Her illustrerer vi protokollen for billeddannelse med tofarvede STED Nanoscopy den cytotoksiske immun synapse af NK-celler sammenfattet på glas. Ved hjælp af denne metode, vi får sub-100 nm opløsning på synapse proteiner og cytoskelettet.
Naturlige dræberceller danner stramt reguleret, fintunet immunologiske synapser (IS) for at lysere virusinficerede eller tumorigene celler. Dynamisk aktin reorganisering er afgørende for funktionen af NK-celler og dannelsen af IS. Billeddannelse af F-aktin i synapsen har traditionelt anvendt konfokal mikroskopi, men diffraktion grænsen af lys begrænser beslutning af fluorescensmikroskopi, herunder konfokal til ca 200 nm. Nylige fremskridt inden for imaging-teknologi har muliggjort udviklingen af subdiffraction begrænset super-opløsning billeddannelse. For at visualisere F-actin arkitektur på IS rekapitulere vi NK-celle cytotoksisk synapse ved at overholde NK-celler til at aktivere receptoren på glas. Vi derefter billedet proteiner af interesse ved hjælp af to-farve stimuleret emission udtynding mikroskopi (STED). Dette resulterer i <80 nm opløsning på synapser. Heri beskrives de trin i prøveforberedelse og erhvervelse af billeder ved hjælp af dobbelt coleller STED Nanoscopy at visualisere F-actin på NK IS. Vi illustrerer også optimering af indsamling af prøven ved hjælp af Leica SP8 software og tid-gated STED. Endelig udnytter vi Huygens software til efterbehandling deconvolution billeder.
Den immunologiske synapse er et komplekst miljø af signalproteiner og cytoskeletale elementer. Den cytolytiske synapse blev oprindeligt beskrevet som havende en "bulls-eye"-lignende struktur med en ring af actin og adhæsionsmolekyler omkring en central sekretorisk domæne 1-4. Men vi ved nu, at den består af mikroskopiske domæner af aktiv signalering, der kræver kontinuerlig dynamisk cytoskeletal reorganisering for funktion 5-11. Meget af den information, som vi nu har om synapse er afledt af mikroskopi, og immunologer har været early adopters af cutting-edge imaging-teknologi.
En sådan ny teknologi er super opløsning mikroskopi. Konventionel lysmikroskopi rumligt begrænset af diffraktion barriere af lys, som sætter den nedre grænse for opløsning for alle fluorescensmikroskopi herunder konfokal på cirka 200 nm. I de seneste år har adskillige teknikker været developed, der tillader opløsning under diffraktion barriere. Disse omfatter stimulation emission udtynding mikroskopi (STED), struktureret belysning mikroskopi (SIM), stokastisk løst mikroskopi (STORM), og fotoaktiverbart lysmikroskopi (PALM). Disse teknikker er blevet revideret i detaljer andetsteds 12-15, men er skitseret nedenfor. Subdiffraction begrænset opløsning genereres i unikke måder i hvert system. Udvælgelsen af en super-opløsning teknik bør derfor være dikteret af eksperimentet og eksperimentelle system af interesse.
STED super opløsning opnås ved hjælp af en høj intensitet torroidal udtømning stråle, der selektivt "tavshed" fluorescens omkring hver fluorfor af interesse efter excitation, hvilket resulterer i subdiffraction begrænset fluorescensmikroskopi 16-18. En fordel ved STED er, at billedet erhvervelse er hurtig og kræver forholdsvis lidt efterbehandling. Mens farvestof udvælgelse er dikteret af spectral position udtømning bjælke, som i det kommercielt tilgængelige system er beliggende ved 592 nm, er flere kommercielt tilgængelige farvestoffer rådighed, der gør kombinationer af to fluorophorer muligt. Endvidere kan almindeligt anvendte fluorescerende reportere såsom GFP skal afbildes, hvilket gør levende celle eksperimenter muligt 19,20.
Vi har tidligere brugt STED at identificere og kvantificere regioner af F-actin hypodensity der er udnyttet af NK-celler til degranulering 21,22. Vi foreslår, at STED er et godt valg til afbildning af immune synapse på grund af sin relativt fleksibelt tilgængelighed af fluoroforer og overlegen forbedring i opløsning i xy akse. Desuden, på kommercielt tilgængelige STED benyttet til disse forsøg, anvendelse af en high-speed (12.000 Hz) resonans scanner tillader hurtig erhvervelse af billeder med minimal skade på prøver. Begrænset fleksibilitet i farve valg betragtes som en ulempe STED 12,dog dobbelt farve STED er forholdsvis ligetil med flere kommercielt tilgængelige fluorophores. Integrationen af STED med en laser konfokal mikroskop giver også mulighed for yderligere konfokal billeddannelse i kombination med STED, så mens STED er begrænset til to kanaler, kan yderligere strukturer filmede i konfokal med opløsning på ca 200 nm (E. Mace, upublicerede observationer ). Mens vi beskriver anvendelsen af STED til billeddannelse af immunceller, er denne teknologi anvendes til en række celletyper, herunder neurale celler og til visualisering af en bred vifte af cellestrukturer 23-26.
SIM anvender en anden tilgang til at generere subdiffraction begrænset billeder. Ved at visualisere kendte periodiske excitation mønstre kan information derefter opnås om den ukendte struktur blive undersøgt efter matematisk transformation 27. Dette giver en stigning i beslutning til ~ 100 nm sideværts 28,29. Fordelen ved SIM-kort er, at det is kompatibel med alle standard konfokal farvestoffer og sonder, men ulempen er, at det er meget langsommere til at hente billeder og disse kræver langvarig efterbehandling 12. Dette begrænser også dets anvendelse til levende celler.
Endelig kan billederne super-opløsning genereres ved stokastisk foto-kobling af fluorophores. Denne tilgang er udnyttet i foto-aktiverede lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM). Ved at scanne flere kamera rammer og lokalisere tilfældigt aktiverede molekyler, der er slået "til" og "off" over tid, er billeder med 20-30 nm opløsning genereres fra akkumulerede rammer 30-32. Det trade-off for denne beslutning er den tid, der kræves for at hente billeder.
Her viser vi, i detaljer, protokollen for at forberede og billeddannelse dual farveprøver i STED. I dette system eksitation med en pulserende, afstemmelige, hvidt lys laser. På grund af karakterenaf det pulserende exciteringsstrålen er tid gating for afsløring muliggjort og yderligere stigninger opløsning. Desuden er systemet udstyret med gadolinium hybrid (hydr) detektorer, som er mere følsomme end konventionelle lysforstærkningsrør, således at lavere laser strømkrav. Nedbrydningen stråle til STED anvendes løbende og er tunet til 592 nm, hvilket vil diktere valget af farvestoffer til rådighed for to farver STED. Almindeligt anvendte farvestof kombinationer generelt omfatter en overgearet ved 488 nm (f.eks Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grøn eller Chromeo 488) og en overgearet ved 458 nm (såsom Pacific Orange eller Horizon V500). Medens påvisning af de to farvestoffer vil være i en række lignende (og begge er tilgængelige ved nedbrydningen laser), vil excitation forekomme med forskellige bølgelængder. Med et justerbart hvidt lys laser og justerbare detektorer, der maksimere signal, mens fjerne spektral overlapning lavet ret nemt. Som sådan har vi haft god succes med kombinioner af kommercielt tilgængelige farvestoffer, såsom Pacific Orange og Alexa Fluor 488 (her anvendt). Vores protokol er skræddersyet til og beskriver evalueringen af humane NK-celler som repræsenterer historiske fokus for vores laboratorium. Vi er specielt udnytte NK92 cellelinje i dette eksempel, da det er en vi har regelmæssigt anvendt i vores eksperimentelle arbejde 21,33.
Forbedringen i opløsning i løbet af konfokal vil være noget afhængig af faktorer, som ikke kan kontrolleres. Disse faktorer omfatter mindre afvigelser i dækglas tykkelse og uoverensstemmelser i montering medier. Det er vigtigt at holde temperaturen og luftfugtigheden i imaging rum så konsekvent som muligt, og det place stråle skal udrettet cirka hver 60 min. Som nævnt i Procedures, skal brug af Vectashield montage medium undgås, da det ikke er foreneligt med STED. Ud over at der, bør man altid bruge # 1.5 dækglas, og hvis den er tilgængelig, kan du bruge dem, der er blevet verificeret til en bestemt tykkelse.
En ændring af den fremgangsmåde, der beskrives her, er at billedet yderligere kanaler i konfokal, ved hjælp fluorophores der udleder ved en længere bølgelængde end place stråle. På denne måde kan man billede op til fire kanaler (to i konfokal, to i STED). Hvis du tager denne fremgangsmåde er imidlertid de kanaler med fluoroforer eenhed overfører over STED udtømning laser skal blive afbildet først, da anvendelsen af place stråle vil nedbryder fotoner i disse kanaler. En fordel til denne teknik er anvendelse af tid gating, som også vil forbedre opløsning i konfokal ved at eliminere emission fra fotoner med korte levetider 34. Især vil anvendelse af tid gating, timingen af emissions-detektorer til at korrespondere med pulserende excitation STED, mindske baggrundsfluorescens fra refleksion fra dækglas glas når billeddannelse tæt på den. Selv i et eksperiment ikke er egnet til STED, hvis du bruger en pulserende excitation kilde, kan tid gating være et nyttigt redskab til at forbedre opløsning i konfokal.
Der er forskellige ændringer, der kan udnyttes til at forbedre opløsningen i STED. Den ene er at formindske størrelsen af knappenålshullet fra standard 1 Airy enhed, selv om dette også vil reducere mængden af lys, der når prøven. Dette kan der kompenseres for ved at øge lasis magt eller gevinst. En anden er at øge linje gennemsnit, hvilket vil øge mængden af oplysninger, der indsamles for hver foton, forbedre opløsning. Igen, dette kan dog være på bekostning af fotoblegning af prøven, så en balance vil være nødvendigt at balance mellem opløsning og blegning. Ligeledes vil anvendelsen af fluorescerende proteiner, såsom GFP kræver omhyggelig optimering for at undgå blegning. Dette kan opnås ved om nødvendigt faldende STED lasereffekt. Længere tidspunkter vil også give mulighed for større foton nyttiggørelse og reducere blegning. Korrektion for fotoblegning skal der redegøres for, når man analyserer levende STED.
Selvfølgelig, billedbehandling i 3 dimensioner i STED er også muligt, og det vil også give en forbedring i forhold til konventionelle konfokal billeddannelse. Dette er især tilfældet, hvis det sker i kombination med deconvolution, selv om der bør udvises forsigtighed for at korrigere for afdrift, der opstår under billeddannelse af flere planer i z-aksen. Hvis du bruger Huygens-softwareat deconvolve er denne korrektion opnås ved hjælp af "stabilisere billedet" funktionen. Med denne fremgangsmåde vil opløsning i z-aksen skal forbedres. Dette er en stor forbedring i forhold til konventionel konfokal billedbehandling, der har dårlig aksial opløsning, og selv i løbet af blot børsnoterede selv, som også har en relativt dårlig z-akse opløsning. Mens erhverve flere stakke i STED, skal der drages omsorg for at undgå blegning af prøven, og om nødvendigt kan man reducere linje gennemsnitsberegning eller laser magt intensitet for at gøre det. Igen skal det bemærkes, at hvis billeddannelse andre fluorophores, der ikke er egnet til STED, at anvendelsen af nedbrydningen bjælke i første sekventiel scanning forhindre emission fra disse kanaler. Derfor er en blandet STED / konfokal tilgang (ved brug af konfokal scanning i kanaler, der udsender ved en bølgelængde på mere end 592 nm) vil desværre ikke være egnet til 3D.
For at opsummere, har vi valgt STED som en tilgang på grund af sin relativt let application og forbedring i opløsning i forhold til standard konfokal billeddannelse. Til billeddannelse immun synapse, har det vist en effektiv og værdifuld teknik, der giver os mulighed for at se detaljer i F-actin arkitektur ikke muligt på opløsning over 200 nm. Mens mange af disse detaljer synes subtile, kan de få en dybtgående indvirkning på NK-celle funktion. Således anvender vi den nyeste nanoskopiske imaging-teknologi til tilvejebringelse af oplysninger, der er afgørende for at opretholde menneskers sundhed.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Geoff Daniels for teknisk assistance. Dette arbejde blev finansieret af R01 AI067946 til JSO
#1.5 cover slips | VWR | 48393-172 | |
BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554722 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
Cotton tipped applicator | Fisher Scientific | S450941 | |
Falcon centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 352070 | |
Fetal calf serum (FCS) (500 mL) | Atlantic Biologicals | S11050 | |
Goat anti-rabbit Pacific Orange | Life Technologies | P31584 | |
Laboratory tissue wipers | VWR | 82003-820 | |
Nail polish | VWR | 100491-940 | |
NK-92 cells | ATCC | CRL-2407 | |
Phalloidin Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A12379 | |
Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14190250 | |
Prolong anti-fade reagent | Life Technologies | P7481 | |
Purified anti-CD18 | Biolegend | 301202 | |
Purified anti-NKp30 | Biolegend | 325202 | |
Purified anti-perforin | Biolegend | 308102 | |
RPMI 1640 medium (500 mL) | Life Technologies | 11875-093 | |
Saponin from Quillaja bark | Sigma | S4521 | |
Super PAP pen | Life Technologies | 008899 | |
Triton X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22142 | |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Huygens deconvolution software | SVI | Contact company | |
Leica SP8 TCS STED microscope | Leica Microsystems | Contact company |