ / ㎖의에서 형광 PEG와 함께 배양 5 μm의 × 5 μm의 채널. (B) 채널 PBS 세척 후 남아있는 형광 PEG의 이미지 대표. 50 ㎛ 바.
그림 3. 세포는 미세 함께 마이그레이션. 단계 5 μm의 × 5 μm의에 마이크로 채널에서 마이그레이션하는 세포의 명암 (회색) 및 핵 염색 (파란색). 채널을 따라 이주 DC가 동영상에서 추출 된 (A) 단일 이미지. (B) 몽타주 SELEC의 변위를 보여주는테드 DC 채널을 따라 이주. 흰색 화살표는 이주 세포를 나타냅니다. 시간 단위 1 IMG / 2 분. 50 ㎛ 바.
마이크로 높은 해상도 세포의 그림 4. 예. 하나의 마이크로 함께 마이그레이션 수지상의 고해상도 영상. 마이크로 채널에서 마이그레이션 DC의 위상 콘트라스트 이미지 (A) 몽타주 (1 img/20 초) (100X 배율). (B) 형광 이미징 (1 img/20 초, 60X 배율, 하나의 광학 부분)을 사용하여 시스템의 호환성을 보여주는 DC 표현 lifeact (하이라이트 굴지 중합)의 몽타주. 중합 말라가 검은 색으로 표시됩니다. 채널 크기 10 ㎛ (폭) x 5 μm의 높은. 10 ㎛ 바.
그림 5. DC가 마이크로 채널을 따라 이주의 대표 결과.이 그림은 마이크로 채널을 따라 이주 세포의 영화에서 수행 할 수있는 분석의 유형을 보여줍니다. 그림의 (a)는 시간 경과 위상 대비 WT의 이미지 나에서 마이그레이션 Y27632 처리 된 수지상에서 생성 kymographs을 보여줍니다 마이크로 채널 (10X, 1 IMG / 2 분).도 5b는 훽스트 염색 및 제 소프트웨어 (13)를 이용하여 DC 핵 추적 후의 셀 속도의 정량화의 예를 나타낸다. 데이터는 비모수 t 시험 (맨 - 휘트니 시험)를 사용하여 분석된다. 100 μm의 바.
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Discussion
여기에서 우리는 하나의 실험에서 세포의 많은 수의 철새 특성을 연구하기위한 방법으로 마이크로 구성 장치에 대해 설명합니다. 이 실험 시스템은 내생 철새 세포 조직에서 발견되는 좁은 환경의 제약을 모방. 그러나, 하나의 차원에서 이주를 강요함으로써, 자동 세포 추적 및 measurables의 추출 (그림 5)을 용이하게한다. 우리는 또한 우리의 장치는 형광 현미경과 호환되며, 따라서 세포 운동성의 다른 단계 (그림 4) 동안 세포 기관의 위치를 공부하기에 적합 할 수 있음을 보여준다.
프로토콜 내에서 중요한 단계는 채널의 품질이다. 이것은 유리 표면에 PDMS의 양호한 점착을 제어하는 것이 중요하다. 고집의 문제가 나타날 때 확인하는 최초의 것들 모두 표면의 청결과 플라즈마 청소기의 하나입니다. 중요 할 수있는 또 다른 매개 변수는 일입니다로드 세포의 전자 밀도. 자발적 이동은 튜브의 진입을 용이하게하는 채널을 셀의 근접을 요구하고, 최적의 수는 각 세포 유형에 대해 평가되어야한다.
예로서, 우리는 수지상의 자발적인 옮기는 도시했지만, 시스템은 다른 세포 유형의 마이그레이션을 분석하기 위해 사용될 수있다. 실험실에서, 우리는 기본 T 림프구, 대식 세포뿐만 아니라 종양 세포 라인 (데이터가 7-9를 표시하고 참조되지 않음)을 테스트했습니다.
채널에서 세포의 이동을 분석하기 위해, 두 가지 프로토콜 테스트되었습니다. 첫 번째는 위상차 (10X)로 영상을 필요로하고, 셀 3 (그림 5A)를 마이그레이션에서 자동 감지 및 kymographs의 생성을 기반으로합니다. 속도, 셀 크기 및 지속성, 다른 사람의 사이에서, kymographs에서 추출 할 수있는 매개 변수입니다. 이 시스템은 kymographs의 품질 및 개발에 한정를 생성하고 분석 할 수있는 소프트웨어입니다. 데이터를 정량화하는 제 쉽게 방법은 훽스트 염색 (도 3)를 사용하여 핵의 반 자동화가 추적에 기초한다. 형광의 사용은 표준 이미징 소프트웨어와 이주의 추적 및 분석을 허용한다. 이러한 전략의 예는 제 세계 셀 레이스 (12)를 위해 개발되었다.
PDMS의 표면은 사실상 모든 단백질과 흡착 될 수 있음을 감안할 때, 마이크로 채널은 세포 이동의 세포 외 기질 단백질의 영향을 평가하는데 사용될 수있다. 채널의 형상은 세포 이동의 물리적 제약에의 영향의 연구를 용이하게 변형 될 수있다.
마지막으로,이 실험 시스템은 하나의 실험에서 여러 조건을 획득하도록 구성 될 수있다. 이 함께 반 자동화가 분석, 관련 새로운 배우의 발견을위한 중간 처리량 검사와 호환암 세포의 이주에서 D.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 크게 문화원 퀴리 (CNRS UMR144)에서 PICT IBiSA 플랫폼을 인정합니다. 이 작품은에서 교부금에 의해 투자되었다 : AM.LD에 유럽 연구위원회 (Strapacemi 243103), 협회 국립 라 공들인 (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), InnaBiosanté 재단 (Micemico가) MP40으로하고 오전을 붓는다. AM.LD.에 LD 및 ERC Strapacemi 젊은 수사관 부여
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H.
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
