Studie av cellmigration i Mikrofabricerade kanaler

Summary

En kvantitativ metod för att studera spontan migration av celler i en en-dimensionell begränsas mikromiljö beskrivs. Denna metod drar fördel av mikrofabricerade kanaler och kan användas för att studera migrationen av stort antal celler under olika betingelser i enstaka experiment.

Abstract

Den metod som beskrivs här tillåter studiet av cellmigration under inneslutning i en dimension. Den är baserad på användningen av mikrotillverkade kanaler, som ställer en polariserad fenotyp till celler av fysiska begränsningar. Väl inne kanaler, celler har bara två möjligheter: flytta framåt eller bakåt. Denna förenklade migration där riktverkan är begränsad underlättar automatisk spårning av celler och utvinning av kvantitativa parametrar för att beskriva cellrörelse. Dessa parametrar inkluderar cellhastighet, riktningsförändringar, och pauser under rörelse. Mikrokanaler är också kompatibla med hjälp av fluorescerande markörer och är därför lämpliga att studera lokalisering av intracellulära organeller och strukturer under cell migration med hög upplösning. Slutligen kan ytan av kanalerna funktionaliseras med olika substrat, vilket möjliggör kontroll av de vidhäftande egenskaperna hos kanalerna eller studiet av haptotaxis. Sammanfattningsvis, systemet here beskrivas är avsett att analysera migration av stora cellantal under förhållanden i vilka både geometrin och den biokemiska naturen av miljön kontrolleras, underlätta normaliseringen och reproducerbarhet oberoende experiment.

Introduction

Migration är en komplex cellulär funktion som är viktig för många fysiologiska processer i flercelliga organismer, inklusive utveckling, immunsvar, och vävnadsregenerering. Dessutom har vissa patologiska situationer såsom tumörinvasion och metastas är beroende av cellrörlighet ^1. Av dessa skäl har cell migration blivit ett stort ämnesområde i samband med både grundläggande och translationell forskning. In vivo är de flesta vävnader kännetecknas av en rik extracellulär matrix och hög celltäthet. Cellmigration därför under fysiologiska förhållanden, förekommer i ett komplex begränsad miljö. Klassiskt, sannolikt på grund av historiska skäl och tekniska begränsningar, cellmigration har studerats i platta 2D-system som inte reproducerar många av miljöegenskaperna finns i vävnader, till exempel fångenskap. Dessutom faktorer såsom celladhesion, som är väsentliga för motilitet i 2D, har nyligen visat sig inte vara nödvändigtvisallt krävs för migration in vivo eller inuti geler, vilket tyder på att de mekanismer som styr cell locomotion i 2D och i andra miljöer är olika ^2. Flera system har utvecklats för att efterlikna de komplexa egenskaperna hos vävnader, den mest kända är kollagengeler, som syftar till att rekapitulera egenskaperna för den extracellulära matrisen sammansättningen ^3. Här föreslår vi mikrokanaler som en enkel komplementär metod som tillåter studiet cellmigration i en dimension inom en begränsad miljö.

I detta system cellerna vandrar längs mikrokanaler i vilka de kommer in spontant. Flytt celler förvärva då formen på kanalerna, anta en tubulär geometri som troligen förstärker deras polaritet. Den linjära rörelsen av cellerna i kanalerna tillåter spårning automatisk cellen och utvinning av kvantitativa parametrar från experiment. Ur teknisk synvinkel är enkelt och flexibelt detta system. Den coating kanalväggarna kan manipuleras, storleken och formen hos kanalerna kan anpassas, och ett stort antal celler kan analyseras i enstaka experiment. Detta system kan också skalas upp för att göra mediet analys intervall skärm av molekyler som är involverade i cellmotilitet. Protokollet som beskrivs här har standardiserats med hjälp av dendritiska celler (DC) som en cellulär modell. Dessa celler är nyckeln till immunsystemet som de deltar i initiering och underhåll av specifika immunsvar ^4. In vitro har DCs visats spontant vandrar i trånga miljöer och är därför en bra modell för att studera cellmotilitet i mikrokanaler ^5,6 . Viktigt kan detta system utvidgas till att analysera migration av någon annan motila celltyp såsom T-lymfocyter, neutrofiler, eller tumörceller ^7-9.

Protocol

Viktigt: Detta protokoll förutsätter att formen innehåller formen för de önskade mikrokanaler har redan gjorts. Ytterligare information om förberedelserna formen har redan publicerat ^10. Detta protokoll förutsätter också att benmärgs DCs kulturen är känd.

1. Chip Fabrication

1. Blanda PDMS olja och härdningsmedel i ett viktförhållande 10:01 i en plastkopp. Blanda båda föreningar ordentligt.
2. Lägg upp blandningen över formen lagermikrokanaler. Den totala höjden ska vara mellan 0,5-1 cm.
3. Avlägsna luftbubblor i en vakuum burk klocka under en timme.
4. Harden PDMS i formen genom att placera den senare i en ugn under 2 h vid 65 ° C.
5. När PDMS är vid rumstemperatur, skära ett stort stycke kring strukturen med ett kirurgiskt blad och dra bort den från formen (Figur 1A).
6. Borra hål där celler kommer att injiceras (typiskt 2 mm) och ändra storlek på PDMSmed ett kirurgiskt blad för att passa storleken på glasbottnade rätter där migrationen kommer att bedömas (Figur 1B). Innan du fortsätter, ta bort kvarvarande damm från skålen med hjälp av linsrengöringspapper. Detta gynnar bindningen av PDMS till glas beskrivs i steg 1.10.
7. Rengör ändra storlek PDMS-chip som innehåller de kanaler genom stickning och peeling tejp på strukturen sidorna.
8. Sonikera PDMS bitar 30 sek i 70% etanol för att ta bort damm och små PDMS partiklar. Torka dem snabbt efteråt genom att blåsa ren luft.
9. Aktivera PDMS (strukturer uppåt) och kultur rätter med luft (eller syre) plasmabehandling under 30 sekunder vid 300 mTorr.
10. Placera båda aktiverade ytorna i kontakt för att permanent hålla fast PDMS till substratet. Vid behov använder metalliska pincett för att trycka lätt på toppen av PDMS för att tvinga kontakten mellan polymeren och glas av skålen (Figur 1C).
11. Inkubera chipet i ugnen vid 65 ° C for 1 h för att stärka bindningen.

2. Beläggning av mikrokanaler

1. Aktivera hela strukturen med flyg plasma på 300 mTorr för 1 min. Detta kommer att främja inträde av vätska i kanalerna vid nästa steg.
2. Fyll snabbt inträdes hålen på chip med fibronektin på 10 mikrogram / ml i vatten. Andra substrat såsom PEG kan användas för att modifiera cellvidhäftning till kanalväggarna. Var uppmärksam att vätskan sprider sig genom hela strukturen. Detta kan enkelt kontrolleras genom ögat under regelbunden ljus eller med hjälp av en vanlig ljus fältmikroskop.
   OBS: mycket små celler, i vilka diffusion är hårdare, inträde av vätska i kanalerna kan tvingas genom att placera strukturen i en vakuum burk klocka under åtminstone 15 min. För att verifiera effektiviteten hos beläggningen fluorescerande substrat kan användas (figur 2).
3. Inkubera 1 timme vid rumstemperatur för att tillåta adsorption av fibronektin eller någon annan beläggning substhastigheten till väggarna i kanalerna.
4. Tvätta strukturerna 3x med PBS för att avlägsna nonbound underlaget.
5. Efter tvättning, fortsätt till protokoll 3 eller förvara chip vid 4 ° C under en senare användning (24 hr max).

3. Cell laddas

1. Avlägsna PBS från plattan och fylla mikrosystemet med cellmedium. Låt inkubera i 1 timme för att mätta kanalerna med mediet.
   OBS: För experiment med droger som molekylinhibitors, är det tillrådligt att preinkubera kanalerna med ett medium som innehåller läkemedlet i rätt koncentration. Vidare är vissa läkemedel tenderar att solubilisera i PDMS struktur som reducerar den effektiva koncentrationen. Vissa lösningar har föreslagits för att motverka detta problem ^11-12.
2. Avlägsna flytande DCs och återvinna halv vidhäftande celler genom spolning med odlingsmedium. Räkna celler med användning av en hemocytometer.
   OBS: För kärnan avbildning, en Hoechst 33.342 färgning kan uppnås på förhand av icubating 2 x 10 ⁶ celler under 30 min med färgämnet vid 200 ng / ml i fullständigt medium. Tvätta två gånger genom centrifugering för att avlägsna överskott av färgämne innan det fortsätter protokollet.
3. Centrifugera cellerna vid 300 x g under 5 min (tid och hastighet kan vara olika beroende på celltypen) och kassera mediet. Späd pelleten för att nå en koncentration av 20 x 10 ⁶ celler / ml.
4. Avlägsna överskottet av mediet från plattan och tömma inmatningshålen i PDMS struktur med hjälp av en mikropipett. Fyll posterna med 5 pl av cellvätskan bli en mängd av 1 x 10 ⁵ celler i varje ingångshålet.
   OBS: Högt celldensitet krävs för att gynna kontakten mellan cellerna med kanalerna. Lågt celltäthet kan resultera i lågt antal celler inuti kanaler och misslyckande av experimentet.
5. Inkubera mikrochipet under 30 min vid 37 ° C i inkubatorn. Tillsätt 2 ml komplett medium till experimentet skålen.
   OBS: Hela PDMS struktur måste be täckas för att undvika uttorkning av cellerna under experimentet. Om 2 ml räcker inte, lägga till mer medel för att helt täcka PDMS struktur.

4. Imaging

1. Rengör den yttre bottenytan av disken med linsrengörings vävnaden innan den placeras plattorna i mikroskop.
2. För att analysera migration i stort antal celler, använder 10X förstoring och brett fält belysning i en CO ₂ och temperatur utrustad video-mikroskop (Figur 3). För att underlätta spårning cell, kan Hoechst färgning och UV-ljus användas (se steg 3.2). Migration kan vara också analyseras med hjälp av konfokalmikroskopi för att få högre upplösning av cellstrukturer under flyttningen.
3. För tidsförlopp mikroskopi vid 10X, välj en tidsfrekvens enligt den förväntade cellhastigheten (vanligtvis 2 min för dendritiska celler som migrerar med en hastighet på 5 ìm / min).
   Anmärkning: Protokollet som beskrivs här gör not inkluderar en analys av cellmigrations parametrar. Några punkter listas i diskussionen för att ge råd till läsarna om hur man ska gå för att extrahera information från time-lapse filmer.

Representative Results

I varje experiment på ytan av PDMS är belagd med en molekyl som anpassas till det intresse av studien. Figur 2 visar kanaler belagda med en fluorescerande molekyl, PLL-g-PEG, före och efter tvättning (steg 2.4). Ett sådant experiment tillåter kontroll av homogeniteten hos beläggningen i kanalerna.

Efter cellbelastning kan videomikroskopi utföras för att följa cellmigration. Figur 3A visar ett exempel på DC migrerar i mikrokanaler vid en densitet lämplig för att spåra celler. Både, faskontrast och Hoechst-färgning kan användas för detta ändamål (se Diskussion). Tekniken är även kompatibel med fluorescerande konfokalmikroskopi med högre upplösning, och kan användas för att spåra organeller eller cellulära strukturer. Figur 4B visar ett exempel på den dynamiska polymeriserad aktin i migrerar DCs exprimerar LifeActGFP.

Ett exempel på kvantifiering av cellmotilitet analyseras i migrerar DCs visas i figur 5. Figur 5A visar kymographs genererade från WT eller Y27632 behandlade DCs. Y27632 är en väl karakteriseras hämmare av cell kontraktilitet och migration, och användes för att verifiera systemets förmåga att upptäcka förändringar i hastighet. De kymographs kan analyseras vidare för att utvinna position och storlek på celler som en funktion av tiden, vilket gör att studier av olika parametrar för att beskriva cellmigration. Figur 5B visar hastigheten för migration spåras av avbildning kärnan positionering med hjälp av en hemmagjord mjukvara ^13. DCs har en genomsnittlig hastighet nära till 6 ^ m / min. Behandling med Y27632 signifikant minskar sin hastighet. Detta exempel visar effekten av den teknik, som möjliggör kvantifiering av stort antal celler i enstaka experiment och användbarheten av systemet för att detektera skillnader som framkallas av drogbehandlingar. Detta kan utökas till användningen av siRNA och screening av mullvad molekyler involverade i kontrollen av migration.

Figur 1. Stegen i kanaler montering. PDMS chip speglades från en kanal mögel. (A) Den chip som innehåller de kanaler extraherades direkt från formen. (B) Chipet ändras för att passa den experimentella skålen och ett hål gjordes för att möjliggöra inträde av cellerna. (C) Chipet slutligen klistras ovanpå glasskål. (D och E) Schematisk representation av anordningen. (D) Ovanifrån. (E) från sidan. Gröna föremål representerar celler i eller ut kanaler (blå). Bar 1 cm.

es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
Figur 2. Beläggning av kanaler med ett fluorescerande substrat. (A) 5 ^ m x 5 | am kanaler som inkuberats med fluorescerande PEG vid 100 | ig / ml under 1 timme. (B) Bild representativ av resterande fluorescerande PEG efter PBS-tvättning av kanalerna. Bar 50 pm.

Figur 3. Celler migrerar längs mikrokanaler. Faskontrast (grå) och nukleär färgning (blå) av celler som migrerar i 5 ìm x 5 ìm mikrofabricerade kanaler. (A) En bild som utvinns ur en film av DCs migrera längs kanalerna. (B) Montage som visar förskjutningen av ett urvalted DC migrera längs kanalerna. Vita pilar indikerar migrerande celler. Tidsskalan en img / 2 min. Bar 50 pm.

Figur 4. Exempel på högupplösta celler i mikrokanaler. Högupplöst avbildning av DCs migrera längs enskilda mikrokanaler. (A) Montage av fas kontrastrika bilder (1 img/20 sek) i en DC migrera i en mikro (100 gångers förstoring). (B) Montage av en DC uttrycker lifeact (högdagrar polymeriserad aktin) visar kompatibilitet av systemet med fluorescens avbildning (1 img/20 sek, 60X förstoring, enda optisk avsnitt). Polymeriserad aktin visas i svart. Kanal storlek 10 ^ m bred x 5 ^ m hög. Bar 10 um.

Figur 5. Representativa resultat av DCs migrera längs mikrokanaler. Denna figur illustrerar den typ av analys som kan göras från filmer av celler som migrerar längs mikrokanaler. Figur 5A visar kymographs genererade från tidsförlopp faskontrast bilder av WT eller Y27632 behandlade DCs migrerar in mikrokanaler (10X, 1 img / 2 min). Figur 5B visar ett exempel på kvantifiering av cellhastighet erhålls efter spårning DC kärnan med hjälp av Hoechst färgning och en hemmagjord mjukvara ^13. Data analyseras med användning av en icke-parametrisk t-test (Mann-Whitney-test). Bar 100 nm.

Discussion

Här beskriver vi en enhet som består av mikrokanaler som en metod för att studera den flyttande egenskaperna hos ett stort antal celler i enskilda experiment. Detta experimentella system efterliknar de begränsade miljöbegränsningar som finns i vävnader genom endogena vandrande celler. Emellertid, genom att tvinga migration i en enda dimension, det underlättar automatisk spårning cell och utvinning av measurables (Figur 5). Vi visar också att vår enhet är kompatibel med fluorescensmikroskopi och kan därför anpassas för att studera organell positionering under de olika faserna av cellrörlighet (Figur 4).

Ett kritiskt steg i protokollet är kvaliteten av kanalerna. Det är viktigt att styra den goda klibbning av PDMS på glasytan. När oroligheterna i fastnar visas de första saker att kontrollera är städningen av båda ytorna och en av plasma renare. En annan parameter som kan vara avgörande är the densitet laddade celler. Den spontana migrationen kräver närhet av cellerna till kanalerna för att underlätta inträde i rören, och det optimala antalet bör bedömas för varje celltyp.

Som ett exempel har vi visat den spontana migrationen av DC: er, men systemet kan användas för att analysera migration av andra celltyper. I laboratoriet har vi testat primära T-lymfocyter, makrofager liksom tumörcellinjer (data visas inte och referenser ^7-9).

För att analysera cellmigration i kanalerna, har två huvudsakliga protokoll testats. Den första kräver avbildning med faskontrast (10X), och är baserad på den automatiska detekteringen och generering av kymographs från migrerande celler ³ (figur 5A). Hastighet, cellstorlek och uthållighet är bland andra parametrar som kan extraheras från kymographs. Detta system begränsas av kvaliteten på de kymographs och till utvecklingen avprogramvaran för att generera och analysera dem. Ett andra och enklare sätt att kvantifiera uppgifterna bygger på semi-automatiserade spårning av kärnan med hjälp av Hoechst färgning (Figur 3). Användningen av fluorescens möjliggör spårning och analys av migration med standard bildprogram. Ett exempel på en sådan strategi har tagits fram för den första världscellen lopp ^12.

Med tanke på att ytan av PDMS kan absorberas med praktiskt taget alla proteiner, kan mikrokanaler kan användas för att utvärdera effekterna av extracellulära matrixproteiner i cellmigration. Geometrin av kanalerna kan också modifieras, underlätta studier av effekterna av fysiska hållande i cellmigration.

Slutligen kan detta experimentella systemet anpassas för att förvärva flera villkor i enskilda experiment. Detta, tillsammans med en semi-automatiserade analyser, är kompatibel med medelgenomströmnings visningar för upptäckten av nya aktörer innebärd i migrationen av cancerceller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254